猪瘟石门系强毒株SYBR Green-Ⅰ染料法实时荧光定量PCR方法的建立

为了能快速、准确地诊断猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)石门系强毒,根据登录在GenBank上23株Shimen毒株的全基因组序列,利用DNASIS软件进行序列分析,设计1对特异的荧光定量引物。建立猪瘟石门系强毒株SYBR Green-Ⅰ染料法实时荧光定量PCR快速检测方法。试验结果表明,本方法最低可检测到的Shimen病毒cDNA含量为100拷贝/μL,敏感度至少是普通PCR的100倍;猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、牛流行腹泻病毒Ⅰ型(BVDV-1)和猪瘟病毒C株均无特异性扩增,证明本方法具有很强的特异性;通过批内和批间重复试验,其变异系数<0.7%,结果显示本方法具有很好的重复性。本研究建立了猪瘟石门系强毒株SYBR Green-Ⅰ染料法实时荧光定量PCR快速检测方法,为猪瘟的预防与控制提供了有效的技术手段,并为猪瘟强毒试剂盒的研发奠定了基础。

荧光定量PCR染料法检测强直性脊柱炎患者HLA-B27基因及分型

目的探讨荧光定量PCR染料法检测强直性脊柱炎(AS)患者人类白细胞抗原B27(HLA-B27)基因及亚型的临床应用价值。方法收集2014年1月至2015年3月深圳市福田区风湿病专科医院已确诊的强直性脊柱炎患者血液标本43例和体检健康者血液标本56例,采用流式细胞法检测HLA-B27基因,同时采用荧光定量PCR染料法检测HLA-B27基因及分型。结果流式细胞法检测43例AS患者中40例阳性(93.02%),荧光定量PCR染料法检测39例阳性(90.70%),两者符合率为97.50%。39例HLA-B27者中B2704亚型者有32例(82.05%),B2705亚型者有7例(17.95%)。结论荧光定量PCR染料法检测HLAB27基因准确率高,与流式细胞法有高度一致性,同时还能检测HLA-B27基因亚型,具有很好的临床推广价值和应用前景。

血清学方法联合SSP荧光PCR染料法在ABO疑难血型鉴定中的应用

探讨血清学方法结合SSP荧光PCR染料法在临床上进行鉴定ABO疑难血型的可行性与应用价值。方法 本研究收集本院4例正反定型不符血液标本,选用PCR-SSP方法对血型基因的分型进行检测的同时,对血型抗原的检测采取血清学方法。结合上述两种方法,从而来制定输血策略。结果 4例标本中,通过血清学方法鉴定结果,A型1例,B型1例,O型1例,无法定型1例,基因型分别为AO、AO、BO、OO。结论 SSP荧光PCR染料法比血清学方法更可靠,并且可以为这些患者提供更相容的输血血液单位。

染料法荧光PCR鉴别卵形疟原虫curtisi和wallikeri亚种

目的建立染料法荧光PCR快速鉴别卵形疟原虫curtisi和wallikeri亚种。方法比对卵形疟原虫curtisi和wallikeri亚种的网织红细胞结合蛋白2(porbp2)基因,设计特异性引物,建立扩增卵形疟原虫curtisi和wallikeri亚种的染料法荧光PCR方法,进行熔解曲线分析,测定各亚种扩增产物的熔解温度,进行特异性、重复性和准确性评价。结果熔解曲线分析结果显示,建立的方法扩增卵形疟原虫curtisi和wallikeri亚种的熔解温度相差明显,curtisi亚种为74.2℃,wallikeri亚种为75.7℃。该方法虽可检测到其他3种疟原虫,但敏感度较低,卵形疟与其他3种疟原虫的熔解温度差别明显。重复性实验表明,该方法扩增卵形疟原虫curtisi和wallikeri亚种熔解温度变异系数均低于1%,重复性良好。对27份卵形疟原虫阳性样本的检测结果与巢式PCR分型结果完全一致。结论建立的染料法荧光PCR方法可快速对两种亚型卵形疟原虫进行鉴别。

荧光定量PCR染料法在HLA-B*5801等位基因检测中的性能评价及应用

目的:通过检测评估荧光定量聚合酶链反应(PCR)染料法对人类白细胞抗原B位点5801(HLA-B*5801)等位基因的准确性、灵敏度及其在干扰因素下的结果分析研究,同时与PCR-SBT测序法进行对比。方法:收集45例痛风、高尿酸血症患者和20例正常人群样本,利用HLA-B*5801等位基因检测试剂盒进行检测,同时利用测序法对HLA-B等位基因高度突变的2/3/4外显子正反测序。灵敏度验证研究,随机选取1例阳性样本,按照HLA-B*5801等位基因检测试剂盒说明书要求稀释至最低浓度,检测结果与测序结果对比;抗干扰能力验证研究,随机选取3例阳性样本,加入规定要求的胆红素、脂质、阿司匹林作为干扰因素,利用PCR染料法检测,检测结果与测序结果对比。结果:45例痛风、高尿酸患者中有8例HLA-B*5801基因阳性,阳性率为17.8%;20例正常人群则有1例携带HLA-B*5801基因,阳性率5%。最低浓度样本也可正确检出结果,PCR染料法的准确性、灵敏性、特异性均为100%;3例阳性患者在胆红素、脂质等干扰物质影响下仍可正常检出,抗干扰能力良好。结论:PCR染料法可正确检测HLA-B*5801基因,灵敏度较好且在干扰物质存在的状况下结果不受影响,与测序结果一致,且操作更快捷方便。