基于染色质免疫共沉淀的高通量测序数据集的顺式调控模体发现算法

针对新一代测序(NGS)的染色质免疫共沉淀的高通量测序(ChIP-Seq)数据集的模体发现问题,提出一种基于费舍尔(Fisher)精确检验的模体发现算法——Fisher Net。首先运用费舍尔精确检验计算所有k长短序的P值并筛选出模体的种子;然后,构建初始模体的位置赋权矩阵;最后,用位置赋权矩阵扫描所有k长短序形成最终模体。通过小鼠胚胎干细胞(m ESC)和红细胞、人类淋巴母细胞系的ChIP-Seq数据集以及ENCODE数据库的数据进行验证,结果表明所提算法精度和计算速度均高于其他常见的模体发现算法,并且能够发现超过80%的已知转录因子核心模体及其辅调控因子模体。该算法在保证高精度的同时可以应用到大规模测序数据集。

非交联染色质免疫共沉淀及其二代测序技术建库方法的优化

目的优化非交联染色质免疫共沉淀及其二代测序(Native ChIP-seq)技术,简化操作步骤,得到高质量ChIP-seq数据。方法裂解细胞,MNase切割DNA释放核小体,用组蛋白修饰的特异性抗体将组蛋白与DNA的复合物进行免疫共沉淀,蛋白酶K消化后进行DNA纯化,染色质免疫共沉淀(ChIP)产物用Tn5转座酶建库与传统建库两种方法进行文库构建并测序。结果与传统建库方法相比,Tn5转座酶建库经过Tn5片段化后直接进行目的DNA的扩增,操作简单,更加省时,效率更高;IGV可视化信号分布峰图显示两种建库方式获得的富集峰基本相同;两种建库方法获得的测序数据中,Tn5转座酶建库比传统建库获得更多的富集峰;Tn5转座酶建库后结果显示重复性良好,信噪比达到50%以上。结论Tn5转座酶建库能提高建库效率并得到更好的数据质量,适用于组蛋白修饰的检测,为表观遗传研究提供更好的技术选择。

外显子测序联合Sanger测序行X-连锁重症联合免疫缺陷家系分析及产前诊断1例报告

目的探讨外显子测序联合Sanger测序应用于X-连锁重症联合免疫缺陷(X-SCID)家系分析及产前诊断的可行性。方法回顾性分析1例X-SCID先证者病史及家族史。用外显子测序技术对先证者免疫缺陷相关基因的外显子进行测序,捕获致病基因后,提取其父母外周血DNA,采用Sanger测序技术进行验证。确定先证者该致病基因遗传于其母亲后,其母亲再次妊娠9周时绒毛取样提取DNA并采用Sanger测序行产前诊断。结果外显子测序结果提示先证者X染色体白细胞介素2受体的γ共用链(IL2RG)基因存在错义突变(c.713G>A,p.Ser238Asn)。Sanger测序结果显示,先证者母亲该位点存在杂合突变,其父亲该位点未见异常。先证者母亲再次妊娠时胚胎绒毛组织X染色体IL2RG基因存在错义突变,诊断胎儿为X-SCID。结论应用外显子测序法捕获X-SCID的相关致病基因,再使用Sanger测序验证并行孕早期产前诊断,可有效预防X-SCID患儿出生。

人类14号染色体测序完成

据路透健康报道,人类14号染色体的测序工作已经完成,这使得发展中的人类基因库又添加了新的信息。该项工作是由国际研究小组完成的,其研究成果发表在近期出版的《自然》杂志上。14号染色体是迄今为止已完成测序的第4条染色体,也是迄今为止已完成测序工作的染色体中最大的一条染色体。据法国国家基因组测序中心的研究人员Ro-

