用于“野生小家鼠来源一号染色体替换系”构建的PCR-LDR分型系统

目的建立用于"野生小家鼠来源一号染色体替换系"构建的PCR-LDR(polymerase chain reactionand ligase detection reaction,PCR-LDR)分型系统。方法采用易于判断的二元性遗传标记单核苷酸多态性位点(single nuclear polymorphism point,SNP),应用连接酶检测技术(ligase detection reaction,LDR),建立PCR-LDR分型方案。结果三组多重PCR-LDR分型方案适用于覆盖整条一号染色体的29个SNP遗传位标的分型,位点间平均遗传距离在6.25厘摩(centimorgan,cM)。结论实现了后代小鼠快速、高通量的基因分型,可准确检测1号染色体各区段的重组事件。

STR和SNP对3个小鼠1号染色体替换系筛选结果的比较

目的比较STR和SNP对3个1号染色体替换系的分型结果，并为每个替换系选择合适的基因分型方法。方法采用20个SNP和10个STR位点分别对3个1号染色体替换系N2代各40个样本进行分型。结果采用20个SNP位点，从C3H／He替换系中筛选到6个样本，从FVB／N替换系中筛选到9个样本，从AKR替换系中筛选到4个样本。采用10个STR位点，从C3H／He替换系中筛选到6个样本，从FVB／N替换系中筛选到10个样本，从AKR替换系中筛选到6个样本。结论根据每个品系基因组背景不同，可选择三组多重STR方案作为C3H／He替换系的基因分型方法，三组多重SNP方案作为FVB／N和AKR替换系的基因分型方法。

野生小鼠来源1号染色体替换系小鼠的生长表型与血液生化检测

目的分析野生小鼠来源1号染色体替换系小鼠群体的生长表型与血液生化指标,探讨替换系群体的QTL定位潜力。方法以染色体替换系近交后代小鼠为研究对象,测定其体重、体长、尾长、血液生化、内脏器官重量等表型数据,统计其与C57BL/6差异显著性。结果发现替换系小鼠在多个指标上与C57BL/6具差异有显著性。不同发育时期的外部表型上与C57BL/6相比,体重具显著差异的是B6-Chr1KM等6个品系,体长具显著差异的是B6-Chr1K M等5个品系,尾长具显著差异的是B6-Chr1K M等9个品系;部分品系在肝、脾、肾脏和脑部重量上存在与C57BL/6的显著差异;生化指标上,丙氨酸氨基转移酶B6-Chr1CM雌鼠显著偏高,碱性磷酸酶B6-Chr1HZ雌鼠显著偏高、B6-Chr1KM雄鼠显著偏低,总胆红素B6-Chr1CM雄鼠、B6-Chr1SMX雄鼠和B6-Chr1HZ雄鼠显著偏高,甘油三酯B6-Chr1SMX雄鼠显著偏高,总胆固醇B6-Chr1TW雄鼠显著偏高。结论培育的野生小鼠来源的1号染色体替换系群体在部分表型上与C57BL/6差异有显著性,具备作为QTL定位的遗传资源潜力。

染色体替换系的方案构建及评价

目的为缩短复杂性状相关基因精细定位时间，构建染色体替换系（CSSs），并对构建方案进行评价。方法以供体小鼠作为母本、受体C57BL／6小鼠作为父本进行杂交，获得N1代小鼠。将N1代雄性小鼠与C57BL／6雌性小鼠杂交，获得N2代小鼠。选择N2代1号染色体非重组的雄性小鼠与C57BL／6雌性小鼠回交，获得N3代回交小鼠；通过短串联重复序列（STR）与单核苷酸多态性（SNP）对每代一定数量的子代进行遗传分析，依次回交10代，选择N10代l号染色体未重组的样本，雌雄交配，挑选1号染色体为纯合且来自供体品系的子代小鼠，用于繁殖纯合后代。通过基因芯片扫描鉴定替换系的纯合度，并与期望值比较。结果根据构建的CSSs方案，得到2个不同的CSSs，通过基因芯片扫描得到的替换系纯合度与期望值接近。结论构建的CSSs方案可完成（部分）近交系小鼠品系目标染色体替换，供体品系背景基因组中99．59％以上已被受体C57BL／6小鼠替换，证明构建的CSSs方案可行。

