基于染色质免疫共沉淀的高通量测序数据集的顺式调控模体发现算法

针对新一代测序(NGS)的染色质免疫共沉淀的高通量测序(ChIP-Seq)数据集的模体发现问题,提出一种基于费舍尔(Fisher)精确检验的模体发现算法——Fisher Net。首先运用费舍尔精确检验计算所有k长短序的P值并筛选出模体的种子;然后,构建初始模体的位置赋权矩阵;最后,用位置赋权矩阵扫描所有k长短序形成最终模体。通过小鼠胚胎干细胞(m ESC)和红细胞、人类淋巴母细胞系的ChIP-Seq数据集以及ENCODE数据库的数据进行验证,结果表明所提算法精度和计算速度均高于其他常见的模体发现算法,并且能够发现超过80%的已知转录因子核心模体及其辅调控因子模体。该算法在保证高精度的同时可以应用到大规模测序数据集。

非交联染色质免疫共沉淀及其二代测序技术建库方法的优化

目的优化非交联染色质免疫共沉淀及其二代测序(Native ChIP-seq)技术,简化操作步骤,得到高质量ChIP-seq数据。方法裂解细胞,MNase切割DNA释放核小体,用组蛋白修饰的特异性抗体将组蛋白与DNA的复合物进行免疫共沉淀,蛋白酶K消化后进行DNA纯化,染色质免疫共沉淀(ChIP)产物用Tn5转座酶建库与传统建库两种方法进行文库构建并测序。结果与传统建库方法相比,Tn5转座酶建库经过Tn5片段化后直接进行目的DNA的扩增,操作简单,更加省时,效率更高;IGV可视化信号分布峰图显示两种建库方式获得的富集峰基本相同;两种建库方法获得的测序数据中,Tn5转座酶建库比传统建库获得更多的富集峰;Tn5转座酶建库后结果显示重复性良好,信噪比达到50%以上。结论Tn5转座酶建库能提高建库效率并得到更好的数据质量,适用于组蛋白修饰的检测,为表观遗传研究提供更好的技术选择。

染色质免疫共沉淀测序技术及其在园艺植物中的应用研究进展

近年来,基于染色质免疫共沉淀技术(ChIP)与第二代测序技术结合的染色质免疫共沉淀测序技术(ChIP-seq)已被广泛用于研究DNA与蛋白质的相互作用,对解析园艺植物基因的表达与调控、靶基因筛选与定位、调控网络构建、染色质开放程度确认等方面具有较大的优势。本文综述了ChIP-seq技术的发展简史及其在园艺植物转录因子和组蛋白修饰中所取得的进展,以期为园艺植物DNA—蛋白互作研究提供参考。

人支气管上皮样细胞中苯并[a]芘代谢物-DNA加合物图谱:基于染色质免疫共沉淀测序技术

[背景]苯并[a]芘(BaP)的活性代谢产物7,8-二羟-9,10-环氧苯并[a]芘(BPDE)可与DNA加合,但BPDE-DNA加合物图谱尚不明确。[目的]采用染色质免疫共沉淀测序技术(ChIP-Seq),在全基因组水平上鉴定BPDE加合位点分布及加合基因,为深入研究BaP的毒作用机制提供依据。[方法]人支气管上皮样细胞16HBE培养至第四代达对数生长期。收获细胞并加入染色质免疫共沉淀裂解缓冲液,将裂解产物等分为实验组和对照组,实验组添加终浓度20μmol·L^(–1)的BPDE溶液,对照组添加相同体积的二甲基亚砜溶液,在37℃环境下孵育24 h。超声获得100~500 bp的染色质小片段。使用BPDE特异性抗体(anti-BPDE 8E11)富集与BPDE加合的DNA片段,高通量测序检测BPDE加合位点,使用MEME和DREME软件对前1000个峰序列进行模体分析,注释BPDE在全基因组水平的加合靶基因,并通过生物信息学技术对BPDE加合靶基因进行基因本体论(GO)功能分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析。[结果]高通量测序共检测出842个BPDE结合位点,在各染色体上均有分布。BPDE可以与基因编码区和非编码区共价结合,73.9%的结合位点分布在基因间区,19.6%分布在内含子区,上游2千碱基区域、外显子区、下游2千碱基区域及5′非翻译区也有少量分布。对前1000个峰序列进行分析,寻找到4条可靠的模体,发现富含鸟嘌呤(G)和腺嘌呤(A)的位点易于结合。对结合位点进行富集,共鉴定出199个BPDE加合靶基因,大多分布在1号、5号、7号、12号、17号和X染色体上。GO分析显示,靶基因主要富集于核酸和蛋白质结合,参与调节催化活性、转运活性、翻译延伸因子活性,在细胞分裂、分化、运动、物质运输和信息传递方面发挥重要作用。KEGG分析显示靶基因主要富集于心血管疾病、癌症、免疫炎症反应等相关通路。[结论]利用ChIP-Seq在全基因组水平上共鉴定出199个BPDE加合靶基因,主要影响细胞分裂、分化、运动、物质运输和信息传递等生物学功能,与心血管疾病、肿瘤及免疫炎症反应密切相关。

