EIF4A3 shRNA慢病毒载体的构建及其稳定转染细胞系的建立

目的:构建真核细胞翻译起始因子4A3(EIF4A3)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体,建立Neuro-2a-EIF4A3-shRNA稳定转染细胞系。方法:通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库检索EIF4A3基因序列,设计并合成PCR鉴定引物,并将其连接至经EcoRⅠ和AgeⅠ酶切的慢病毒GV493载体,构建GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒质粒,PCR筛选阳性克隆并测序鉴定。将GV493空载质粒和GV493-EIF4A3-shRNA重组质粒分别转染至HEK293T细胞中,分别为GV493对照慢病毒和GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒,转染48 h后收集慢病毒进行包装并测定病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为空白组、GV493对照组和GV493-EIF4A3 shRNA组,空白组不作处理,GV493对照组和GV493-EIF4A3 shRNA组分别采用相应慢病毒感染Neuro-2a细胞,慢病毒感染复数(MOI)为100,使用10 mg·L-1嘌呤霉素筛选成功感染慢病毒的Neuro-2a细胞,荧光显微镜观察各组Neuro-2a细胞的生长状态和绿色荧光表达情况;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测各组Neuro-2a细胞中EIF4A3 mRNA及蛋白表达水平。结果:PCR测序结果显示GV493-EIF4A3-shRNA重组质粒基因序列与设计合成的EIF4A3-shRNA序列一致,成功构建GV493-EIF4A3慢病毒载体。荧光显微镜观察可见HEK293T细胞荧光表达强烈,生长状态良好,慢病毒包装成功。GV493-对照慢病毒和GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒的滴度均为2×10~8 TU·mL^(-1),GV493对照组和GV493-EIF4A3 shRNA组Neuro-2a细胞生长状态良好且表达绿色荧光,表明慢病毒感染稳定细胞系构建成功。RT-qPCR法,与空白组和GV493对照组比较,GV493-EIF4A3shRNA组Neuro-2a细胞EIF4A3mRNA表达水平明显降低(P<0.01)。Western blotting法,各组在相对分子质量49000处出现特异性条带,提示Neuro-2a细胞中EIF4A3蛋白表达成功;与空白组和GV493对照组比较,GV493-EIF4A3 shRNA组Neuro-2a细胞中EIF4A3蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。结论:成功构建GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒载体,建立了Neuro-2a-EIF4A3-shRNA稳定转染细胞系,为EIF4A3在颅内动脉粥样硬化的作用机制研究提供了参考。

心房肽cDNA转染细胞微囊化及心房肽近日节律性表达

目的探讨心房肽 (ANP)cDNA转染细胞的微囊化技术 ,测定其ANP的表达水平 ,以及研究ANP分泌的近日节律 ;通过人工调控 ,改变ANP分泌的近日节律 ,达到有效治疗高血压或心衰的目的。方法将人ANP基因 (cDNA)转染入CHO细胞 ,然后将细胞包被在聚己内酯 (PCL)管内形成微囊 ,并检测转基因CHO细胞长时间存活情况和分泌的ANP。检测微囊化转基因细胞分泌ANP的生物节律 ,并用褪黑素(melatonin)进行调整。结果在培养期间 ,长度 2 0mm直径 3mm的PCL管内转染CHO细胞在 2ml培养基中分泌的ANP水平可达 2 4 6.1pg/ml/2 4h ;ANP的分泌呈近日节律性变化 ,夜间高 ,而日间低 ;近日节律变化的时相是 4∶1 8,用melatonin处理 ,近日节律的时相移至 7∶5 6。结论ANPcDNA转染的CHO细胞包被在PCL管内并能向管外分泌ANP ,将来可能适于植入人体。

豌豆根瘤发育中侵染细胞核的超微结构变化

用透射电镜研究了豌豆根瘤发育中侵染细胞核的超微结构变化。早期发育的侵染细胞核较大 ,近似圆形或椭圆形 ,核膜开始内陷。随着细胞的发育 ,细胞核变小 ,形状趋向扁平 ,核膜内陷增加 ,逐渐出现浓的染色质。在细胞衰老后 ,细胞核再度减小 ,核膜内陷加剧 ,浓的染色质增多。在早期的解体细胞中 ,虽然细胞质、细胞器和类菌体已经消失 ,但细胞核仍然清晰可见 ,只是浓的染色质进一步增多 ,常常位于核膜附近和核膜上。还讨论了侵染细胞核超微结构的特征和对细胞衰老的稳定性。

