染色体-质粒平衡致死系统的构建及应用

以营养选择标志代替抗生素抗性标志为主要特征的染色体-质粒平衡致死系统的建立为基因工程产品的生产和基因治疗提供了更为安全,有效的操作平台。通过质粒载体基本元件与宿主菌之间的优化,构建出用于不同目的的外源基因的平衡致死系统。它对构建单价或多价减毒活菌苗起到了至关重要的作用;随着基因疫苗研究的深入,使它具有更为广阔的应用前景。本文着重讨论目前该系统的构建方法和应用。

基于thyA基因的大肠杆菌染色体-质粒平衡致死系统的构建与应用

将大肠杆菌DH5α在含胸腺嘧啶核苷和三甲氧苄二氨嘧啶的琼脂平板上培养,获得了遗传稳定的ThyA-大肠杆菌DH5α21株。用PCR扩增野生菌和ThyA-大肠杆菌的thyA基因,将测定的序列与野生型thyA基因相比,6号突变株的thyA基因第92位碱基发生G→A转换,导致第31位甘氨酸被天冬氨酸替换,4、7和13号突变株的thyA基因从第73位连续缺失6个碱基,导致第25位甘氨酸和第26位苏氨酸缺失。经PCR扩增的包括启动子在内的鼠伤寒沙门菌thyA基因与野生型大肠杆菌DH5αthyA基因的同源性为86%。以鼠伤寒沙门菌thyA基因为选择标记,构建了含人溶菌酶基因的真核表达载体pDTALYZ,以ThyA-大肠杆菌为受体菌,构建了染色体-质粒平衡致死系统。在相同条件下,pDTALYZ转化ThyA-大肠杆菌的效率高于以卡那霉素抗性基因为选择标记的pcDNAKLYZ转化野生大肠杆菌的效率;在发酵培养过程中,两种重组菌的生长速率相似,质粒丢失率分别为25%和10%,湿菌重分别为57.68 g/L和51.00g/L,重组质粒产量分别为134.9 mg/L和135.0 mg/L。

通过大肠杆菌thyA染色体质-粒平衡致死系统构建无抗性基因表达载体

克隆了大肠杆菌和霍乱弧菌胸腺嘧啶合成酶基因thyA ,并以pcDNA3质粒为基础 ,分别用两种来源的thyA基因替代其氨苄抗性基因Amp,构建了不含抗性基因 ,且可在thyA营养缺陷型大肠杆菌中基于染色体 质粒平衡致死系统稳定传代的真核表达载体。该载体可有效表达红色荧光蛋白报告基因。

鸡白痢沙门菌C79-13ΔcrpΔasd平衡致死系统的构建及其生物学特性的研究

目的:为了研制更加安全的鸡白痢沙门菌弱毒株,并将其开发为疫苗活载体。方法:本研究构建了鸡白痢沙门菌C79-13ΔcrpΔasd缺失株。双基因缺失株的构建是以含有重组自杀性质粒pREΔasd的大肠杆菌χ7213为供体菌,C79-13Δcrp为受体菌进行接合转移,两步法筛选crp/asd基因双缺失突变株。结果:PCR及测序结果表明C79-13ΔcrpΔasd构建成功。进一步研究表明,该缺失株的生长需要外源的二氨基庚二酸(DAP),且能稳定遗传缺失的asd基因,与亲本株C79-13相比,其血清型未发生变化,但其生长速度明显减慢,毒力明显降低。结论:C79-13ΔcrpΔasd双缺失株可接受asd+质粒作为宿主平衡致死系统高效稳定地表达外源基因,并为研制安全有效的鸡白痢沙门菌疫苗弱毒株以及进一步将其开发为适于黏膜免疫的口服活载体疫苗奠定了基础。

