微RNA-132-3p靶向第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物调控葡萄膜黑色素瘤细胞增殖与凋亡

目的 研究微RNA(miR)-132-3p在葡萄膜黑色素瘤细胞增殖、凋亡中的作用及其作用机制。方法 该研究起止时间为2018年2月至2019年7月。定量聚合酶链反应(qPCR)检测正常葡萄膜上皮细胞ARPE-19和葡萄膜黑色素瘤细胞SP6.5、M23中miR-132-3p表达。SP6.5细胞中转染miR-132-3p干扰质粒(anti-miR-132-3p)、第10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)过表达质粒(pcDNA3.1-PTEN)或共转染anti-miR-132-3p和PTEN干扰质粒(si-PTEN),MTT法和流式细胞术分别检测细胞增殖与凋亡,蛋白质印迹法检测PTEN、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、周期素依赖激酶抑制剂p21(P21)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达,生物信息学预测结合双萤光素酶报告实验分析miR-132-3p与PTEN的靶向关系。结果 与ARPE-19细胞相比,SP6.5、M23细胞中miR-132-3p表达量(0.26±0.02比0.94±0.09、0.81±0.08)明显升高(P<0.05)。与anti-miR-132-3p阴性对照(anti-miR-NC)组相比,anti-miR-132-3p组24 h、48 h、72 h的细胞活性(0.51±0.05比0.30±0.03、0.97±0.09比0.45±0.05、1.40±0.14比0.76±0.07)、cyclin D1、Bcl-2蛋白表达量显著降低(P<0.05),细胞凋亡率[(8.03±0.68)%比(21.51±2.06)%]、P21、Bax水平明显提高(P<0.05),与过表达PTEN相同。miR-132-3p与PTEN之间有靶向调控关系。抑制PTEN能逆转抑制miR-132-3p对SP6.5细胞增殖的抑制作用及对细胞凋亡的促进作用。结论 miR-132-3p通过直接靶向PTEN调控葡萄膜黑色素瘤细胞增殖与凋亡。

去泛素化酶USP29调控CBX6蛋白质稳定性

多梳家族(polycomb group,PcG)是一类控制细胞命运和胚胎发育的转录抑制因子,主要以转录抑制复合物(polycomb repressive complex,PRC)的形式发挥功能。染色体盒蛋白质同源物6(chromobox protein homolog 6,CBX6)是PRC1的核心蛋白质亚基之一,在基因表达调控、细胞更新分化、肿瘤发生发展和干细胞干性维持等方面发挥重要的作用。本研究发现,CBX6通过泛素-蛋白酶体依赖性途径降解,接着利用包含92个去泛素化酶(deubiquitinating enzyme,DUB)基因表达文库进行筛选,发现泛素特异性蛋白酶29(ubiquitin-specific protease,USP29)能够明显地稳定CBX6的蛋白质水平并延长其半衰期(P<0.05);免疫沉淀结果发现,CBX6通过其C-端结构域与USP29发生相互作用;进一步研究发现,USP29通过去泛素化CBX6调控CBX6蛋白质稳定性,且这个过程依赖于USP29本身去泛素化酶活性。细胞增殖结果还发现,USP29能抑制MCF7细胞的增殖(P<0.0001)。综上所述,本研究通过筛选发现,USP29能够通过去泛素化CBX6来稳定CBX6蛋白质水平,且USP29能够抑制MCF7细胞增殖进程。

蛋白质精氨酸甲基转移酶5在肿瘤中的作用及其临床应用

蛋白质精氨酸甲基转移酶5(protein arginine methyltransferase 5,PRMT5)是一种Ⅱ型蛋白质精氨酸甲基转移酶,在胃癌、肝癌、结直肠癌、肺癌和乳腺癌等多种肿瘤中异常表达。异常表达的PRMT5通过调节细胞周期蛋白、PI3K细胞信号通路等途径影响肿瘤细胞,通过对相关肿瘤抑制基因的调控进而影响肿瘤的发生和发展。本文围绕近年来肿瘤中PRMT5的最新研究进展,包括对雄激素受体、免疫细胞、E2F-1-Bcl-2途径、PTEN和P16等的作用及其机制,并结合目前相关抑制剂的研究,讨论如何在未来临床治疗中靶向PRMT5达到治疗肿瘤的目的。