豌豆根瘤侵染细胞发育中造粉体的研究

透射电镜研究表明 ,在豌豆根瘤侵染细胞发育过程中 ,造粉体的形态结构处在变化之中。在发育早期 ,造粉体较多 ,分布在细胞壁附近。它的基质很少 ,多含有呈长梭形的、电子密度非常低的淀粉粒 ,并有一些电子密度较高的条带结构。随着细胞的发育 ,造粉体逐渐移至胞间隙周围 ,不断变小 ,切面近似椭圆形或圆形。进一步发育时 ,造粉体中的淀粉粒越来越小 ,几乎都近似椭圆形或圆形。与此相反 ,造粉体基质明显增多 ,常含一些嗜锇颗粒 ,有时还有一种特殊的泡状结构。在衰老细胞中 ,造粉体很少 ,但不含淀粉粒的质体经常可见 ,在造粉体附近常有较多的线粒体和内质网。还讨论了豌豆根瘤侵染细胞中造粉体的变化规律及其与细胞发育和固氮的关系。

红豆草根瘤侵染细胞中液泡内含物的超微结构特征

用透射电镜研究了红豆草(Onobrychisviciifolia)根瘤侵染细胞中液泡内含物的超微结构特征.结果表明,早期发育侵染细胞的液泡中只含有少量的纤维状物质.随着细胞的发育,液泡不断变大,液泡中的纤维状物质和膜状物质越来越多.在中央液泡形成后,液泡中的纤维状物质逐渐减少,类细胞质、泡状和膜状物质明显增多,它们常由一层来自液泡膜的膜包围,其形状一般近似圆形或椭圆形.液泡内含物的大量出现可能与红豆草及其根瘤具有高度的抗旱性有关.

基因表达谱芯片技术筛选TAHCCP1转染细胞差异表达基因

目的:应用基因芯片技术,检测丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白反式激活基因TAHCCP1的表达对肝母细胞瘤细胞系HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明TAHCCP1在肝细胞中上调或下调的基因,探索其可能的调节功能. 方法:设计并合成TAHCCP1基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增TAHCCP1基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的TAHCCP1编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-TAHCCP1,转染肝母细胞瘤细胞系HepG2 细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA,逆转录为cDNA,应用基因表达谱芯片技术对两组间差异表达mRNA进行检测和分析. 结果:在筛选的1 152点cDNA芯片中,有110种基因的表达水平上调(占9.55%),98种基因的表达水平下调(8.51%),包括一些与体内免疫调节、脂类代谢、蛋白质的翻译合成、氧化反应、细胞凋亡及细胞内的信号传导方面的基因. 结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了TAHCCP1转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明TAHCCP1蛋白可能的生物学功能提供依据.

侵染细胞中一种内含物的组化研究

在大豆根瘤中有一种非常特殊的细胞质内含物,只存在于侵染细胞中,一个细胞通常只有一个,一般位于细胞的外周部分,常常靠近胞间隙。这种内含物通常为圆形,其直径在1—2μm之间,主要由颗粒状物质、管状和泡状成分组成。它经甲苯胺蓝O染色后呈深蓝色,苏丹黑B染色后呈深黑色,考马斯蓝染色后呈蓝色,因此它不是类聚核糖核蛋白体,也不是一般的蛋白体和脂滴或脂质体,而可能是一种蛋白质和脂的复合物。其作用可能与共生固氮中的能量转换和供应有关。

人Blys转染细胞对B细胞功能的影响

利用RT-PCR方法从经IFN-γ激发的正常人外周血单核细胞总RNA中扩增出全长BlyscDNA,继而将BlyscDNA插入真核表达载体逆转录病毒载体pSIV1中。以脂质体转染法将重组逆转录病毒载体与两个辅病毒载体共转染包装细胞293T,将含完整病毒颗粒的上清转染小鼠成纤维细胞L929,经G418筛选获得稳定表达Blys分子的L929细胞;RT-PCR和流式细胞术检测证实Blys分子在L929的稳定和高水平表达。继而以该转染细胞与PWM驱动的人扁桃体B细胞共培养,体外实验表明Blys介导的共刺激信号能促进该培养体系B淋巴细胞增殖,与抗μ抗体信号协同能刺激B细胞分泌IgG。