染色质免疫共沉淀技术的应用和研究进展

本文主要从染色质免疫共沉淀技术的基本原理、实验步骤、优缺点和应用等方面进行阐述,阐明了应用于ChIP技术下游的确定靶基因的不同方法,并对其中的两种重要方法作比较。特别介绍了ChIP技术在植物方面的最新研究进展,并对此技术作总结和展望。

利用ChIP-seq技术研究转录因子EDAG在全基因组的结合谱

为揭示红系分化相关基因(erythroid differentiation-associated gene,EDAG)在造血中的作用机制,利用ChIP-seq分析EDAG的全基因组结合谱.首先从产妇脐带血分离CD34+细胞,EPO诱导CD34+细胞培养5 d.利用EDAG抗体进行染色体免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)实验、Western印迹法检测EDAG抗体的富集情况.将富集到的DNA样品进行高通量测序,最后利用生物信息学分析测序结果.成功富集染色体DNA,经高通量测序和生物信息学分析,共得到1 292个EDAG结合位点的Peaks数目,代表了975个结合的基因且错误发现率(false discovery rate,FDR)小于0.0001.EDAG Peaks主要分布在基因间区和内含子区.进一步利用Q-PCR对ChIP-Seq数据进行了验证,证实EDAG可结合在检测的靶基因调控区上.将EDAG结合的基因进行基因功能(gene ontology,GO)注释,表明EDAG参与了细胞周期、细胞生长、细胞分化、细胞凋亡及信号通路等多种生物学过程.综上,利用ChIP-seq技术在促红细胞生成素(EPO)诱导分化的CD34+细胞中鉴定了1 292个EDAG结合的peaks对应975个基因,并对该结果进行了随机验证,提示EDAG广泛参与了多种生物学过程.该研究为揭示EDAG的功能及作用机制提供了线索.

基于ChIP-seq筛选睾丸支持细胞中雄激素受体靶基因初步研究

雄激素及其受体在精子发生中有重要作用。寻找并鉴定更多雄激素及其受体的靶基因,对阐明雄激素及其受体介导精子发生的分子机制,解析其调控精子发生的网络具有非常重要的科学意义。在本研究中,我们分离了睾丸支持细胞,以睾酮刺激,并以ARKO小鼠睾丸作为背景对照,进行ChIP-seq和分析验证。数据分析显示了8679个差异表达基因,其中4830个基因在睾酮处理组表达上调,3849个表达下调。我们从差异基因中筛取了43个靶基因进行验证,其中39个基因的启动子区域找到了ARE结合位点。候选靶基因介导雄激素调控精子发生的分子机制仍有待进一步研究。本项目初步鉴定的靶基因可为进一步深入系统研究雄激素及其受体调控精子发生的机制提供参考。

基于ChIP-Seq进行肿瘤/睾丸抗原XAGE-1b的DNA结合位点鉴定

XAGE-1b(X antigen family member 1B)属于XAGE亚家族,是一种肿瘤-睾丸抗原(cancer/testis antigen,CTA),表达于正常人睾丸组织和多种类型的肿瘤细胞中.本实验室前期研究发现,该基因在涎腺腺样囊性癌高转移细胞系中呈高表达.为了进一步研究XAGE-1b下游调控基因,本实验采用ChIP-Seq技术筛查XAGE-1b蛋白质可能存在的DNA结合片段.结果发现,XAGE-1b下游调控基因富集于细胞分裂(cell division,P-Value=7.95e-04)、细胞周期调控(cell cycle,P-Value=5.532e-03)、及癌症相关基因(GESA/MSigDB module_11,P-Value=2.010e-06)中.同时发现,XAGE-1b下游调控多个基因的表达产物(NCBI/interactions 22827,P-Value=4.678e-06)能与原癌基因c-Myc的启动子抑制蛋白PUF60发生蛋白质相互作用,并通过qPCR进行了验证.这些研究对阐明XAGE-1b在肿瘤细胞的增殖和转移中的作用有重要意义.