肾气丸加减方对高糖高脂诱导的MIN6细胞保护作用及PI3K/AKT/GSK-3β信号通路的影响

目的利用MIN6细胞损伤模型探讨肾气丸加减方通过调控磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸—苏氨酸激酶/糖原合成激酶3β(phosphoinositide3-kinase/threonine-protein kinase/glycogen synthase kinase-3β,PI3K/AKT/GSK-3β)信号通路保护胰岛β细胞功能的机制。方法将MIN6细胞分为空白组,模型组,肾气丸加减方低、中、高剂量组以及PI3K阻滞剂组(LY294002)。用CCK-8法检测各组细胞活性,胰岛素放射免疫分析试剂盒检测各组MIN6细胞上清液胰岛素含量,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,免疫蛋白印迹法检测各组细胞中PI3K、磷酸化(phosphorylated,p)-PI3K、AKT、p-AKT、GSK-3β、p-GSK-3β及胰腺十二指肠同源盒-1(pancreatic duodenal homeobox-1,PDX-1)和肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A(v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homologue A,MafA)蛋白的表达。结果与空白组比较,模型组MIN6细胞活性明显下降,胰岛素分泌水平下降,细胞凋亡率明显升高(P<0.01);与模型组比较,肾气丸加减方低、中、高剂量组细胞活力升高,胰岛素分泌水平升高,细胞凋亡率均降低(P<0.05或P<0.01);各干预组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。与空白组比较,模型组PI3K/p-PI3K、AKT/p-AKT、p-GSK-3β蛋白表达明显下调,GSK-3β蛋白表达上调(P<0.05),PDX-1和MafA蛋白表达明显下调(P<0.01);与模型组比较,肾气丸加减方中、高剂量组PI3K/p-PI3K、AKT/p-AKT、p-GSK-3β蛋白表达均明显上调(P<0.05或P<0.01),GSK-3β蛋白表达明显下调(P<0.01);PDX-1和MafA蛋白表达明显上调(P<0.01);加入通路阻滞剂LY294002后肾气丸加减方上述作用被抵消(P<0.05或P<0.01)。结论肾气丸加减方可提高糖脂毒性作用下MIN6细胞活力,减轻细胞凋亡,促进胰岛素分泌,以中、高剂量效果较佳,其机制可能与激活PI3K/AKT/GSK-3β信号通路、抑制GSK-3β的表达有关,进而升高PDX-1和MafA的蛋白表达,恢复胰岛β细胞功能。

染色体盒蛋白同源物3和P53在甲状腺乳头状癌中的表达及其临床意义

目的研究染色体盒蛋白同源物3(CBX3)和p53在甲状腺乳头状癌(PTC)和癌旁组织中的表达及其临床意义。方法选取手术切除PTC标本60例,同时选取同期距离肿瘤至少2cm的相应癌旁组织作为对照,采用免疫组化En vision法检测PTC和相应癌旁组织中CBX3和p53的表达情况。结果CBX3在PTC和癌旁组织中阳性表达率分别为82.67%和20.00%,癌组织中表达明显高于癌旁组织(P<0.05)。p53在PTC组织中阳性表达率为78.67%,显著高于癌旁组织的10.67%(P<0.05)。CBX3表达与包膜侵犯、淋巴结转移及临床分期有关(P<0.05)。p53表达与淋巴结转移及临床分期有关(P<0.05)。PTC组织中CBX3表达与p53表达呈正相关(r=0.341,P<0.05)。结论CBX3和p53蛋白表达上调可能是PTC的发生、发展的促进因素。