染色质免疫共沉淀测序技术及其在园艺植物中的应用研究进展

近年来,基于染色质免疫共沉淀技术(ChIP)与第二代测序技术结合的染色质免疫共沉淀测序技术(ChIP-seq)已被广泛用于研究DNA与蛋白质的相互作用,对解析园艺植物基因的表达与调控、靶基因筛选与定位、调控网络构建、染色质开放程度确认等方面具有较大的优势。本文综述了ChIP-seq技术的发展简史及其在园艺植物转录因子和组蛋白修饰中所取得的进展,以期为园艺植物DNA—蛋白互作研究提供参考。

人支气管上皮样细胞中苯并[a]芘代谢物-DNA加合物图谱:基于染色质免疫共沉淀测序技术

[背景]苯并[a]芘(BaP)的活性代谢产物7,8-二羟-9,10-环氧苯并[a]芘(BPDE)可与DNA加合,但BPDE-DNA加合物图谱尚不明确。[目的]采用染色质免疫共沉淀测序技术(ChIP-Seq),在全基因组水平上鉴定BPDE加合位点分布及加合基因,为深入研究BaP的毒作用机制提供依据。[方法]人支气管上皮样细胞16HBE培养至第四代达对数生长期。收获细胞并加入染色质免疫共沉淀裂解缓冲液,将裂解产物等分为实验组和对照组,实验组添加终浓度20μmol·L^(–1)的BPDE溶液,对照组添加相同体积的二甲基亚砜溶液,在37℃环境下孵育24 h。超声获得100~500 bp的染色质小片段。使用BPDE特异性抗体(anti-BPDE 8E11)富集与BPDE加合的DNA片段,高通量测序检测BPDE加合位点,使用MEME和DREME软件对前1000个峰序列进行模体分析,注释BPDE在全基因组水平的加合靶基因,并通过生物信息学技术对BPDE加合靶基因进行基因本体论(GO)功能分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析。[结果]高通量测序共检测出842个BPDE结合位点,在各染色体上均有分布。BPDE可以与基因编码区和非编码区共价结合,73.9%的结合位点分布在基因间区,19.6%分布在内含子区,上游2千碱基区域、外显子区、下游2千碱基区域及5′非翻译区也有少量分布。对前1000个峰序列进行分析,寻找到4条可靠的模体,发现富含鸟嘌呤(G)和腺嘌呤(A)的位点易于结合。对结合位点进行富集,共鉴定出199个BPDE加合靶基因,大多分布在1号、5号、7号、12号、17号和X染色体上。GO分析显示,靶基因主要富集于核酸和蛋白质结合,参与调节催化活性、转运活性、翻译延伸因子活性,在细胞分裂、分化、运动、物质运输和信息传递方面发挥重要作用。KEGG分析显示靶基因主要富集于心血管疾病、癌症、免疫炎症反应等相关通路。[结论]利用ChIP-Seq在全基因组水平上共鉴定出199个BPDE加合靶基因,主要影响细胞分裂、分化、运动、物质运输和信息传递等生物学功能,与心血管疾病、肿瘤及免疫炎症反应密切相关。

新生儿重症联合免疫缺陷病分子检测的研究进展

重症联合免疫缺陷病(SCID)是首个纳入新生儿疾病筛查的先天性免疫缺陷病。新生儿SCID分子筛查技术的发展为SCID的早期诊断和治疗提供了更加可靠的手段。但是,分子检测技术也面临着安全性、成本效益等挑战。本文对SCID分子检测技术的优势及挑战进行综述,以为我国新生儿SCID检测提供参考。

SRSF6在大鼠胰岛细胞中结合的靶标及测序分析

目的研究富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子6(serine and arginine rich splicing factor 6,SRSF6,又称SRp55)作为RNA剪切因子在大鼠胰腺β细胞中对胰岛素分泌影响的具体机制。方法通过改进的RNA结合蛋白免疫共沉淀高通量测序(improved RNA Binding Protein Immunoprecipitation highthroughput sequencing,iRIP-seq)技术在大鼠胰岛细胞中鉴定SRSF6调控的基因及功能通路,对SRSF6直接作用的靶标和调控通路及可变剪接事件进行鉴定。结果SRSF6富集性地结合编码区和内含子区域,KEGG分析发现SRSF6结合的靶标在胰岛素信号通路显著富集。结论SRSF6可能通过与胰岛素通路相关重要基因的m RNA前体结合,调控它们的剪接和加工,进而成为影响胰岛素分泌的潜在因素。

