染色盒同源物3对人结直肠癌细胞增殖的影响及其机制研究

目的探讨染色盒同源物3(CBX3)在结直肠癌组织和细胞中的表达,及其对结直肠癌细胞增殖能力的影响,并初步探讨其机制。方法运用生物信息学方法对CBX3的表达情况、生存期以及共表达网络进行分析。应用免疫组织化学染色法检测CBX3在结直肠癌组织和配对癌旁组织中的差异表达。应用Western blot检测正常结肠上皮细胞NCM460以及结直肠癌细胞HCT116、HT29、SW620中CBX3的表达水平。将CBX3过表达质粒和特异性小干扰分别转染至HCT116细胞中,采用磺酰罗丹明B(SRB)染色实验和克隆形成实验检测细胞的增殖能力。应用转录组测序技术检测差异表达基因。应用qRT-PCR及Western blot实验对差异基因进行验证。应用生物信息学方法对差异基因及CBX3进行相关性分析。结果生物信息学分析显示CBX3在结直肠癌组织中表达高于癌旁组织(P<0.001),CBX3高表达组患者无病生存期低于低表达组(P<0.05),CBX3对转录组的影响广泛且复杂。CBX3在结直肠癌组织中表达高于配对癌旁组织(P<0.0001)。CBX3在结直肠癌细胞中表达高于正常结肠上皮细胞(P<0.01)。SRB实验及克隆形成实验证实,过表达CBX3增强了HCT116细胞的增殖能力,敲低CBX3增殖能力降低(P<0.01)。转录组测序结果显示,敲低CBX3后,CCAAT/增强子结合蛋白delta(CEBPD)mRNA表达升高(P<0.001),蛋白表达相应升高(P<0.05),且两者存在负性相关(P<0.001,R=-0.2)。结论CBX3在结直肠癌组织及细胞中高表达,能够在体外促进细胞增殖。CBX3可能通过抑制CEBPD转录因子的表达来发挥促癌作用。

CircCDR1as调节miR-671-5p/CBX4轴对NSCLC细胞生物学行为的影响

目的探讨环状RNA(CircRNA)反义小脑变性相关蛋白1转录本(CircCDR1as)通过调节miR-671-5p/染色盒同源物4(CBX4)轴对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。方法体外培养人NSCLC细胞株(NCI-H524、NCI-H1734、Calu-3和A549)和人支气管上皮样细胞(HBE)。A549细胞分成Control组、si-NC组、si-CircCDR1as组、si-CircCDR1as+anti-miR-NC组、si-CircCDR1as+anti-miR-671-5p组、pcDNA组、CircCDR1as组、miR-NC组、miR-671-5p组、miR-671-5p+pcDNA组、miR-671-5p+CBX4组、anti-miR-NC组和anti-miR-671-5p组。采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测CircCDR1as、miR-671-5p和CBX4 mRNA表达。Western blot检测CBX4蛋白表达。分别采用四甲基偶氮唑盐(MTT)、克隆形成实验、流式细胞术和Transwell检测细胞活力、增殖、凋亡、迁移和侵袭。通过双荧光素酶报告基因检测验证miR-671-5p与CircCDR1as或CBX4之间的靶向关系。结果与HBE细胞相比,CircCDR1as和CBX4在4种NSCLC细胞中表达升高,miR-671-5p表达降低(P<0.05)。与si-NC组比较,si-CircCDR1as组A549细胞活力和克隆形成数显著降低,细胞迁移和侵袭数目减少,凋亡率增高(P<0.05)。miR-671-5p作为CircCDR1as的靶点,其下调减弱了CircCDR1as沉默对NSCLC进展的调控作用(P<0.05)。miR-671-5p靶向CBX4在体外抑制NSCLC的恶性进展(P<0.05)。沉默CircCDR1as可通过上调miR-671-5p水平降低CBX4的表达(P<0.05)。结论CircCDR1as沉默可通过上调miR-671-5p和下调CBX4表达来抑制细胞增殖、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡。