应用基因表达谱芯片技术筛选NS3TP1转染细胞差异表达基因

目的:应用基因芯片技术,检测丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式激活基因1(NS3TP1)的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步NS3TP1蛋白可能的分子生物学功能. 方法:设计并合成NS3TP1基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS3TP1蛋白编码基因片段, 以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1(-)- NS3TP1.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较. 结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误,提取高质量的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1 152个基因表达谱的筛选中,发现有26个基因表达水平显著上调,14个基因表达水平显著下调. 结论:应用基因表达谱芯片技术成功筛选了NS3TP1转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明NS3TP1蛋白可能的生物学功能及HCV的致病机制提供理论依据.

t-PA突变体山羊乳腺表达载体构建及转染细胞的核移植试验

构建了t-PA突变体山羊乳腺特异表达载体pGBCt-PAm,包括长4.1kb的山羊β-酪蛋白启动子以及启动子前2.4kb的鸡β-珠蛋白绝缘子序列;并检测了表达载体在家兔乳腺的瞬间表达,验证了载体的有效性。通过电击和脂质体2种转染方式转染了山羊胎儿成纤维细胞(GFFC),经过筛选检测,得到了7株能大量扩增的PCR阳性细胞株。其中的2株(M9,M10)已经进行了首次细胞核移植和胚胎移植试验,2只受体羊2个情期未见返情。

基因表达谱芯片筛选NS5ATP3转染细胞差异表达基因

目的:应用基因芯片技术.检测丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活基因NS5ATP3的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响.进一步阐明NS5ATP3蛋白可能的分子生物学功能.方法:没计并合成NS5ATP3基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS5ATP3蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的NS5ATP3编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDN.A3.1(-)-NS5ATP3.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1152个基因表达谱的筛选中,发现有6个基因表达水平显著上调,18个基因表达水平显著下调.结论:应用基因表达谱芯片技术成功筛选了NS5ATP3转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明NS5ATP3蛋白可能的生物学功能提供依据.

微波辐射对小鼠精子畸形率及骨髓嗜多染细胞微核检出率的影响

小鼠分别用20,30,40 mW/cm^2微波照射,结果发现照射后d 4,10,30,精子畸形率与对照组比有显著差异(p<0.05,P<0.01);d 30则三个剂量组均呈很显著差异(p<0.01)。48 h后骨髓嗜多染细胞微核检出率与对照组比有显著差异(p<0.05),96 h后则无显著差异。可以认为微波对小鼠体细胞和生殖细胞有致突变作用,且对生殖细胞影响更明显;精子畸形以胖头样为主;但微核无累加现象。

ODC反义RNA转染细胞的肿瘤相关基因表达及其致瘤性

鸟氨酸脱羧酶(ODC)是多胺生物合成途径中的限速酶，其活性的异常升高和继之引起的多胺堆积与肿瘤的发生、发展及转移密切相关。我们曾自行构建人ODC反义RNA真核表达质粒，并转染人肺鳞癌细胞，观察到稳定转染细胞株的生长速度减慢；大分子生物合成受到抑制；ODC mRNA表达减少和ODC活性降低等。

应用基因表达谱芯片技术筛选XTP6基因转染细胞差异表达基因

目的 应用基因芯片技术 ,检测乙型肝炎病毒 (HBV)X蛋白 (HBxAg)反式激活基因XTP6的表达对肝母细胞瘤系HepG2基因表达谱的影响 ,进一步阐明XTP6蛋白可能的分子生物学功能。方法 设计并合成XTP6基因序列特异性的引物 ,应用聚合酶链反应 (PCR)技术扩增XTP6基因片段 ,以常规的分子生物学技术将获得的XTP6编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列测定 ,构建真核表达载体pcDNA3 .1(-) XTP6。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2 ,提取mRNA ,逆转录为cDNA ,与转染空表达载体pcDNA3 .1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析。结果 构建的表达载体经过限制性内切酶分析的DNA序列测定 ,证实准确无误。提取高质量的mRNA ,逆转录为cDNA ,进行cDNA芯片分析。在 115 2个基因表达谱的筛选中 ,发现 2 1个基因表达水平显著上调 ,18个基因表达水平显著下调。结论 应用基因表达谱芯片成功筛选了XTP6转染细胞后差异表达基因 ,为进一步阐明XTP6蛋白可能的生物学功能提供依据。