超声波细胞粉碎机在高通量测序片段化DNA中的应用

目的 探讨超声波细胞粉碎机在高通量测序中应用的最佳DNA片段化条件。方法 DNA样品在冰浴条件下采用不同的超声功率、单次间隙时间和超声时间、工作时间（单一样品超声破碎时间）、仪器连续工作时间,通过琼脂糖凝胶电泳和2100生物分析仪分别检测基因组DNA片段化和羟甲基化免疫共沉淀效果。结果 超声功率280 W、间隙时间/超声时间5s/5s、总工作时间18min,仪器连续工作时间不超过90min,超声波处理时样品始终保持冰浴环境可获得高通量测序需要的、长度主要集中在200~500bp之间的DNA片段。结论 在我们优化的实验条件下,利用超声波细胞粉碎机可以得到重复性较好的基因组DNA片段,可满足高通量测序文库构建中对DNA片段质量的要求。

1例CD3ε缺陷致重症联合免疫缺陷病的临床及免疫学特征分析

目的探讨1例由11q23染色体CD3E基因突变导致CD3ε缺陷重症联合免疫缺陷病的临床特征及免疫表型。方法收集近期就诊于重庆医科大学附属儿童医院的1例疑诊CD3ε缺陷致重症联合免疫缺陷病患儿外周血标本,提取外周血单个核细胞(PBMC)及核酸,CDR3扫描谱型技术分析T淋巴细胞受体(TCR)多样性,定量PCR检测TCR重排剪切环(TREC)含量,二代测序筛查免疫相关基因,一代测序验证。结果 TCR Vβ亚家族表现为单克隆或寡克隆峰,提示TCR重组受限;定量PCR未检测到TREC含量提示TCR重组及T细胞胸腺输出严重受损;二代测序显示CD3E基因复合杂合突变,一代测序验证证实。结论通过临床及免疫学分析、二代测序筛查及一代测序证实,确诊1例CD3E基因复合杂合突变致CD3ε缺陷重症联合免疫缺陷病,该病例罕见且临床与免疫学表型复杂,临床诊断存在困难,导致漏诊与延迟诊断,患者死亡率高且均为早期死亡,干细胞移植或基因治疗是其唯一的根治手段,因此提高临床工作者对本病的认识对于早期诊断与针对性治疗至关重要。

微小染色体维持蛋白7在乳腺癌中表达及临床意义

目的:探究微小染色体维持蛋白7(minichromosome maintenance protein,MCM7)在乳腺癌中的表达及临床意义。方法:在多个高通量数据库检索乳腺癌样本基因矩阵,提取并计算MCM7 mRNA表达值标准化平均差(standardized mean difference,SMD),结合本单位临床样本进行免疫组化染色,从mRNA和蛋白层面验证乳腺癌MCM7表达水平。汇总受试者工作特征曲线(summary receiver operating characteristic curve,sROC)法进一步评估MCM7表达的差异。通过Cox生存分析评估MCM7表达水平与乳腺癌预后的关系。结果:MCM7 mRNA在乳腺癌组织中显著上调[SMD=0.31(0.07~0.54)],MCM7蛋白也在乳腺癌组织中高表达。Cox生存分析得MCM7高表达是乳腺癌预后的危险因素[HR=2.26(1.41~3.61)]。同时,MCM7 mRNA在三阴性乳腺癌与非三阴组相比上调水平进一步升高[SMD=0.96(0.71~1.21)]。结论:MCM7高表达可促进乳腺癌的发生和不良预后,其促癌作用在三阴性乳腺癌中更显著。

染色质免疫共沉淀技术的应用和研究进展

本文主要从染色质免疫共沉淀技术的基本原理、实验步骤、优缺点和应用等方面进行阐述,阐明了应用于ChIP技术下游的确定靶基因的不同方法,并对其中的两种重要方法作比较。特别介绍了ChIP技术在植物方面的最新研究进展,并对此技术作总结和展望。