乳腺癌组织中EZH2、SOX4蛋白表达变化及其意义

目的探讨乳腺癌组织中果蝇zeste基因增强子的人类同源物2(EZH2)、Y染色体性别决定区相关高迁移率盒蛋白4(SOX4)蛋白表达变化及其临床意义。方法选择97例乳腺癌患者的乳腺癌组织标本为观察组,癌旁正常组织标本为对照组,采用免疫组化SP法检测两组标本中的EZH2、SOX4蛋白,分析乳腺癌组织EZH2、SOX4蛋白表达与乳腺癌患者临床病理参数的关系。用Kaplan-Meier法绘制患者生存曲线,比较EZH2蛋白阳性、阴性表达者及SOX4蛋白阳性、阴性表达者的累积生存率和总生存时间。结果观察组、对照组EZH2蛋白表达阳性率分别为80.41%(78/97)、48.45%(47/97),两组相比,P<0.05;SOX4蛋白阳性表达率分别为82.47%(80/97)、57.73%(56/97),两组相比,P<0.05。乳腺癌组织中EZH2蛋白表达与患者的年龄、肿瘤大小、TNM分期均无关(P均>0.05),与淋巴结转移和分化程度相关(P均<0.05);乳腺癌组织中SOX4蛋白表达与患者的年龄、肿瘤大小、TNM分期、分化程度均无关(P均>0.05),与淋巴结转移相关(P<0.05)。Spearman秩相关检验结果显示乳腺癌组织EZH2、SOX4蛋白表达呈显著正相关(γs=0.251,P=0.013)。患者随访13~71个月,中位随访时间44个月。EZH2蛋白表达阴性、阳性者累积生存率分别为89.47%(17/19)、65.38%(51/78),总生存时间分别为(67.14±2.62)、(54.30±2.30)个月,EZH2蛋白表达阴性、阳性者累积生存率和总生存时间相比,P均<0.05。SOX4蛋白表达阴性、阳性者累积生存率分别为94.41%(16/17)、65.00%(52/80),总生存时间分别为(68.75±2.15)、(54.35±2.27)个月,SOX4蛋白表达阴性、阳性者累积生存率和总生存时间相比,P均<0.05。结论乳腺癌组织EZH2、SOX4蛋白阳性表达率高于癌旁正常组织。检测乳腺癌组织EZH2、SOX4蛋白有助于判断患者病情和预后。

SMAD6在Aβ诱导的神经毒性病变中的表达变化

目的探讨母抗Dpp小同源物6(small mothers against decapentaplegic homolog 6,SMAD6)在β淀粉样蛋白(amyloidβ,Aβ)诱导的神经毒性病变中的表达变化。方法取孕15~17d的SD大鼠的胎鼠,进行海马神经元原代培养,经不同浓度(10、15、20μmol/L)Aβ25-35毒性片段处理后,通过定量PCR技术检测SMAD6mRNA表达水平。取2月龄SD雄性大鼠12只,随机分为Aβ注射组和空白对照组,每组6只。采用双侧基底前脑注射Aβ1-40建立大鼠痴呆模型,通过免疫组化及免疫印迹检测基底前脑及海马区SMAD6蛋白表达水平。结果不同浓度Aβ25-35处理组海马神经元内SMAD6mRNA表达均较对照组减少(F=602.1,P<0.01)。免疫组化结果显示,与对照组比较,Aβ1-40注射组大鼠基底前脑区SMAD6蛋白表达减少(68103±1520比96036±1804;t=20.51,P<0.01),而海马区其表达增多(96441±1852比55039±1528;t=29.87,P<0.01);免疫印迹结果显示,与对照组比较,Aβ1-40注射组大鼠基底前脑区SMAD6蛋白表达减少(0.1042±0.0067比1.000±0.0986;t=15.69,P<0.01),而海马区其表达增多(12.5525±2.6803比1.000±0.0135;t=7.465,P<0.01)。结论 Aβ可直接下调神经元内SMAD6mRNA转录及表达,不同脑区内SMAD6蛋白表达可能受负反馈调节机制影响。

