利用染色质免疫共沉淀技术确定转录因子RIN调控的靶基因

以粉红期番茄果实为材料,用含不同浓度甲醛的缓冲液交联DNA和蛋白质,利用超声波将其染色质随机断裂成大小为200-1 000 bp的片段,用RIN蛋白的特异性抗体免疫沉淀与RIN蛋白结合的DNA片段,然后解交联和纯化DNA片段,最终用普通PCR试验和测序验证与转录因子RIN结合的DNA序列。结果表明,适用于番茄果实的最佳ChIP试验条件为:用1%甲醛溶液交联DNA和蛋白质的复合物;用20%功率,工作6 s,间隔10 s,脉冲3次超声破碎该复合物,可以得到适当大小的片段,用于后续的试验。普通PCR和测序验证结果证明转录因子RIN与LeACS2和LeACS4启动子区域的CArG box序列结合。

基于水稻原生质体的染色质免疫共沉淀技术优化及应用

植物转录因子是植物体内调节基因表达的重要蛋白,参与多种生物学功能的调控。研究植物转录因子调控靶基因的常用方法为染色质免疫共沉淀法(chromatin immunoprecipitation,ChIP),但抗体特异性、遗传材料构建的耗时性等因素却大大限制了ChIP技术的应用范围和效果。本文通过对水稻原生质体瞬时转化、甲醛固定、免疫沉淀核酸的超声波破碎等条件的优化,建立了基于水稻原生质体的染色质免疫共沉淀技术体系(chromatin immunoprecipitation system based on rice protoplasts,ChIP-RP);并通过本技术体系验证了水稻转录因子OsNF-YA4蛋白对靶基因序列的富集作用。本技术体系将减少制备特异性抗体或构建稳定遗传材料的局限,有利于水稻转录因子直接调控靶基因的快速筛选和验证,推动水稻转录因子调控功能的分子机制解析。

染色质免疫共沉淀法对猪链球菌反应调控因子CovR靶基因的筛选

目的猪链球菌CovR是具有全局调控作用的负反应调控因子。文章采用染色质免疫共沉淀(chromatin immu-noprecipitation,ChIP)方法筛选转录调控因子CovR的靶基因,为进一步开展CovR调控机理研究提供条件。方法利用甲醛固定猪链球菌2型05ZYH33菌株活细胞,超声波破碎法将DNA随机断裂成100～500bp大小不同的片段,再利用CovR特异性单抗免疫沉淀该蛋白质-DNA片段解交联并分离纯化DNA。针对8个潜在的靶标基因启动子区设计引物,分别用设计的引物对免疫共沉淀的DNA样品进行PCR扩增,验证CovR与DNA的结合。结果最佳ChIP实验条件为1%甲醛交联DNA与蛋白质的复合物;功率80 W、工作10 s、间隔30 s、超声40次破碎该复合物,可得到100～500 bp大小不同的片段用于后续实验。PCR结果显示SSU1668基因和SSU1732基因启动子区扩增出阳性条带,另外6种基因的启动子区未扩增出阳性条带。结论 CovR抗体免疫沉淀得到的DNA片段中含有SSU1668基因和SSU1732基因启动子区,表明SSU1668基因和SSU1732基因是CovR的靶基因。

染色质免疫共沉淀超声波破碎条件的研究

意在找出拟南芥幼苗适宜的染色质免疫共沉淀(ChIP)超声波破碎的条件,为后期抗体的沉淀提供适当大小的片段。以拟南芥(Columbia ecotype)幼苗为材料,用1%浓度甲醛的缓冲液交联DNA和蛋白质,利用超声波将其染色质随机断裂成适当大小的片段。结果表明,适用于拟南芥幼苗的最佳ChIP试验条件为:用1%甲醛溶液交联DNA和蛋白质的复合物;用65%功率,每次工作20s,间隔4min,8次破碎该复合物,可以得到400～800bp大小的片段,用于后续的试验。经本实验的研究得到了拟南芥幼苗染色质免疫共沉淀超声波破碎的最佳条件,为后续实验奠定了基础。