TMEM家族成员免疫功能的研究进展

2006年5月18日,Nature杂志公布了人类1号染色体的基因测序图,人类基因组计划完成,生命科学研究进入了功能基因组时代。虽然人类基因组全部序列已确定,但对许多基因的功能仍一无所知。

游离二氧化硅所致肺成纤维细胞转分化过程中DNA甲基化差异基因的MeDIP-seq检测

目的:检测游离二氧化硅所致肺成纤维细胞转分化过程中可能存在的DNA甲基化差异基因并探讨其可能作用机制。方法:原代培养肺成纤维细胞和肺泡巨噬细胞,建立共培养的矽肺体外模型,采用甲基化DNA免疫共沉淀测序技术检测分析不同染毒时间(0、24、48 h)的肺成纤维细胞之间的DNA甲基化差异基因,并采用DAVID工具对检测到的甲基化差异基因进行KEGG的通路富集分析。结果:共发现8 791个基因的DNA甲基化程度在3个染毒时间组中均存在差异,DAVID工具分析发现这些差异主要集中在代谢、环境信息过程、细胞过程、生物体系统、人类疾病相关通路等通路中。结论:矽肺形成过程中存在大量DNA甲基化程度发生改变的基因,且这些基因涉及多个通路。

MeDIP-Seq检测大鼠不同状态雪旺细胞基因甲基化水平

目的探寻大鼠正常态雪旺细胞(NSCs)和激活态雪旺细胞(ASCs)差异甲基化基因。方法成年Wistar大鼠结扎坐骨神经,饲养7 d后分别从坐骨神经和臂丛神经提取ASCs和NSCs。S-100抗体免疫荧光染色鉴定细胞,CCK-8法测定细胞生长情况。甲基化免疫共沉淀测序(Me DIP-Seq)技术筛选出ASCs和NSCs的差异性甲基化区域;分析与轴突再生相关的差异甲基化基因在染色体的分布情况,并进行基因本体(GO)和信号通路(PATHWAY)分析。结果成功获得了高纯度的ASCs和NSCs,两者S-100均表达阳性。在相同培养条件下,ASCs生长速度更快。Me DIP-Seq共发现177 176个差异性甲基化区域,其中位于启动子(≤1 kb)内1 097个、启动子(1~2 kb)内1 136个,Cp G岛内567个。共获得214个与轴突再生相关的差异甲基化基因,与NSCs相比,ASCs高甲基化基因191个,低甲基化基因23个。这些基因位于各个染色体上,以12号染色体上最多(22个),M染色体最少(2个)。GO分析结果显示差异甲基化基因涉及了轴突生长、轴突形成、轴突延伸和轴突导向等过程;并且与MAPK、细胞黏附分子和Ras等信号通路有关。结论 ASCs和NSCs的甲基化水平存在明显的差异,可能与轴突再生有关。

Hemin诱导K562细胞分化前后PU.1全基因组结合位点探测

目的探讨K562细胞分化前后全基因组上的PU.1结合位点图谱及靶基因。方法用hemin对K562细胞诱导分化72 h,诱导分化前后的细胞利用PU.1抗体进行染色质免疫共沉淀实验,并进行高通量测序,利用生物信息学分析K562细胞分化前后PU.1在基因组上的结合位点,并进行基因注释、基因功能分析、KEGG通路分析及靶基因预测。结果发现K562细胞分化前PU.1结合位点有3107个,分化后的结合位点有1897个,共有的结合位点有843个。KEGG通路分析结果显示,分化后PU.1结合位点特有的信号通路有NF-κB信号通路,生长激素合成、分泌和运输通路,MAPK信号通路。K562细胞分化前后有1210个差异的PU.1结合位点,对应179个靶基因,其中分化相关的PU.1靶基因包括球蛋白基因、自噬相关基因、microRNA、非编码RNA以及转录因子。Motif分析结果显示,PU.1倾向于去结合ACTTCC特定序列。结论PU.1的基因组结合位点在K562细胞分化前后发生了显著变化,此研究结果为进一步揭示PU.1在血细胞中的功能及作用机制提供了依据。