Hemin诱导K562细胞分化前后PU.1全基因组结合位点探测

目的探讨K562细胞分化前后全基因组上的PU.1结合位点图谱及靶基因。方法用hemin对K562细胞诱导分化72 h,诱导分化前后的细胞利用PU.1抗体进行染色质免疫共沉淀实验,并进行高通量测序,利用生物信息学分析K562细胞分化前后PU.1在基因组上的结合位点,并进行基因注释、基因功能分析、KEGG通路分析及靶基因预测。结果发现K562细胞分化前PU.1结合位点有3107个,分化后的结合位点有1897个,共有的结合位点有843个。KEGG通路分析结果显示,分化后PU.1结合位点特有的信号通路有NF-κB信号通路,生长激素合成、分泌和运输通路,MAPK信号通路。K562细胞分化前后有1210个差异的PU.1结合位点,对应179个靶基因,其中分化相关的PU.1靶基因包括球蛋白基因、自噬相关基因、microRNA、非编码RNA以及转录因子。Motif分析结果显示,PU.1倾向于去结合ACTTCC特定序列。结论PU.1的基因组结合位点在K562细胞分化前后发生了显著变化,此研究结果为进一步揭示PU.1在血细胞中的功能及作用机制提供了依据。

对于核小体定位检测方法的比较研究

在真核细胞中,核小体是组成染色质的基本结构单位,是由DNA紧密缠绕在组蛋白八聚体上所形成的一个复合体结构。而DNA与组蛋白的结合并不是固定不变的,没有核小体结合的DNA区域易于各种调节蛋白的接近与结合。因此人们怀疑核小体的定位与基因的转录调节之间存在某种内在联系。对现行的核小体定位的检测方法进行了归类,并对其优缺点进行了分析整理。对更深入的探索核小体定位检测方法的应用有一定意义。

人NPTX1相关H3K27ac富集的非保守性增强子鉴定

目的探索和鉴定人NPTX1相关H3K27ac富集的非保守性的增强子,完善NPTX1相关调控区的注释,为NPTX1相关疾病及非编码区突变的研究提供相应的理论基础。方法从CistromeDB数据库下载和分析涉及7种组织的39个H3K27ac ChIP-seq数据,选择NPTX1两侧100 kb范围内的峰。通过ECR浏览器分析各片段在人、小鼠和斑马鱼之间的序列保守性。将相应DNA片段插入双荧光素酶验证载体中,在人神经源细胞系SH-SY5Y和人肾源细胞系293T行双荧光素酶实验,以检测增强子活性。结果分析获得5个H3K27ac富集片段,各片段在人、小鼠和斑马鱼之间DNA序列不保守。NPTX1-E1-P在SH-SY5Y中双荧光素酶活性比值明显高于阴性对照组,但在293T细胞中其增强子活性下降约40%。结论NPTX1附近的H3K27ac富集片段中,NPTX1-E1-P在人神经细胞系SH-SY5Y中具有增强子活性,且在物种间序列保守性低。相对于人神经源细胞系SH-SY5Y,其在人肾源细胞系293T中增强子活性下降。

KDM5C通过Hippo-YAP1通路调控人宫颈癌发生的初步机制

目的探讨组蛋白去甲基化酶5C(KDM5C)通过Hippo-YAP1通路调控人宫颈癌发生的分子机制。方法采用稳转过表达KDM5C蛋白的CaSki细胞系,应用转录组测序(RNA-Seq)技术进行全转录组测序分析差异表达基因,并对差异基因进行GO分析、KEGG分析和蛋白互作网络分析。随后用siRNA敲低KDM5C基因,并通过RT-qPCR和Western blotting等反向验证关键受调控基因Yes相关蛋白1(YAP1)的表达变化。对过表达KDM5C蛋白的CaSki细胞系通过染色质免疫共沉淀测序(ChIP-Seq)技术和ChIP-qPCR方法分析KDM5C蛋白对YAP1基因启动子区间甲基化状态的影响。结果RNA-Seq分析显示,过表达KDM5C蛋白导致356个mRNA表达明显上调和335个mRNA表达明显下调(P<0.05);GO富集分析显示,KDM5C蛋白主要参与机体各种生物发育过程;KEGG富集分析显示,KDM5C蛋白主要参与黏着斑连接、甾类激素生物合成、Hippo-YAP1信号通路、FoxO信号通路、凋亡和感染等过程。RT-qPCR分析结果显示,敲低基因KDM5C可上调YAP1基因的表达;Western blotting结果也显示,降低KDM5C蛋白的表达可同时上调YAP1和磷酸化YAP1的表达水平(P<0.05)。ChIP-Seq分析显示,过表达KDM5C蛋白可明显升高YAP1基因启动子区间的H3K4me1水平、并降低H3K4me3水平(P<0.05),ChIP-qPCR分析也验证了这种表达变化(P<0.05)。结论KDM5C蛋白可调控宫颈肿瘤细胞YAP1基因启动子的组蛋白H3K4me1/me3甲基化水平,进而影响YAP1基因的转录。YAP1蛋白作为Hippo-YAP1通路的核心因子,其表达改变直接影响细胞的黏附、增殖和凋亡等过程,进而参与宫颈癌的发生发展。