过表达CBX7调控PTEN/Akt信号通路干预上皮-间充质转化抑制胃癌细胞迁移、侵袭

目的探讨染色体盒蛋白同源物7(CBX7)对胃癌细胞上皮-间充质转化(EMT)、迁移、侵袭的影响及相关作用机制。方法将CBX7过表达质粒和阴性对照质粒、CBX7 siRNA和阴性对照siRNA转染至体外培养的人胃癌细胞SGC7901。采用qRT-PCR和Western blot法检测细胞中CBX7的mRNA和蛋白表达,CCK-8法检测细胞增殖情况,细胞划痕实验检测细胞迁移情况,Transwell小室检测细胞侵袭情况,Western blot法检测细胞中EMT相关蛋白和磷酸酶张力蛋白同源物基因(PTEN)/蛋白激酶B(Akt)信号通路相关蛋白表达。结果与pcDNA-NC组比较,pcDNA-CBX7组SGC7901细胞存活率、迁移率及侵袭数均显著下降/减少,细胞中E-钙黏蛋白(E-cadherin)、PTEN蛋白表达量均显著升高,N-钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)蛋白表达量、p-Akt/Akt均显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与si-NC组比较,si-CBX7组SGC7901细胞存活率、迁移率及侵袭数均显著升高/增加,细胞中E-cadherin、PTEN蛋白表达量均显著下降,N-cadherin、Vimentin蛋白表达量和p-Akt/Akt均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论过表达CBX7可通过抑制EMT进程抑制胃癌细胞迁移、侵袭,其作用机制可能与调控PTEN/Akt信号通路有关。

染色体盒蛋白同源物3和P53在甲状腺乳头状癌中的表达及其临床意义

目的研究染色体盒蛋白同源物3(CBX3)和p53在甲状腺乳头状癌(PTC)和癌旁组织中的表达及其临床意义。方法选取手术切除PTC标本60例,同时选取同期距离肿瘤至少2cm的相应癌旁组织作为对照,采用免疫组化En vision法检测PTC和相应癌旁组织中CBX3和p53的表达情况。结果CBX3在PTC和癌旁组织中阳性表达率分别为82.67%和20.00%,癌组织中表达明显高于癌旁组织(P<0.05)。p53在PTC组织中阳性表达率为78.67%,显著高于癌旁组织的10.67%(P<0.05)。CBX3表达与包膜侵犯、淋巴结转移及临床分期有关(P<0.05)。p53表达与淋巴结转移及临床分期有关(P<0.05)。PTC组织中CBX3表达与p53表达呈正相关(r=0.341,P<0.05)。结论CBX3和p53蛋白表达上调可能是PTC的发生、发展的促进因素。

微小RNA 671 5p对人结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的探讨miR 671 5p对结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及作用机制。方法培养人正常结肠上皮细胞NCM460和结肠癌细胞SW480、SW620、HT29和LOVO,实时荧光定量PCR(RT qPCR)检测miR 671 5p和染色盒同源物4(CBX4)mRNA水平。转染miR 671 5p mimics(miR 671 5p组)、阴性对照(miR NC组)至SW480细胞,四甲基噻唑蓝染色法(MTT)检测细胞增殖,克隆实验检测细胞克隆形成能力,Transwell检测细胞迁移和侵袭,蛋白质印迹法(Western Blot)检测CBX4、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21、基质金属蛋白酶9(MMP 9)、基质金属蛋白酶14(MMP 14)及酪氨酸激酶1/信号转导子与转录激活子3(JAK1/STAT3)信号通路相关蛋白表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证miR 671 5p和CBX4之间靶向关系。结果与NCM460细胞比,结肠癌细胞SW480、SW620、HT29和LOVO中miR 671 5p水平显著降低(P<0.05),CBX4 mRNA水平显著升高(P<0.05)。与miR NC组比,miR 671 5p组SW480细胞培养24、48、72 h后的OD值、克隆形成率、迁移和侵袭细胞数及CyclinD1、MMP 9、MMP 14、p JAK1和p STAT3蛋白水平显著降低(P<0.05),p21蛋白水平显著升高(P<0.05)。miR 671 5p负调控CBX4表达,过表达CBX4降低了miR 671 5p过表达对SW480细胞增殖、迁移和侵袭及JAK1/STAT3信号通路的影响。结论miR 671 5p过表达可抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭,其作用机制与下调CBX4表达、抑制JAK1/STAT3信号通路的激活有关。