减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)宿主-载体平衡致死系统的构建及其生物学特性研究

目的:开发应用于猪的稳定携带异源基因的口服活疫苗载体。方法:本研究在减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcya C78-1的基础上,运用自杀性质粒pREasd介导的细菌同源重组技术,构建缺失株ΔcrpΔcyaΔasd C78-1,再将携带asd基因的互补质粒p YA3493电转至上述菌株,构建ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493)宿主-载体平衡致死系统,并进一步研究其生物学特性。结果:PCR及测序结果共同表明ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493)构建成功。生物学特性检测结果表明ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493)的血清型与亲本株ΔcrpΔcya C78-1和疫苗株C500相同,并能够稳定遗传缺失型asd基因片段;其生长速度略慢于ΔcrpΔcya C78-1,且二者均明显慢于疫苗株C500;其生化特性结果也与ΔcrpΔcya C78-1基本相同。小鼠口服攻毒试验表明ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493)的毒力与ΔcrpΔcya C78-1基本相当,但其半数致死量约为疫苗株C500的412倍。结论:上述结果表明,减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493)有潜力作为高效表达外源基因的口服活疫苗载体。

减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔsseK1Δasd宿主-载体平衡致死系统的构建及其生物学特性研究

目的:为构建减毒鼠伤寒沙门菌分泌性蛋白K1缺失株平衡致死系统,并将其开发为能够稳定携带外源基因的活疫苗载体。方法:利用重组自杀性质粒(pREΔasd)介导的等位基因交换技术,以减毒鼠伤寒沙门菌株SL1344Δsse K1为亲本株,运用二步法筛选asd基因缺失株SL1344Δsse K1Δasd。将携带有asd基因的无抗性p YA3493质粒电转至上述缺失菌株SL1344Δsse K1Δasd,构建SL1344Δsse K1Δasd(p YA3493)重组菌株。结果:PCR及测序结果表明SL1344Δsse K1Δasd(p YA3493)构建成功。进一步研究表明重组菌株SL1344Δsse K1Δasd(p YA3493)血清型和强毒株SL1344及亲本株SL1344Δsse K1相同,且能稳定遗传缺失后的asd基因;其生化特性和生长速度与强毒株SL1344及亲本株SL1344Δsse K1相比均无明显差异。小鼠毒力试验表明,SL1344Δsse K1Δasd(p YA3493)口服感染6周龄BALB/c小鼠的LD50为5.24×108CFU,毒力较强毒株SL1344约下降至0.048%;免疫保护效力试验显示,运用鼠伤寒沙门菌野生毒株对免疫后第17天的小鼠攻毒有62.5%的保护率,与亲本株SL1344Δsse K1基本一致。结论:以上结果表明,鼠伤寒沙门菌分泌性蛋白K1缺失株宿主-载体平衡致死系统构建成功,且遗传稳定,毒力明显降低,具有较好的免疫原性,为深入研究以鼠伤寒沙门菌为载体的口服多价疫苗奠定基础。

减毒猪霍乱沙门菌△cya△asdC78-1宿主-载体平衡致死系统的构建及其生物学特性研究

为研制能够稳定携带外源基因的猪霍乱沙门菌口服活疫苗载体,本研究在减毒猪霍乱沙门菌△cyaC78-1基础上,利用自杀性质粒介导的等位交换技术,构建了△cya△asdC78-1宿主-载体平衡致死系统,并对其生物学特性进行了鉴定。PCR及测序结果表明△cya△asdC78-1构建正确,其生物学特性检测结果显示△cya△asdC78-1生化特性与△cyaC78-1完全相同,血清型与△cyaC78-1和疫苗株C500相同,并且具有稳定的遗传特性;其生长速度与△cya C78-1基本相同,均明显慢于疫苗株C500。动物试验表明△cya△asdC78-1电转化携带asd基因的互补质粒pYA3493后,其毒力比△crp△asdC78-1(p YA3493)降低1.14倍,比△asdC500(pYA3493)降低了5.1倍。以上结果表明,减毒猪霍乱沙门菌△cya△asdC78-1同样可以作为口服活疫苗载体用于高效表达外源基因,为开发以C78-1为基础的口服多价疫苗载体奠定了基础。