真核生物转录因子与DNA互作的研究方法进展

转录水平的调控是真核生物基因表达中的重要环节,转录因子通过识别特定的DNA序列控制染色质和转录以指导基因表达。论文对研究真核生物转录因子与DNA相互作用的传统方法和新兴技术进行阐述,传统的研究方法包括转录因子结合位点预测、双荧光素酶报告基因系统、电泳迁移率变动分析和染色质免疫共沉淀测序等,其中染色质免疫共沉淀测序是基于生物体内的研究方法,对抗体特异性要求高且试验背景较大,限制了对非模式物种的研究,对此,开发了新兴技术如DNA亲和纯化测序和染色质靶向切割与标签化试验。结合上述方法可有效进行转录因子和DNA互作分析,对研究基因转录调控机制具有重要意义。

表观遗传学研究方法进展

表观遗传调控是基因表达调控的重要组成部分,已成为当前研究的热点。目前其研究主要集中在DNA甲基化和组蛋白修饰。针对这两种表观修饰,其研究方法也取得了较大进展,一方面方法的灵敏度和特异性都在不断提高;另一方面表观修饰的检测正在逐步从定性检测向定量分析方向发展,从个别位点向高通量检测发展。此外,新一代测序技术的应用将大大推动表观遗传研究的发展,包括单分子实时测序法、单分子纳米孔测序法等。综述目前常用的DNA甲基化、组蛋白修饰研究方法以及最新的单分子测序技术,并对它们在表观遗传修饰检测中的应用作了简要对比分析。

在人类胰腺癌细胞BxPC3全基因组中受Notch-1胞内结构域和CBF-1转录共调控的靶基因特征分析

目的在人类胰腺癌细胞BxPC3全基因组水平上寻找受Notch-1胞内结构域和CBF-1共同转录调控的靶基因;分析它们的类型、功能和在基因组中的分布等特征值;并以此为基础预测Notch信号通路的潜在生物学功能和调控模式。方法染色质免疫共沉淀联合基于Illumina/Solexa平台的高通量测序。结果 1)Notch-1胞内结构域和CBF-1两组样本有效read数分别为14 287 722和14 289 280个,与人类参考基因组唯一匹配的read数分别为11 782 027和11 711 920个;2)两组样本的peak数分别为385和492个,peak区域分别为318 344 bp和383 768 bp,都占全基因组的约0.01%;3)两组样本的peak区域几乎集中于基因间区和内含子区,只有不到5%位于外显子区;4)两组样本的peak对应基因数分别为150和287个,其中共有基因93个;5)通过基因聚类分析和数据库比对可以查到这些基因的名称、分类、基本功能和在基因组中的位置等具体信息。结论在人类胰腺癌细胞BxPC3全基因组范围内找到了更多在转录水平上受CBF-1和Notch-1胞内结构域共同调控的未知靶基因;初步明确了它们的类型、分布和功能等特征值;这些数据可以为进一步分析Notch信号通路潜在的生物学功能和调控模式奠定基础。