非交联染色质免疫共沉淀及其二代测序技术建库方法的优化

目的优化非交联染色质免疫共沉淀及其二代测序(Native ChIP-seq)技术,简化操作步骤,得到高质量ChIP-seq数据。方法裂解细胞,MNase切割DNA释放核小体,用组蛋白修饰的特异性抗体将组蛋白与DNA的复合物进行免疫共沉淀,蛋白酶K消化后进行DNA纯化,染色质免疫共沉淀(ChIP)产物用Tn5转座酶建库与传统建库两种方法进行文库构建并测序。结果与传统建库方法相比,Tn5转座酶建库经过Tn5片段化后直接进行目的DNA的扩增,操作简单,更加省时,效率更高;IGV可视化信号分布峰图显示两种建库方式获得的富集峰基本相同;两种建库方法获得的测序数据中,Tn5转座酶建库比传统建库获得更多的富集峰;Tn5转座酶建库后结果显示重复性良好,信噪比达到50%以上。结论Tn5转座酶建库能提高建库效率并得到更好的数据质量,适用于组蛋白修饰的检测,为表观遗传研究提供更好的技术选择。

采用ChIP-chip技术分析大鼠肺成纤维细胞转分化前后全基因组蛋白H3K4三甲基化水平的改变

目的研究经二氧化硅(Si O_2)染毒的肺成纤维细胞(LF)转分化前后全基因组蛋白H3赖氨酸4(H3K4)三甲基化(met3)水平的改变。方法原代培养大鼠肺泡巨噬细胞(AM)和LF,采用transwell共培养,建立共培养模型,用100 mg·L^(-1)游离Si O_2粉尘染毒AM 24 h,收集LF细胞,免疫组织化学法对转分化后的LF进行表型鉴定。采用染色质免疫共沉淀联合芯片技术(Ch IP-chip)对LF全基因组蛋白H3K4met3进行高通量筛选,采用染色质免疫共沉淀-实时荧光定量聚合酶联反应技术(Ch IP-q PCR)验证芯片结果,采用定量逆转录聚合酶联反应技术(q RT-PCR)检测H3K4出现显著差异的m RNA表达水平。结果通过对经Si O_2染毒前后LF全基因组蛋白H3K4met3水平的对比,共筛选出1815个基因存在H3K4显著性差异(Cy3/Cy5比值>2.0或<0.5,Nimble Scan V2.5软件),其中518个基因出现H3K4met3程度增高,1297个基因H3K4met3程度降低。随机挑选2个差异表达基因nfib和kpna3,以Ch IP-q PCR和q RT-PCR方法验证,取得与Cp G岛芯片一致的结果。结论经Si O_2染毒的LF转分化前后全基因组蛋白H3K4met3水平存在显著改变。Ch IP-chip技术有利于进一步揭示矽肺纤维化发生的分子机制,有助于发现新的蛋白标志物和基因干预靶点。

miR-338-3p在恶性肿瘤中的表达异常及其表观遗传组蛋白的修饰位点

目的探讨不同种类肿瘤中miR-338-3p表达谱及其表达异常的表观遗传修饰调控机制。方法生物信息学大数据库(TCGA Pan-Cancer)分析miR-338-3p在15种不同种类肿瘤组织中的表达谱;以胃癌为研究对象,分析数据库中45例正常胃组织和366例胃癌组织中miR-338-3p表达情况;CRCH37数据库预测miR-338-3p上游启动子区组蛋白修饰位点;利用染色质免疫共沉淀获取组蛋白结合的DNA,PCR扩增miR-338-3p启动子区片段,凝胶电泳验证PCR产物。结果 miR-338-3p在包括食道癌(ESCA)等不同种类肿瘤中表达异常,其中ESCA、头颈部鳞状细胞癌(HNSC)、肾嫌色细胞癌(KICH)、肾乳头状肾细胞癌(KIRP)、肺鳞癌(LUSC)和甲状腺癌(THCA)中表达显著下调(P<0.05),而在结肠腺癌(COAD)、肾透明细胞癌(KIRC)和肝细胞肝癌(LIHC)表达显著上调(P<0.05);366例胃癌组织中miR-338-3p表达普遍下调;染色质免疫共沉淀结合PCR证实组蛋白H3K9m2和H3K4m3是可能引起miR-338-3p下调的两个修饰位点。结论 miR-338-3p在胃癌中表达下调,组蛋白H3K9和H3K4甲基化修饰是潜在原因。

人大肠癌细胞PRL-3基因启动子Snail结合位点的初步研究

目的确定转录因子Snail可与PRL-3基因启动子区结合。方法应用生物信息学方法获得PRL-3基因启动子区域,并对其潜在的Snail结合位点进行预测,进一步应用Snail抗体染色质免疫共沉淀技术结合PCR技术检测PRL-3基因启动子序列,以确定转录因子Snail可与PRL-3基因启动子结合。结果应用TRED在线分析系统确定PRL-3基因的启动子区域位于PRL-3基因上游-700bp至299bp之间,在该启动子区域存在多个转录因子如Snail、n-MYC、ARNT、E74A、NF-kappaB、NRF-2及AML-1等的结合位点;在启动子区域的-500bp至-451bp之间存在Snail结合的核心寡核苷酸序列CACCTG,在其他多个区域存在多个类似这一核心序列的DNA序列;应用染色质免疫沉淀技术结合PCR扩增的方法对人大肠癌细胞株SW480细胞进行分析,发现Snail可与人大肠癌细胞株SW480PRL-3基因的启动子区域的DNA片断结合。结论转录因子Snail可与人大肠癌细胞SW480PRL-3基因启动子结合,参与PRL-3基因的调控。