鼠伤寒沙门菌SL1344株侵袭性蛋白B缺失株asd平衡致死系统的构建及特性的研究

目的:为研究用于能够稳定携带外源基因的口服活疫苗载体。方法:本研究以减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔsipB为研究对象,利用自杀性质粒pREΔasd介导的细菌同源重组技术,构建SL1344ΔsipBΔasd宿主-载体平衡致死系统,并进一步研究其生物学特性。结果:PCR及测序结果表明SL1344ΔsipBΔasd构建成功。生物学特性结果表明SL1344ΔsipBΔasd的血清型与SL1344ΔsipB相同,并能够稳定遗传缺失后的asd基因;其生长速度和生化特性与亲本株SL1344基本相同,并且该缺失株仍然具有运动性的能力,小鼠攻毒试验表明SL1344ΔsipBΔasd电转了携带asd基因的互补质粒pYA3493后,其毒力较亲本菌株SL1344约降低至1.4%。结论:以上结果证明,减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔsipBΔasd菌株构建成功,为深入研究以鼠伤寒沙门菌为载体的口服多价疫苗奠定基础。

载体—宿主平衡致死系统在减毒伤寒沙门氏活菌苗中的应用

伤寒沙门氏菌能通过粘附、侵袭、定居在肠道相关淋巴组织，并经肠系膜淋巴结到达肝脏、脾脏，进一步有效地刺激机体产生粘膜、细胞和体液免疫应答。近几年，常以减毒伤寒沙门氏菌为载体构建双价、多价活菌苗，成为新型菌苗研制的重要途径之一。为避免在基因工程活菌苗的研制中使用抗药基因作为选择压，将载体一宿主平衡致死系统应用于减毒伤塞沙门氏活菌疫苗中，使在没有抗菌素存在的情况下，外源保护性抗原能在减毒伤寒沙门氏菌中稳定表达。

集胞藻PCC6803染色体上relNEs(ssr1114/slr0664)TA系统的反馈调控作用

细菌染色体上的毒素-抗毒素(toxin-antitoxin,TA)系统通过转录水平和转录后水平调控毒素活性,从而控制细胞的生长速度和死亡,使细菌适应各种环境胁迫。为了证明集胞藻PCC 6803染色体上relNEs TA系统的转录调控,构建了以无启动子的β-半乳糖苷酶(lacZ)基因为报告基因的重组质粒,并测定含转录融合重组质粒的大肠杆菌细胞的β-半乳糖苷酶活性。结果表明,抗毒素RelN能显著抑制relNEs启动子的转录活性,而毒素RelEs能部分减弱这种抑制作用,提示relNEs系统的编码产物对该操纵子具有反馈调控作用。

霍乱弧菌以thyA基因为选择压力的染色体质粒致死平衡系统的构建

目的 为构建霍乱弧菌口服活疫苗提供稳定实用的载体系统。方法 在改良MM基本培养基的基础上 ,建立了霍乱弧菌thyA基因突变菌株的筛选方法 ,继而用PCR插入法克隆了大肠杆菌thyA基因全序列 (pXXB10 6 ) ,并电击转化入霍乱弧菌thyA基因缺陷株 (PL10 2 ) ,使后者在MM改良培养基上的生长恢复为野生状态。结果 选育出的thyA基因突变的霍乱弧菌IEM10 1菌株PL10 2突变性状及生物学性状基本稳定。进而构建了以thyA基因为选择压力的霍乱弧菌染色体 质粒致死平衡系统。结论 构建成的抗原呈递系统作为构建肠道疫苗的受体菌株是稳定的 ,也是适用的。