人B7-H4基因转染细胞株的构建及其对T细胞的作用

目的克隆人B7-H4基因,构建人B7-H4基因转染细胞株并初步研究其对T细胞的作用。方法通过RT-PCR的方法获得人B7-H4分子的基因,将目的片段双酶切(EcoRⅠ和BamHⅠ)后与pIRES2-EGFP真核表达载体连接,构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP-B7-H4并进行鉴定;脂质体转染法将重组载体导入L929细胞,经G418加压筛选并通过流式细胞术和RT-PCR检测表达载体是否转入L929细胞中,通过检测活化T细胞上CD25,CD69的表达及T细胞增殖实验对B7-H4转基因细胞的生物学功能进行初步研究。结果从外周血活化单核细胞中扩增出目的基因,构建重组表达载体pIRES2-EGFP-B7-H4并将其转染至L929细胞,构建了一株稳定表达人B7-H4分子的基因转染细胞株,对其生物学功能的研究显示B7-H4分子可以下调活化T细胞上CD25,CD69的表达,并且对T细胞的活化增殖起到抑制作用(P<0.05)。结论成功构建了稳定表达B7-H4分子的基因转染细胞株,为进一步研制B7-H4分子的单克隆抗体提供了有效的免疫原。

红豆草根瘤侵染细胞的超微结构变化

红豆草(Onobrychis viciaefolia Scop.)是一种抗旱、耐寒、耐热和耐瘠薄的优良豆科牧草,不仅是很好的饲料和绿肥,而且还能大量结瘤固氮,提高土地肥力。因此,它在我国甘肃和其他北方干旱和半干旱贫瘠地区广为种植。虽然不少学者曾对它的引种条件、生产性能、营养成分和形态解剖作过许多研究,但对其共生固氮,特别是与共生固氮息息相关的根瘤在发育中的变化却至今尚无系统报道。因此,为了更好开发利用这一资源,

大豆根瘤侵染细胞发育中高尔基体的变化

为了探讨高尔基体与细菌增殖和周膜扩展的关系,用电子显微镜研究了大豆根瘤侵染细胞发育中高尔基体的变化。结果表明:幼龄侵染细胞中有高尔基体,但在成熟和衰老的侵染细胞中却几乎没有这种结构。高尔基体随幼龄侵染细胞中细菌的增多而增多,它们主要位于细菌附近。这些高尔基体的生理活性较高,不断向周围的细胞质分泌含有纤维状物质的小泡,有的小泡还在向细菌运动。一些小泡位于细菌的周膜上,其附近细菌的周膜常向外形成隆起,并有纤维状物质出现在其中。由此说明,大豆根瘤侵染细胞中的高尔基体参与了细菌的增殖和周膜的扩展。

HBV DNA转染细胞系的建立及其应用研究进展

HBV DNA转染细胞系的建立并表达了全部HBV病毒标志,为HBV基因结构与功能、表达与调控的研究,体外药物筛选的研究等提供了一个很好的细胞模型,是HBV研究的一个重要工具和手段。本文就近年来有关HBV DNA转染细胞系的建立,转染细胞系中HBVDNA复制与表达的特点以及HBV DNA转染细胞系的运用等研究近况作一综述。

芝江霉素对小鼠骨髓嗜多染细胞（PCE）微核的影响

芝江霉素对小鼠骨髓嗜多染细胞（ＰＣＥ）微核的影响罗方妮扬州大学农学院动物科学系扬州２２５００９芝江霉素是一种新的抗鸡白痢抗生素。我们根据中华人民共和国农业部（１９９ｌ）农（牧）函字第１号文件，关于《新兽药特殊毒性试验技术的要求》的规定，进行了有关毒理...