IgA肾病患者CpG岛组蛋白H3赖氨酸4三甲基化水平的研究

目的研究IgA肾病患者CpG岛组蛋白H3赖氨酸4三甲基化(H3K4me3)水平。方法采用染色质免疫共沉淀联合芯片技术(ChIP-chip)对15例IgA肾病患者和15例健康者的外周血单个核细胞(PBMCs)H3K4me3进行高通量的筛选,染色质免疫共沉淀-实时定量聚合酶链反应(ChIP-qPCR)验证芯片结果。定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测H3K4me3显著差异基因的mRNA表达水平。结果与健康对照组相比,IgA肾病患者的83个基因存在H3K4me3显著差异,其中有39个基因显示H3K4me3水平增高,44个基因H3K4me3水平降低;ChIP-qPCR验证结果与CpG岛芯片结果相符,基因H3K4me3异常变化影响mRNA的表达。结论 IgA肾病患者PBMCs基因组H3K4me3存在显著改变,异常基因有助于研究IgA肾病的发病机制。

HOXB3促进骨肉瘤细胞增殖、克隆形成、迁移和抑制细胞凋亡的机制研究

目的探究同源异型盒基因B3(homeobox genes B3,HOXB3)对骨肉瘤细胞增殖、克隆形成、迁移和凋亡的影响及其潜在分子机制。方法检测2020年1月~12月在雅安市第二人民医院骨科行手术治疗的30例骨肉瘤患者病理组织及邻近正常组织中HOXB3表达;通过转染干扰siRNA敲低HOXB3表达,验证其转染效率;采用细胞增殖实验、克隆形成实验、细胞划痕实验及细胞凋亡实验分别探究敲低HOXB3对骨肉瘤细胞增殖、克隆形成、迁移和凋亡的影响;分析CDCA3在骨肉瘤中的表达特征及与HOXB3的相关性,通过染色质免疫共沉淀技术(chromatin immunoprecipitation,ChIP)分析和荧光素酶报告基因实验验证HOXB3和细胞分裂周期相关蛋白3(cell division cycle associatedfprotein 3,CDCA3)结合关系;验证HOXB3和CDCA3表达调控对骨肉瘤细胞生物学行为的作用机制。结果30例骨肉瘤临床组织中HOXB3表达(41.154±8.626)较邻近正常组织(22.857±7.512)显著升高,差异有统计学意义(t=8.975,P<0.001)。敲低HOXB3表达后,骨肉瘤细胞增殖率、克隆形成率和迁移率明显降低(F=37.477~399.842,均P<0.001),细胞凋亡率显著升高(F=10.556,P=0.011)。骨肉瘤组织中CDCA3表达(38.624±7.736)明显高于邻近正常组织(21.875±6.482),差异有统计学意义(t=9.090,P<0.001);HOXB3与CDCA3表达呈正相关(r=0.736,P<0.01)。CDCA3是HOXB3的靶基因;敲低HOXB3表达显著降低了骨肉瘤细胞中CDCA3表达(F=694.283,P<0.001)。HOXB3可结合CDCA3的启动子区域正调控CDCA3的表达;在敲低HOXB3表达的细胞中回补CDCA3,逆转了HOXB3对骨肉瘤细胞增殖、克隆形成、迁移、凋亡的抑制/促进作用。结论HOXB3在骨肉瘤中表达上调,其可能通过与CDCA3启动子区域结合,正向调控CDCA3表达促进了骨肉瘤细胞的增殖、克隆形成及迁移,抑制了细胞凋亡,可作为临床骨肉瘤治疗的潜在药物靶点。