覆盖野生稻基因组的染色体片段替换系的构建及其米质相关数量性状基因座位的鉴定

染色体片段替换系(CSSL)是基因组水平快速初步定位数量性状基因座位(QTL)的良好材料,而水稻的品质性状是多基因控制的数量性状,因此可用替换系鉴定控制水稻品质性状的QTL。本文用分子标记辅助选择技术(MAS)构建了由133个株系组成的以‘特青’(籼稻品种)为轮回亲本,以海南的一种普通野生稻为供体亲本,覆盖绝大部分野生稻基因组的染色体片段替换系。利用这套替换系,初步定位了控制稻米外观和理化品质性状的15个QTL,为今后水稻品质性状QTL的克隆以及稻米品质相关性状的改良提供了依据。

应用1号染色体替换系小鼠优选血脂QTLs内功能基因

目的:利用野生小鼠来源1号染色体替换系B6-Chr1^(SJ)和受体品系C57BL/6J (B6)筛选已知相关数量性状基因座(quantitative trait loci, QTL)内表达差异蛋白编码基因和功能突变基因,再结合人类全基因组关联分析(genome wide association study,GWAS)数据和相关文献优选出候选基因。方法:采用表达谱芯片技术对B6-Chr1^(SJ)和B6进行肝脏基因表达谱检测;运用Transcriptome Analysis Console软件从基因水平进行表达差异分析,鉴定出表达差异蛋白编码基因;运用Ensembl Variant Effect Predictor软件对B6-Chr1^(SJ)小鼠1号染色体上的遗传变异进行功能注释,鉴定功能突变基因;利用小鼠系统遗传学资源数据库,筛选出已鉴定的血脂相关QTLs;利用bedtools中的intersectbed将鉴定的表达差异蛋白编码基因及功能突变基因与已鉴定的QTLs区段进行比较,并结合人类GWAS数据和相关文献优选出血脂相关候选基因。结果:在血脂相关QTLs内,共筛选出34个差异表达蛋白编码基因,分别有32、11和20个位于胆固醇(cholesterol, CHOL)、高密度脂蛋白胆固醇(High-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(Low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)相关的QTLs内;共筛选出47个功能突变基因,分别有21、41和14个位于CHOL、HDL-C、LDL-C相关的QTLs内。在上述基因中,共优选出两个候选基因。其中,Marc1在人类GWAS研究中为阳性位点,Soat1已有报道与小鼠血脂代谢有关。结论:Marc1和Soat1可能是引起B6-Chr1^(SJ)血脂异常的功能基因,其中Marc1未明确报道与血脂代谢相关,可作为候选基因进行进一步的功能验证。

结球甘蓝染色体片段替换系构建

以结球甘蓝(Brassica oleracea L.var.capitata)育种骨干亲本R2-P2(圆球形,抽薹晚,硫苷含量低,高感黑腐病、枯萎病和霜霉病)为轮回亲本,以野生甘蓝自交系R4-P1(不结球,抽薹早,蜡质厚,硫苷含量高,对黑腐病、枯萎病和霜霉病等多种病害具有抗性)为供体亲本,通过连续回交、自交和分子标记辅助选择,构建出一套由163个具有R2-P2遗传背景且具有R4-P1供体染色体片段单株组成的染色体片段替换系(Chromosome segment substitution line)。该替换系群体具有102个染色体替换片段,均匀分布在1~9号染色体上,平均每个株系携带1.3个染色体片段,平均替换长度为5.62 Mb。替换片段总长度为573.74 Mb,覆盖亲本R4-P1全基因组的73.4%,其中单片段替换片段总长度为139.91 Mb,覆盖全基因组的26.5%,双片段替换片段总长231.41 Mb,覆盖亲本R4-P1全基因组的43.82%,含有3个替换片段总长度为201.3 Mb,覆盖供体亲本基因组25.98%。

基于新型高保真Taq酶的多重等位基因特异性PCR方法的建立与应用

在8号染色体存在部分替换片段的小鼠上挑选3个SNP位点进行初步方案检验,包括高保真Taq酶的特异性测试以及引物浓度对分型结果的影响,并评价该方法的灵敏度;之后应用该技术检测野生1号染色体替换系小鼠上的9个SNP的不同样本。对Taq酶的特异性研究表明:引物在未引入突变的前提下检测结果与测序结果保持一致;引物稀释实验说明浓度最低为0.003~0.006μmol/L,灵敏度的检测结果表示最低浓度检测限可达0.07 ng/μL以下。最后检测得到5种标准样本的基因型,其代表9个SNP的组合。成功验证并建立该新型高特异性Taq酶应用于多重等位基因特异性PCR实验的总体流程。提供一套具备高特异性、能够针对多个SNP位点进行检测的低成本方案,对多重等位基因特异性PCR技术的开发同样具有参考价值。