PTEN调节神经样细胞微管相关蛋白tau的聚集及意义

目的观察体外诱导成人骨髓基质干细胞(BMSC)向神经细胞分化过程中,在第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物基因(PTEN)调节细胞骨架中轴突标志分子微管相关蛋白tau(MAPT)分布及聚集的特征,并探讨其意义。方法从成人骨髓中分离基质干细胞,在体外经细胞因子诱导分化2周后成为神经样细胞,将未分化的BMSC作为对照组;应用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法研究MAPT的表达变化;经PTEN抑制剂BPV作用于该细胞后,用结合有荧光剂的鬼笔环肽直接染色细胞微丝肌动蛋白,并联合用免疫荧光细胞化学方法染色MAPT,在激光共聚焦显微镜下观察MAPT和肌动蛋白的定位及关联性。结果成人骨髓来源的基质干细胞经诱导分化后,MAPT的m RNA在分化1周和2周时相对表达水平为0.24±0.04和0.52±0.04,高于对照组BMSC的0.04±0.02(P<0.05)。MAPT蛋白表达水平分别为0.18±0.03和0.44±0.05,高于对照组0.06±0.04(P<0.05)。细胞染色后,经BPV作用后MAPT由弥散状态变为聚集状态,并分布于细胞一侧,神经样细胞开始出现极性。结论 BMSC来源的神经细胞分化成熟时,PTEN参与调节细胞骨架中轴突标志分子MAPT的转运和聚集,为神经细胞的轴突进一步生长提供物质支持。

过表达CBX7调控PTEN/Akt信号通路干预上皮-间充质转化抑制胃癌细胞迁移、侵袭

目的探讨染色体盒蛋白同源物7(CBX7)对胃癌细胞上皮-间充质转化(EMT)、迁移、侵袭的影响及相关作用机制。方法将CBX7过表达质粒和阴性对照质粒、CBX7 siRNA和阴性对照siRNA转染至体外培养的人胃癌细胞SGC7901。采用qRT-PCR和Western blot法检测细胞中CBX7的mRNA和蛋白表达,CCK-8法检测细胞增殖情况,细胞划痕实验检测细胞迁移情况,Transwell小室检测细胞侵袭情况,Western blot法检测细胞中EMT相关蛋白和磷酸酶张力蛋白同源物基因(PTEN)/蛋白激酶B(Akt)信号通路相关蛋白表达。结果与pcDNA-NC组比较,pcDNA-CBX7组SGC7901细胞存活率、迁移率及侵袭数均显著下降/减少,细胞中E-钙黏蛋白(E-cadherin)、PTEN蛋白表达量均显著升高,N-钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)蛋白表达量、p-Akt/Akt均显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与si-NC组比较,si-CBX7组SGC7901细胞存活率、迁移率及侵袭数均显著升高/增加,细胞中E-cadherin、PTEN蛋白表达量均显著下降,N-cadherin、Vimentin蛋白表达量和p-Akt/Akt均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论过表达CBX7可通过抑制EMT进程抑制胃癌细胞迁移、侵袭,其作用机制可能与调控PTEN/Akt信号通路有关。