单细胞基因组学分析的技术前沿

基因组学已经深刻地改变了生命科学的诸多领域的面貌。目前它的主要内容是新的全基因组碱基序列的测定和在全基因组范围内鉴定那些在不同水平上影响生命活动的基因群的功能和相互作用。为达此要求,近年出现的第二代测序(深度测序)技术和基因芯片技术发挥了关键作用,但是两者都需要足够的高质量的核酸样品。所以,在只有或只能用单细胞或极少量细胞的情况下,如果没有特殊手段,上述分析往往不能常规、方便地进行。文章以DNA扩增为主线,综合阐述了目前在单细胞(特别是微生物)全基因组测序和大基因组的靶向重测序,以及对单细胞或微量细胞进行的基于深度测序或芯片杂交的功能基因组分析,如转录组、ChIP和DNA的CpG甲基化分析等的最新策略和技术,评价了单细胞基因组测序和功能基因组学各技术的特点并对发展前景进行了展望。

转录因子和启动子互作分析技术及其在植物应答逆境胁迫中的研究进展

转录因子是一类调节基因表达的重要调控蛋白,转录因子和与其结合的启动子中的相关顺式作用元件,在基因表达方面起着分子开关的作用,因此探究转录因子与启动子的相互作用尤为重要。为了研究在植物遭受逆境胁迫时,转录因子对下游靶基因的调控机制,本文综述了参与逆境胁迫的主要转录因子家族、转录因子的转录激活活性鉴定、转录因子和启动子互作分析技术及其在植物应答逆境胁迫中的应用,为全面、深入研究植物应答逆境胁迫时的基因表达调控机制提供参考。

沙棘H3K9乙酰化修饰全基因组分析

为了绘制沙棘H3K9乙酰化修饰图谱,确定H3K9乙酰化修饰所调控的基因,该实验通过Western blot验证抗体与组蛋白的结合能力和ChIP-seq验证抗体富集效率,获得全基因组范围内沙棘H3K9乙酰化修饰图谱和调控基因。实验结果表明,H3K9ac抗体与复合物具有较强的结合能力。对富集到的DNA片段进行高通量测序,分别获得2.2×10~7和3.6×10~7条原始序列;唯一比对序列广泛分布于沙棘基因组中,并且在结构基因中的两端具有明显的富集。对富集区进行峰的预测结果显示,共预测出1 011个峰;对峰所处部位基因进行功能预测结果发现,H3K9ac对于沙棘细胞代谢和信号转导基因的表达具有重要调控作用。沙棘片段化DNA的富集以及高通量测序结果证明,抗体能够用于研究沙棘的组蛋白修饰类型,并且绘制了沙棘第一张H3K9乙酰化修饰遗传图谱草图,鉴定出沙棘H3K9乙酰化修饰所调控的基因,为今后研究组蛋白修饰对沙棘基因表达的调控方式奠定了基础。

外阴鳞状细胞癌患者癌组织p16和DAPK基因组蛋白H3K27三甲基化状态水平研究

目的:研究外阴鳞状细胞癌患者癌组织p16和DAPK基因组蛋白H3K27三甲基化状态及mRNA表达水平。方法:采用染色质免疫共沉淀-实时定量聚合酶联反应(Ch IP-qPCR)技术对8例外阴鳞状细胞癌患者癌组织和毗邻正常组织p16和DAPK基因组蛋白H3K27三甲基化状态进行定量分析;随后采用定量反转录聚合酶联反应(qRT-PCR)检测其基因的mRNA表达水平。结果:外阴鳞状细胞癌患者癌组织p16和DAPK基因组蛋白H3K27三甲基化水平增高;其三甲基化水平较毗邻正常组织有显著性差异(P<0.05);进一步表达分析显示p16和DAPK基因其mRNA表达降低。结论:外阴鳞状细胞癌患者癌组织p16和DAPK基因组蛋白H3K27三甲基化水平增高,组蛋白H3K27三甲基化异常参与外阴鳞状细胞癌的发生,极可能成为外阴鳞状细胞癌新的表观治疗靶点。

人NPTX1相关H3K27ac富集的非保守性增强子鉴定

目的探索和鉴定人NPTX1相关H3K27ac富集的非保守性的增强子,完善NPTX1相关调控区的注释,为NPTX1相关疾病及非编码区突变的研究提供相应的理论基础。方法从CistromeDB数据库下载和分析涉及7种组织的39个H3K27ac ChIP-seq数据,选择NPTX1两侧100 kb范围内的峰。通过ECR浏览器分析各片段在人、小鼠和斑马鱼之间的序列保守性。将相应DNA片段插入双荧光素酶验证载体中,在人神经源细胞系SH-SY5Y和人肾源细胞系293T行双荧光素酶实验,以检测增强子活性。结果分析获得5个H3K27ac富集片段,各片段在人、小鼠和斑马鱼之间DNA序列不保守。NPTX1-E1-P在SH-SY5Y中双荧光素酶活性比值明显高于阴性对照组,但在293T细胞中其增强子活性下降约40%。结论NPTX1附近的H3K27ac富集片段中,NPTX1-E1-P在人神经细胞系SH-SY5Y中具有增强子活性,且在物种间序列保守性低。相对于人神经源细胞系SH-SY5Y,其在人肾源细胞系293T中增强子活性下降。