TK6人类淋巴母细胞TK突变体生长慢相关基因分离和鉴定

目的:分离TK6人类淋巴母细胞慢生长突变体中与慢生长表型相关的基因并进行初步功能鉴定。方法:根据目标基因与胸苷激酶(Thymicline kinase,TK)基因连锁的特性,采用人类全基因组表达芯片检测全基因的表达情况,由此确定慢生长相关基因的位置和表达性质,以缩小筛选范围,最后通过基因功能检索,确定目标基因,并通过RT-PCR对目标基因进行初步验证。结果:慢生长细胞整体表达水平下调,但少数染色体尤其以17号染色体局部区域呈高表达状态。而在TK位点到端粒这一区域,TK以及毗邻的染色盒同源物(Chromobox homoloy,CBX2),CBX4,CBX8均呈高表达状态,功能检索发现CBX与转录抑制有关,功能验证实验中CBX4表达水平与细胞倍增时间呈正向相关。结论:TK6慢生长表型与17号染色体q臂近端粒位置的CBX基因相关,但仍需更多证据确认CBX是慢生长表现最直接相关的基因。

CBX4和NET-1在原发性直肠癌中的表达变化及临床意义

目的探究染色盒同源物4(CBX4)和新四极体-1(NET-1)在原发性直肠癌中的表达变化及临床意义,并对二者致癌作用的相关性进行分析。方法选取唐山市协和医院2013年4月至2015年7月收治的50例原发性直肠癌患者为研究对象,收集其癌组织及癌旁正常直肠组织,采用免疫组织化学法检测CBX4和NET-1在组织中的表达水平,并分析CBX4和NET-1阳性表达与患者临床病理特征的关系。采用Spearman分析二者在原发性直肠癌组织中表达水平的相关性;采用Kaplan-Meier分析二者表达情况与原发性直肠癌患者生存率的关系;采用多因素Logistic回归分析影响患者预后的危险因素。结果原发性直肠癌患者癌组织中CBX4和NET-1阳性表达率分别为74.00%、68.00%,明显高于癌旁正常组织的28.00%、24.00%,差异均有统计学意义(P<0.05)。原发性直肠癌组织中的CBX4和NET-1表达水平在不同性别、年龄、吸烟、饮酒及肿瘤最大径的患者之间比较,差异均无统计学意义(P>0.05),而在不同TNM分期、有无淋巴结转移、不同分化程度、有无浆膜浸润患者之间比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。CBX4和NET-1在原发性直肠癌组织中的表达水平呈正相关(r=0.647,P<0.05)。术后随访发现患者5年总生存率为32.00%(16/50),CBX4和NET-1高表达患者5年生存率分别为21.62%(8/37)、17.65%(6/34),明显低于CBX4和NET-1低表达患者5年生存率61.54%(8/13)、62.50%(10/16),差异均有统计学意义(P<0.05)。Logistic回归分析表明,TNM分期(Ⅲ~Ⅳ期)、淋巴结转移及CBX4、NET-1表达水平都是影响原发性直肠癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)。结论CBX4和NET-1在原发性直肠癌组织中阳性表达率明显升高,与患者TMN分期、淋巴结转移、分化程度、浆膜浸润相关,且二者在直肠癌组织中的表达水平呈正相关,可能成为评价原发性直肠癌患者预后的临床指标。

去泛素化酶USP29调控CBX6蛋白质稳定性

多梳家族(polycomb group,PcG)是一类控制细胞命运和胚胎发育的转录抑制因子,主要以转录抑制复合物(polycomb repressive complex,PRC)的形式发挥功能。染色体盒蛋白质同源物6(chromobox protein homolog 6,CBX6)是PRC1的核心蛋白质亚基之一,在基因表达调控、细胞更新分化、肿瘤发生发展和干细胞干性维持等方面发挥重要的作用。本研究发现,CBX6通过泛素-蛋白酶体依赖性途径降解,接着利用包含92个去泛素化酶(deubiquitinating enzyme,DUB)基因表达文库进行筛选,发现泛素特异性蛋白酶29(ubiquitin-specific protease,USP29)能够明显地稳定CBX6的蛋白质水平并延长其半衰期(P<0.05);免疫沉淀结果发现,CBX6通过其C-端结构域与USP29发生相互作用;进一步研究发现,USP29通过去泛素化CBX6调控CBX6蛋白质稳定性,且这个过程依赖于USP29本身去泛素化酶活性。细胞增殖结果还发现,USP29能抑制MCF7细胞的增殖(P<0.0001)。综上所述,本研究通过筛选发现,USP29能够通过去泛素化CBX6来稳定CBX6蛋白质水平,且USP29能够抑制MCF7细胞增殖进程。