尾静脉注射miR-214抑制剂对小鼠急性肺损伤的预防作用

目的观察尾静脉注射微小RNA(miR)-214抑制剂对小鼠急性肺损伤(ALI)的预防作用,并探讨其可能作用机制。方法健康雄性C57BL/6小鼠30只随机分为3组对照组、模型组、干预组,每组10只。模型组、干预组小鼠通过气道向其肺内注入脂多糖建立ALI小鼠模型,对照组小鼠切开颈部皮肤分离暴露气管后,行气管穿刺向支气管内缓慢滴注等量生理盐水。干预组小鼠制备ALI模型前3 d开始予尾静脉注射miR-214抑制剂antagomiR-214(80 mg/kg),1次/d,连续注射3 d;模型组和对照组予尾静脉注射等量生理盐水。培养24 h处死三组小鼠,留取肺组织和支气管肺泡灌洗液(BALF),二喹啉甲酸(BCA)蛋白测定法和细胞计数器板分别统计BALF中蛋白含量和细胞总数;利用肺湿质量/干质量(W/D)比值和苏木精-伊红染色评价肺组织损伤的程度;ELISA检测BALF和肺组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β和IL-6的含量;实时荧光定量PCR法检测肺组织miR-214;Western blotting测定肺组织10号染色体上缺失的磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)蛋白。结果与对照组比较,模型组BALF蛋白含量和细胞总数、肺损伤病理评分、W/D比值、肺组织miR-214相对表达量、肺组织和BALF中的TNF-α、IL-1β和IL-6含量均升高,肺组织PTEN蛋白相对表达量降低(P均<0.05)。与模型组比较,干预组BALF蛋白含量和细胞总数、肺损伤病理评分、W/D比值、肺组织miR-214相对表达量、肺组织和BALF中的TNF-α、IL-1β和IL-6含量均降低,肺组织PTEN蛋白相对表达量升高(P均<0.05)。结论下调miR-214表达可预防小鼠ALI,其机制可能与其促进PTEN蛋白的相对表达量有关。

三例矮小同源盒基因杂合性缺失致胎儿骨骼发育异常的产前诊断

目的探讨骨骼发育异常胎儿基因型与产前超声表型的关系，以及产前诊断和咨询方法。方法2016年5月至2017年11月，因产前超声检查发现胎儿结构异常，至同济大学附属第一妇婴保健院胎儿医学部行单核苷酸多态性微阵列芯片（singlen ucleotidepolymor phismarray。SNP-array）检测的孕妇中3例胎儿（胎儿1和3为单胎，胎儿2为双胎之一）诊断为矮小同源盒（short stature homeobox，SHOX）基因杂合性缺失，纳人分析。3例胎儿及其双亲，行SNP-array检测，确定胎儿染色体微缺失情况及其来源。结果3例胎儿均于孕中期超声检查提示骨骼发育异常，股骨、肱骨、胫骨、腓骨、尺骨及桡骨均小于该孕周的第5百分位。3例胎儿羊水染色体核型均未见异常，SNP-array结果显示x或Y染色体短臂末端区域1～2．5Mb的杂合性缺失，缺失区域均包含SHOX基因，3例胎儿的骨骼发育异常均由SHOX基因单倍剂量不足造成。双亲外周血SNP-array检测显示胎儿1和3的微缺失遗传自其母亲，胎儿2的微缺失遗传自其父亲。经遗传咨询，3例孕妇中2例选择终止妊娠，1例（双胎妊娠之一胎儿骨骼异常）行选择性减胎术。结论产前超声结合SNP-array检测可以快速有效地诊断由SHOX基因杂合性缺失造成的遗传性骨病，有助于产前咨询。

甲状腺乳头状癌中PBX3和PTEN的表达及其临床意义

目的探讨前B细胞白血病同源盒基因3(PBX3)和第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因(PTEN)在甲状腺乳头状癌(PTC)中的表达及其临床意义。方法选取2017年1月至2018年1月在台州市中心医院(台州学院附属医院)住院行手术切除和石蜡包埋的PTC标本80例,选取癌旁正常甲状腺组织(距离肿瘤≥2 cm)30例作为对照。应用免疫组化En Vision二步法检测PTC和癌旁组织中PBX3和PTEN蛋白的表达情况,分析PTC不同临床病理特征与PBX3和PTEN表达的关系及两者蛋白表达的相关性。结果PTC组织中PBX3阳性表达率为73.75%,高于癌旁组织的16.67%,差异有统计学意义(P<0.05);PTC组织中PTEN阳性表达率为35.00%,低于癌旁组织的83.33%,差异有统计学意义(P<0.05)。包膜侵犯、淋巴结转移和Ⅲ~Ⅳ期的PTC组织中PBX3阳性表达率分别高于无包膜侵犯、无淋巴结转移和Ⅰ~Ⅱ期的PTC组织,差异均有统计学意义(均P<0.05)。包膜侵犯、淋巴结转移和Ⅲ~Ⅳ期的PTC组织中PTEN阳性表达率分别低于无包膜侵犯、无淋巴结转移和Ⅰ~Ⅱ期的PTC组织,差异均有统计学意义(均P<0.05)。PTC组织中PBX3、PTEN蛋白表达呈负相关(r=-0.337,P<0.05)。结论PTC组织中PBX3高表达,而PTEN低表达,两者表达呈负相关,且与PTC的包膜侵犯、淋巴结转移和临床分期密切相关,表明PBX3和PTEN异常表达可能在PTC发生、侵袭、转移的过程中起作用。