类风湿关节炎患者外周血单个核细胞组蛋白H3赖氨酸4三甲基化水平检测及意义

目的研究类风湿关节炎(RA)患者外周血单个核细胞(PBMCs)组蛋白H3赖氨酸4(H3K4)三甲基化(Me3)水平。方法梯度密度离心法分离8例RA患者和8例健康者的PBMCs,采用染色质免疫共沉淀联合芯片技术(ChIP-chip)在全基因组范围内对RA患者及健康者的PBMCs组蛋白H3K4me3进行高通量的筛选。染色质免疫共沉淀-实时定量聚合酶联反应(ChIP-qPCR)验证芯片结果。定量反转录聚合酶联反应(qRT-PCR)检测H3K4me3显著差异基因的mRNA表达水平。结果RA患者与对照比较,鉴定出364个基因存在H3K4me3显著差异,其中有66个基因显示有H3K4me3程度增高,298个基因有H3K4me3程度降低;ChIP-qPCR验证结果与CpG岛芯片结果一致。结论RA患者与健康者之间的PBMCs存在组蛋白H3K4me3显著改变。ChIP-chip技术有利于进一步揭示RA分子机制,发现新的治疗靶点。

外阴鳞状细胞癌组织中VEGF和Bcl-2基因组蛋白H3K4三甲基化水平的表达

目的:检测外阴鳞状细胞癌患者癌组织血管内皮生长因子(VEGF)和Bcl-2基因组蛋白H3K4三甲基化(me3)甲基状态及其mRNA的表达。方法:采用染色质免疫共沉淀-实时定量聚合酶链反应(ChIP-qPCR)技术对15例外阴鳞状细胞癌患者癌组织和毗邻正常组织VEGF和Bcl-2基因组蛋白H3K4me3甲基化状态进行定量分析;随后采用定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测基因的mRNA表达。结果:外阴鳞状细胞癌组织中VEGF和Bcl-2基因呈现组蛋白H3K4me3水平增高(P<0.05);VEGF和Bcl-2基因的mRNA表达增加。结论:外阴鳞状细胞癌组织VEGF和Bcl-2基因可能参与外阴鳞状细胞癌的发生,成为外阴鳞状细胞癌新的治疗靶点。

三维基因组染色质构象捕获及其衍生技术

线性染色质经过多重折叠凝缩到真核生物的细胞核中,染色质的三维构象直接决定了真核生物的基因表达,因此染色质可以在局部或远程空间上发生互作调控基因转录。折叠成环状构象的染色质可以借助染色质构象捕获(Chromosome conformation capture,3C)技术来研究,基于3C技术扩展的4C/5C/Hi-C从单个位点延伸到全基因组捕捉三维构象,在此基础上,染色质构象核心技术可以与免疫共沉淀、核酸分子杂交、单细胞、基因组测序等技术偶联而产生新的衍生技术和应用,这极大地推动了染色质构象技术在基因时空特异性表达调控上的研究。文中将以3C和Hi-C等三维基因组核心技术为基础,重点介绍染色质构象捕获及其衍生技术的原理和前沿应用。

免疫沉淀技术在蛋白质研究中的应用

蛋白质在生命活动中具有至关重要的作用,包括生长、发育、细胞分化及凋亡等过程均需要蛋白质发挥功能。目前对于蛋白质的研究越来越得到重视,现对研究蛋白质间、DNA-蛋白质、RNA-蛋白质相互作用的三种生物技术进行综述,主要从免疫共沉淀、染色质免疫沉淀、RNA免疫沉淀的定义、基本原理、优缺点及应用等方面进行阐述,并作出总结和展望。

Reverse ChIP:研究DNA-蛋白质相互作用的新方法

反向染色质免疫共沉淀技术(reverse chromatin immunoprecipitation assay,Reverse ChIP)是一种在体内状态下分析DNA-蛋白质相互作用的新方法.它用特异的核酸探针捕获靶DNA片段及与其相结合的蛋白质,蛋白质用质谱仪检测,以达到确定靶DNA位点全部相关蛋白质的目的.其可对靶DNA位点相关蛋白质进行全面、系统地鉴定,特别是寻找已知DNA元件相应的调节蛋白.在发现、鉴定靶DNA位点相关蛋白质和研究DNA-蛋白质相互作用中有重要应用价值.