嗜热四膜虫染色体浓缩调节因子(RCC1)的定位及功能

真核细胞中染色体浓缩调节因子(regulator of chromosome condensation 1,RCC1)是RanGTPase唯一的鸟嘌呤核苷酸交换因子.染色质结合的RCC1和RanGTPase相互作用,催化细胞核内RanGDP向RanGTP的转化,进而调控了核质间的定向运送、有丝分裂期纺锤体的组装以及核膜的形成.本实验从原生生物嗜热四膜虫大核基因组中鉴定了1个新的RCC1(TTHERM_00530380)基因.该基因全长2 541 bp,包含2个内含子序列,开放阅读框为2 181 bp,编码726个氨基酸.实时荧光定量PCR表明,RCC1在四膜虫营养生长、饥饿以及有性生殖时期都有表达,且在有性生殖转录水平达到最高.免疫荧光定位分析表明,HA-RCC1在营养生长和饥饿时期,定位于大核和小核中;在有性生殖时期,定位于亲本大核、减数分裂的小核、新生成的大核和凋亡的大核中.过表达RCC1导致大核的无丝分裂异常,细胞增殖变慢,最终产生无大核的后代细胞.敲减RCC1导致了多小核的产生.结果表明,RCC1参与调控了四膜虫细胞核的分裂,RCC1的正常表达对核分裂以及细胞增殖起到重要的调控作用.

直肠癌组织中RCC1的表达及临床意义

目的探讨直肠癌组织中染色体浓缩调节因子1(RCC1)的表达及临床意义。方法采用GEPIA数据库分析RCC1在结直肠癌组织中的表达情况及与预后的关系。收集本院2015年1月至2018年10月经病理确诊的66对直肠癌组织和配对癌旁组织,采用实时定量PCR(QPCR)检测上述组织中RCC1 mRNA水平,分析RCC1表达与直肠癌临床病理特征(性别、年龄、TNM分期、肿瘤大小、分化程度、浸润深度和淋巴结转移)的关系。结果GEPIA数据库分析显示结肠癌和直肠癌组织中RCC1水平均高于正常组织(P<0.05);结直肠癌全组分析显示RCC1表达与总生存期(OS)无关,但低表达的无复发生存期(RFS)优于高表达(HR=0.83,P=0.026);结肠癌亚组分析显示低表达的OS和RFS均优于高表达(HR=0.59,P=0.034;HR=0.55,P=0.016),而直肠癌亚组分析显示RCC1表达与OS和RFS均无关(P>0.05)。直肠癌组织中RCC1 mRNA水平为1.987±0.713,高于癌旁组织的1.152±0.561(P<0.05)。RCC1表达与性别、年龄和分化程度均无关(P>0.05),而与肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移和TNM分期均有关(P<0.05)。结论肿瘤细胞RCC1的异常表达可能参与人直肠癌的发生发展,RCC1表达可能是肿瘤细胞进展和预后不良的潜在标志物。

PTEN、HIF-1α和NDRG1在子宫内膜样腺癌中的表达和相关性研究

目的探讨PTEN、HIF-1α和NDRG1蛋白的异常表达在子宫内膜样腺癌发生、侵袭和转移中的作用及意义。方法采用免疫组织化学方法,结合组织芯片技术,检测124例Ⅰ型子宫内膜癌、28例内膜不典型增生、35例正常内膜组织中PTEN、HIF-1α和NDRG1的表达水平,结合临床病理因素进行分析。结果 PTEN、HIF-1α和NDRG1在子宫内膜样腺癌中的阳性表达率分别为29.8%、61.3%、52.4%,与正常内膜组和不典型增生组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。PTEN表达下调和NDRG1过度表达与肿瘤分化程度明显相关(P<0.05),HIF-1α蛋白表达与肿瘤分化、肌层浸润和淋巴结转移明显相关(P<0.05)。子宫内膜样腺癌组织中PTEN和HIF-1α和NDRG1的表达存在负相关关系(r=-0.314,P<0.01,r=-0.296,P=0.001),而HIF-1α蛋白与NDRG1的表达正相关(r=0.237,P=0.008)。结论 PTEN缺失可能上调HIF-1α和NDRG1蛋白的表达,在子宫内膜样腺癌发生、侵袭和转移中起重要作用,联合检测对于判断子宫内膜癌的恶性程度和预后有重要意义。