基于RIP-Seq技术检测MRTF-A结合RNA在小鼠MCAO/R模型中表达

目的应用RIP-Seq测序技术检测小鼠MCAO/R模型中心肌素相关转录因子A(MRTF-A)结合RNA的表达差异,探讨MRTF-A潜在的作用机制。方法将C57BL/6小鼠随机分成假手术组及I/R组,线栓法构建MCAO模型,再灌注24 h后,提取脑组织总蛋白,利用MRTF-A抗体免疫共沉淀后,进行RNA高通量测序,获得MRTF-A结合RNA的表达谱,继而对差异RNA进行GO、KEGG分析。结果与假手术组相比,I/R组有429个RNA发生差异表达(上调203,下调226),并且在功能元件和染色体分布上均具有显著差异。GO分子功能分析显示,差异表达RNA主要富集RNA结合、Poly(A)RNA结合等注释。KEGG通路分析显示10条通路被显著富集,其中雌激素信号通路富集最显著。结论在脑I/R损伤时MRTF-A结合RNA表达谱发生差异改变,为深入探讨MRTF-A的分子机制提供理论依据。

2016年基础及临床免疫学进展

2016年基础免疫学研究进展包括进一步阐明了不同蛋白成分在不同效应T细胞和效应B细胞中所起的作用,如肌动蛋白细胞骨架中涉及的细胞因子和蛋白质。通过对家族性噬血细胞综合征的研究进一步阐明了细胞毒性细胞中颗粒物质形成和分泌的规律。确定了甲羟戊酸激酶缺乏导致的炎症反应的患者中异戊烯化的作用。同时也回顾了临床免疫研究进展,以及全基因组测序新方法和新报道的与免疫缺陷相关基因,如T细胞活化连接蛋白基因(LAT); B细胞淋巴瘤/白血病相关基因11B (BCL11B);具有RGD序列、富含亮氨酸重复序列、原肌球蛋白调节蛋白结构域、富含脯氨酸结构域的蛋白(RLTPR);膜突蛋白; JAK激酶1 (JAK1)。在原发性免疫缺陷进行造血干细胞移植和基因治疗方面取得相对意义上的成功;证实了自体病毒特异性细胞毒性T细胞使用的有效性。正在探索新的药物用法,例如吡格列酮在慢性肉芽肿患者中对增强呼吸爆发方面所起的作用。在HIV感染疫苗研究方面的持续进展为抗高突变率病毒免疫应答提供思路。

对于核小体定位检测方法的比较研究

在真核细胞中,核小体是组成染色质的基本结构单位,是由DNA紧密缠绕在组蛋白八聚体上所形成的一个复合体结构。而DNA与组蛋白的结合并不是固定不变的,没有核小体结合的DNA区域易于各种调节蛋白的接近与结合。因此人们怀疑核小体的定位与基因的转录调节之间存在某种内在联系。对现行的核小体定位的检测方法进行了归类,并对其优缺点进行了分析整理。对更深入的探索核小体定位检测方法的应用有一定意义。

表观遗传学研究方法进展

表观遗传调控是基因表达调控的重要组成部分,已成为当前研究的热点。目前其研究主要集中在DNA甲基化和组蛋白修饰。针对这两种表观修饰,其研究方法也取得了较大进展,一方面方法的灵敏度和特异性都在不断提高;另一方面表观修饰的检测正在逐步从定性检测向定量分析方向发展,从个别位点向高通量检测发展。此外,新一代测序技术的应用将大大推动表观遗传研究的发展,包括单分子实时测序法、单分子纳米孔测序法等。综述目前常用的DNA甲基化、组蛋白修饰研究方法以及最新的单分子测序技术,并对它们在表观遗传修饰检测中的应用作了简要对比分析。