PTEN和S6K1在Ⅰ型子宫内膜癌中的表达及意义

目的探讨子宫内膜癌组织中10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物(PETN)和核糖体蛋白S6激酶-1(S6K1)的表达情况及其临床意义。方法选择2013年1月至2015年6月徐州医科大学附属医院及徐州市中心医院妇科行手术治疗的患者在病理科存档的组织蜡块,标本中子宫内膜癌组织65例,子宫内膜不典型增生组织30例,良性增生的子宫内膜组织30例,用免疫组化法分别检测PTEN、S6K1在不同内膜组织中的表达情况,分析两者的表达与子宫内膜癌患者各临床病理特征的相关性;对所有子宫内膜癌患者进行术后随访,采用Kaplan-Meier法进行生存分析,Cox比例风险回归模型分析子宫内膜癌患者预后的影响因素。结果(1)PTEN在子宫内膜癌组织中的阳性表达率低于正常子宫内膜组织及不典型增生子宫内膜组织(P<0.05);S6K1在子宫内膜癌组织中的阳性表达率较不典型增生子宫内膜组织、正常子宫内膜组织均增高(P<0.05)。(2)不同年龄及FIGO分期、是否淋巴结转移子宫内膜癌组织中的PTEN表达差异无统计学意义(P>0.05)。浸润深度为≥1/2肌层的PTEN阳性表达率(27.3%)显著低于无或<1/2组(59.4%),低-中分化的PTEN阳性表达率(23.3%)显著低于高分化组(60.0%)。不同年龄、不同肌层浸润深度子宫内膜癌组织S6K1阳性表达率差异无统计学意义(P>0.05)。Ⅱ~Ⅳ期、低-中分化及有淋巴结转移的S6K1阳性表达率(分别为72.4%、76.7%、81.3%)显著高于Ⅰ期、高分化及无淋巴结转移者(47.2%、42.9%、51.0%)。(3)Kaplan-Meier生存分析显示,PTEN阴性表达患者的平均生存时间短于阳性表达患者(P<0.05);S6K1阳性表达患者的平均生存时间短于阴性表达患者(P<0.05)。(4)Cox回归分析显示FIGO分期、病理分化程度、肌层浸润深度、淋巴结转移及PTEN、S6K1的表达是子宫内膜癌患者预后影响因素(P<0.05,P<0.01),其中FIGO分期、淋巴结转移及PTEN、S6K1的表达是影响子宫内膜癌预后的独立影响因素(P<0.05,P<0.01)。结论在子宫内膜癌组织中,PTEN的阴性表达和S6K1的阳性表达与子宫内膜癌的发生、发展及预后相关。

发现抑制胃癌的重要基因

上海交通大学医学院附属瑞金医院首次发现5号染色体短臂上的同源盒基因IRX1对抑制胃癌细胞具有重要作用，该研究或成为胃癌诊断新型分子标志物的重要线索。IRX1的活性丢失可导致胃癌细胞增殖与侵袭能力增加，而通过转基因技术将该基因导入胃癌细胞后，无论是体外培养的胃癌细胞，还是小鼠活体内的肿瘤细胞，其恶性增殖与侵袭能力均受到明显抑制。