大鼠XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及IRF-1结合位点的鉴定

目的:构建大鼠X染色体连锁的凋亡抑制蛋白相关因子1(X-linked inhibitor of apoptosis associated factor 1,XAF1)基因启动子(全长和截断)荧光素酶报告质粒,并观察在人胚肾细胞HEK293中过表达干扰素调节因子-1(interferon regulatoryfactor-1,IRF-1)对XAF1基因启动活性的影响,同时,筛选其可能的IRF-1结合位点。方法:采用PCR技术,扩增出大鼠XAF1基因启动子序列(-1497～+166 nt),将XAF1基因启动子插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中获得pGL3-XAF1-QC,与大鼠野生型IRF-1表达质粒(pcDNA3.1-IRF-1)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,确定IRF-1对XAF1基因的启动作用。同时,应用生物信息学软件预测XAF1基因启动子上IRF-1潜在的结合位点,并构建截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒(pGL3-XAF1-1、pGL3-XAF1-2、pGL3-XAF1-3和pGL3-XAF1-4)。将上述全长和各截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒和IRF-1过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,筛选IRF-1的结合位点。结果:菌液PCR及核酸测序证实,上述荧光素酶报告质粒均构建成功。将pGL3-XAF1-QC和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞发现,XAF1基因启动子活性显著增加。而将pGL3-XAF1-QC、pGL3-XAF1(1～4号)和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞后证实,pGL3-XAF1-3的启动活性显著低于pGL3-XAF1-1和pGL3-XAF1-2。提示IRF-1可能结合在大鼠XAF1基因启动子的-337～-47 nt区域。结论:本实验成功构建了大鼠全长及截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒,并初步筛查出IRF-1在XAF1基因启动子上的结合区域,为后续研究奠定了基础。

HER2、STRT1及PTEN在膀胱尿路上皮细胞癌中的表达及对预后的影响

目的观察人表皮生长因子受体2(HER2)、沉默信息调节因子1(SIRT1)及人第10号染色体缺失的磷酸酶与张力蛋白同源物基因(PTEN)在膀胱尿路上皮细胞癌中的表达及对预后的影响。方法选择2018年2月—2019年3月收治的124例膀胱尿路上皮细胞癌的癌组织标本设为研究组,并选取距癌组织3 cm处的正常组织作为对照组。比较两组HER2、SIRT1及PTEN表达情况,同时根据预后情况分组,分析影响膀胱尿路上皮细胞癌患者预后的危险因素。结果研究组HER2、SIRT1的阳性表达率高于对照组,PTEN阳性表达率低于对照组(P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示,有家族史、WHO病理分级Ⅱ~Ⅲ级、UICC-TNM临床分期T_(2)~T_(4)期、HER2表达阳性、SIRT1表达阳性及PTEN表达阴性均为影响膀胱尿路上皮细胞癌患者预后的独立危险因素(P<0.05,P<0.01)。结论HER2、SIRT1在膀胱尿路上皮细胞癌组织中呈高表达,PTEN呈低表达,均为影响膀胱尿路上皮细胞癌患者预后的独立危险因素。

常染色体显性多囊肾病患者与正常成人尿液的定量比较蛋白质组学分析

目的搜索常染色体显性多囊肾病(ADPKD)患者与正常成人尿液蛋白质组中有丰度差异的蛋白质成分。方法制备ADPKD患者(PKD1突变)及正常成人尿液蛋白组样品,同位素编码的亲和力标签法标记蛋白质、筛选被标记肽段,二维液相色谱-串联质谱法分离鉴定被标记肽段,从而鉴定蛋白质。通过计算两同位素试剂标记的相同肽段指纹峰面积比,寻找有丰度差异的蛋白质。根据被鉴定肽段的可信度,从鉴定出的蛋白质中选出6种,免疫印迹法验证其在两尿液蛋白组样品中的丰度差异。结果两尿液蛋白质组共鉴定出尿蛋白质106种, ADPKD患者尿液中水平较正常上调者48种,下调者45种。其中多囊蛋白1、肝细胞生长因子、单核细胞趋化蛋白3及孕激素受体等5种蛋白丰度差异为免疫印迹所证实。结论包括多囊蛋白1在内的多种蛋白质成分在ADPKD患者尿液中丰度发生改变,差异蛋白包括生长因子、凋亡调节蛋白、细胞外基质成分、受体、参与胞浆运输的蛋白质、酶类、细胞信号蛋白、转录因子及转录调节因子等,这些蛋白质信息可能为寻找与ADPKD发病相关的蛋白提供部分实验依据。

联合多个修复相关基因的mRNA用于大鼠骨骼肌损伤时间推断

目的探讨DNA聚合酶δ相互作用蛋白3(polymerase delta-interacting protein 3,POLDIP3)、类染色体浓缩调节样蛋白(regulator of chromosome condensation 1 like,RCC1L)、高脯氨酸蛋白5(proline-rich 5,PRR5)、核糖核酸输出蛋白1(ribonucleic acid export 1,RAE1) 4种修复相关基因的mRNA联合应用于早、中期损伤时间推断的方法。方法制备大鼠骨骼肌挫伤模型,于损伤后4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44和48h取挫伤区肌肉组织,观察大鼠骨骼肌挫伤后修复过程中的组织形态学变化。利用逆转录实时定量聚合酶链反应(reverse transcription real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测Poldip3、Rcc1l、Prr5、Rae1 mRNA的相对表达量。利用4种基因在损伤后各时间点的表达模式对损伤过程进行分段,再通过Fisher判别法对上述分段结果进行准确性验证。结果组织形态学变化结果显示,骨骼肌挫伤后随着时间的延长发生修复,联合4种基因的表达趋势可将48h内的损伤时间分为4～12h、16～28h、32～48h 3个时间段,Fisher判别分析结果显示此3个时间段分类的准确率分别为83.3%、75.0%、73.3%。结论根据各基因相对表达量进行分组判别的准确度较高,联合多种基因mRNA的相对表达较单一指标进行损伤时间推断更为准确,结合Fisher判别分析可应用于早、中期损伤时间推断。