猪霍乱沙门氏菌C78-1株ΔcrpΔasd缺失株平衡致死载体系统的构建及生物学特性研究

为开发减毒猪霍乱沙门氏菌的活疫苗载体,通过自杀性质粒介导的细菌同源重组技术,构建了猪霍乱沙门氏菌C78-1株ΔcrpΔasd双基因缺失株,并对其生物学特性进行探讨。首先构建含有缺失1 488bp asd基因的重组自杀性质粒pREΔasd,然后与已构建完成的ΔcrpC78-1缺失株进行接合转移,采用两步法筛选无抗性的C78-1的ΔcrpΔasd双缺失株。PCR鉴定结果表明,C78-1的ΔcrpΔasd双缺失株构建成功;进一步研究表明,该缺失株的生长需要外源的二氨基庚二酸(DAP),且能稳定遗传缺失的asd基因,与C78-1相比,其血清型未发生变化,但其生长速度明显减慢。ΔcrpΔasd C78-1双缺失株可接受asd+质粒作为宿主平衡致死系统高效稳定地表达外源基因,为开发以C78-1为载体的口服多价疫苗奠定了基础。

肠毒素大肠杆菌定居因子CS6抗原基因在痢疾杆菌中的表达

通过体外重组的方法 ,将asd基因插入重组表达质粒 ,使抗生素抗性失活 ,并与弗氏志贺氏菌FWL0 1构成宿主 载体平衡致死系统 .通过蛋白质印迹结果表明 ,在没有抗生素条件选择的情况下 ,可稳定表达肠毒素大肠杆菌定居因子抗原CS6 .重组菌通过口服和鼻饲免疫小鼠后 ,可以诱生CS6血清IgG抗体 ;同时可以检测到分泌型IgA产生 ,表明重组菌可以诱导相应的黏膜免疫反应 .

口服鼠疫F1-V重组融合蛋白活菌疫苗的构建及免疫效果的初步研究

鼠疫耶尔森菌能产生很多由染色体或质粒编码的毒力因子，包括pgm、pst、Yops、F1抗原、V抗原等。F1和V抗原已被证实为主要保护性抗原，且存在属间保守性，F1-V融合抗原分子在免疫原性和免疫保护性上具有叠加效应，将两者联合接种可保护小鼠抵抗109峨强度攻击。在鼠疫杆菌基因组、蛋白组和功能基因组研究的基础上，F1和V是鼠疫新型疫苗研究首选的保护性抗原分子的靶标。现有鼠疫死菌苗和鼠疫活菌苗在剂型和接种方式没有黏膜保护作用，可能会因此影响疫苗的保护效果。沙门菌可有效提呈抗原到肠道的免疫系统，在肠道组织、肝脏中增殖，可持续诱导机体细胞、体液免疫和黏膜免疫。本实验通过含有asd基因的重组质粒与缺失asd基因的减毒沙门菌构成的宿主-载体平衡致死系统，在无抗生素选择压力的条件下在载体菌株中稳定表达鼠疫F1-V融合抗原蛋白，以重组菌灌胃法黏膜途径免疫小鼠检测其免疫原性，尝试研究预防肺鼠疫的口服活载体疫苗。

肠毒素性大肠杆菌菌毛抗原CS6和霍乱毒素B亚基在人伤寒沙门菌中的共表达及其免疫学效果观察

目的 :构建表达肠毒素性大肠杆菌菌毛抗原基因CS6和霍乱毒素B亚基 (CTB)基因的细菌性腹泻基因工程多价疫苗。方法 :以基因工程减毒的人伤寒沙门菌为抗原载体 ,利用基于asd基因功能互补的宿主染色体_质粒平衡致死表达系统 ,实现了在没有抗生素选择压力的条件下 ,CS6和CTB在人伤寒沙门菌中的稳定表达。结果与结论 :检测结果表明 ,CS6和CTB的表达虽对宿主菌的生长有一定影响 ,但经过一段时间的培养 ,重组菌株仍可达到高密度生长。动物免疫结果显示 ,重组菌株在家兔体内均可诱生相应抗体 ,但从诱生的抗体效价、抗体持续时间方面评价 ,单独表达CS6与CTB的重组菌株的免疫学效果均好于两者共表达的重组菌株 ,提示在以后的疫苗研究实践中 ,可以考虑将分别表达CS6与CTB的重组菌株按一定比例混合 ,组成联合疫苗 ,用于细菌性腹泻的免疫预防。本研究结果对于细菌性腹泻基因工程多价疫苗的构建有指导意义。