Fibrocystin对常染色体隐性遗传多囊肾病囊肿细胞增殖的影响

目的研究fibmcystin对表皮生长因子（EGF）诱导的细胞过度增殖的影响并探讨其机制。方法通过RNA干扰技术建立PKHD1-沉默细胞株，分别检测EGF诱导的细胞增殖率、ERK1／2磷酸化水平和细胞内Ca^2＋浓度。通过降低HEK293细胞和增高PKHD1-沉默细胞内Ca^2＋浓度，研究Ca^2＋在其中的可能作用。结果与HEK293细胞比较，PKHD1-沉默HEK293细胞对EGF作用高度敏感，增殖率为231．5％，显著高于HEK293细胞的152．8％（P〈0．01），细胞内Ca^2＋浓度也显著降低（P〈0．01）。同时PKHD1沉默可显著增高EGF诱导的ERKI／2信号通路活化。运用Ca^2＋通道阻断剂维拉帕米降低HEK293细胞内Ca^2＋浓度后，与未经维拉帕米处理的细胞比较，细胞增殖率为202．2％，显著增高。维拉帕米处理的HEK293细胞的ERKI／2磷酸化水平明显高于未处理的细胞。而运用Ca^2＋通道激活剂BayK8644增高PKHD1-沉默HEK293细胞内Ca^2＋浓度后，显著降低了EGF诱导的PKHD1-沉默HEK293细胞的增殖率（135．5％），BayK8644处理的PKHD1-沉默HEK293细胞的ERK1／2磷酸化水平明显低于未处理的细胞。结论PKHD1基因的突变导致fibrocystin功能缺失，引起细胞内Ca^2＋浓度降低，导致EGF诱导的ERKI／2信号通路过度活化，可能是常染色体隐性遗传多囊肾疾病（ARPKD）患者肾囊肿衬里上皮细胞异常增殖导致ARPKD肾囊肿发生的机制之一。

基于细胞凋亡的老年性耳聋发病机制研究进展

从细胞凋亡相关的蛋白质,阐述基于细胞凋亡的老年性耳聋发病机制的研究进展,分析半胱氨酸基天冬氨酸-特异性蛋白酶-3(Caspase-3)、X染色体连锁凋亡蛋白(XIAP)、沉默信息调节因子2相关酶1(Sir2 T1)和细胞色素C(Cytochrome C)上述4种与细胞凋亡相关的蛋白质对老年性耳聋发病的影响及研究进展。细胞凋亡是引起老年性耳聋的关键影响因素,包括耳蜗毛细胞、耳蜗螺旋神经节细胞和初级听皮层神经元的凋亡。4种蛋白质因子均与听觉相关细胞的凋亡有密切关系,并在老年性耳聋疾病进展过程中起重要作用,有望作为靶点来治疗老年性耳聋。

WHOⅡ级脑胶质瘤患者无进展生存期的影响因素分析

目的分析世界卫生组织(WHO)Ⅱ级脑胶质瘤患者无进展生存期的影响因素。方法回顾性纳入2008年1月至2015年12月首都医科大学三博脑科医院神经外科收治的72例成人WHOⅡ级脑胶质瘤患者,对患者行手术切除肿瘤。术后对组织样本采用免疫组织化学染色方法检测异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)R132H、α地中海贫血或精神发育迟滞综合征X染色体相关基因(ATRX)及端粒延长酶调节因子1(RTEL1)的突变情况。采用Kaplan-Meier生存曲线分析IDH1 R132H、ATRX及RTEL1表达不同的患者无进展生存期的差异。采用单因素和多因素Cox回归分析方法进一步评价影响患者预后的各临床因素。结果72例脑胶质瘤患者免疫组织化学染色结果为,39例(54.2%)IDH1 R132H染色阳性,33例(45.8%)阴性;56例(77.8%)ATRX染色阴性,16例(22.2%)阳性;29例(40.3%)RTEL1染色阳性,43例(59.7%)阴性。生存期分析结果显示,IDH1 R132H阴性患者的累积无进展生存率低于IDH1 R132H阳性者(P<0.05),ATRX阳性与阴性患者累积无进展生存率间的差异无统计学意义(P>0.05),RTEL1阳性患者的累积无进展生存率低于RTEL1阴性患者(P<0.05)。单因素和多因素Cox回归分析结果显示,年龄>40岁(OR=3.618,95%CI:1.688~7.753,P=0.001)、肿瘤部分切除(OR=0.204,95%CI:0.064~0.656,P=0.008)、IDH1R132H表达阴性(OR=2.867,95%CI:1.129~7.282,P=0.027)及RTEL1表达阳性(OR=0.354,95%CI:0.151~0.827,P=0.016)为胶质瘤患者无进展生存期的独立影响因素,可独立用于患者的预后判断。结论年龄>40岁、肿瘤部分切除、IDH1R132H表达阴性及RTEL1表达阳性是影响WHOⅡ级脑胶质瘤患者无进展生存期的独立危险因素。