肝癌SMMC-7721细胞系HSF4调控的靶基因图谱分析

热休克转录因子4(heat shock transcription factor 4,HSF4)是热休克转录因子HSF家族成员,近年发现HSF4除发挥调控热休克蛋白(heat shock protein,HSP)表达的功能外,亦直接或间接调节许多非热休克基因的表达,参与细胞生长发育多种生理病理过程。现通过染色质免疫共沉淀联合测序(chromatin immunoprecipitation sequencing,ChIP-Seq)方法对HSF4潜在的靶基因进行检测,并用GO(gene ontology)分析方法对这些靶基因进行分析,以探求HSF4发挥的生物学功能。ChIP-Seq结果显示:在肝癌SMMC-7721细胞系基因组DNA中共有1 726个HSF4结合区域,其中102个在启动子区。GO分析结果显示:这些潜在的靶基因分别参与细胞发育、增殖和对外部刺激应答的生物过程,具有与核酸和蛋白质结合及蛋白质激活的分子功能,参与药物和有害异物代谢以及化学致癌的信号传导通路。此外,MEME4.12.0软件推测出在SMMC-7721细胞系中HSF4与DNA启动子区结合的6种模式。分析HSF4在肝癌SMMC-7721细胞系中可能调控的靶基因图谱为进一步研究HSF4在肝癌发生机制中的作用提供了有效的实验数据和理论基础。

单细胞基因组学分析的技术前沿

基因组学已经深刻地改变了生命科学的诸多领域的面貌。目前它的主要内容是新的全基因组碱基序列的测定和在全基因组范围内鉴定那些在不同水平上影响生命活动的基因群的功能和相互作用。为达此要求,近年出现的第二代测序(深度测序)技术和基因芯片技术发挥了关键作用,但是两者都需要足够的高质量的核酸样品。所以,在只有或只能用单细胞或极少量细胞的情况下,如果没有特殊手段,上述分析往往不能常规、方便地进行。文章以DNA扩增为主线,综合阐述了目前在单细胞(特别是微生物)全基因组测序和大基因组的靶向重测序,以及对单细胞或微量细胞进行的基于深度测序或芯片杂交的功能基因组分析,如转录组、ChIP和DNA的CpG甲基化分析等的最新策略和技术,评价了单细胞基因组测序和功能基因组学各技术的特点并对发展前景进行了展望。

高雄激素调控颗粒细胞系全基因组靶基因及通路的初步探讨

目的:全基因组范围内探索高雄激素调控卵巢颗粒细胞的直接效应基因及通路,为高雄激素参与多囊卵巢综合征(PCOS)的发病机理提供数据支持。方法:以人卵巢颗粒细胞系KGN为研究对象,用高浓度睾酮(10^(-5)mol/L)处理,应用雄激素受体的抗体进行染色质免疫共沉淀,构建DNA文库,进行高通量测序及生物信息学分析。结果:高浓度睾酮处理后,KGN细胞中雄激素受体结合的Peak区域与对照组明显不同。高雄激素诱导其受体结合的Peak为1823个,大部分集中于基因间区与内含子。Peak关联靶基因富集到细胞凋亡、铁死亡、细胞黏附分子、磷脂酶D信号途径、cAMP信号通路、磷脂酰肌醇信号系统、磷酸肌醇代谢、神经活性配体-受体相互作用8个信号通路,涉及基因43个。结论:研究揭示了高雄激素诱导的卵巢颗粒细胞发生改变的重要信号通路,有助于从源头上阐明雄激素参与PCOS发病机理的机制,并为PCOS的治疗提供潜在的靶点。

三维基因组染色质构象捕获及其衍生技术

线性染色质经过多重折叠凝缩到真核生物的细胞核中,染色质的三维构象直接决定了真核生物的基因表达,因此染色质可以在局部或远程空间上发生互作调控基因转录。折叠成环状构象的染色质可以借助染色质构象捕获(Chromosome conformation capture,3C)技术来研究,基于3C技术扩展的4C/5C/Hi-C从单个位点延伸到全基因组捕捉三维构象,在此基础上,染色质构象核心技术可以与免疫共沉淀、核酸分子杂交、单细胞、基因组测序等技术偶联而产生新的衍生技术和应用,这极大地推动了染色质构象技术在基因时空特异性表达调控上的研究。文中将以3C和Hi-C等三维基因组核心技术为基础,重点介绍染色质构象捕获及其衍生技术的原理和前沿应用。

前列腺癌细胞核内雄激素受体靶基因的筛选

目的筛选雄激素依赖性前列腺癌(PC)和雄激素非依赖性PC细胞核内的雄激素受体靶基因。方法取雄激素依赖性PC细胞株LNCaP和雄激素非依赖性PC细胞株LNCaP-AI进行培养,使用染色质免疫共沉淀技术在全基因组水平上筛选LNCaP、LNCaP-AI细胞中的雄激素受体结合位点,联合高通量测序技术寻找雄激素受体靶基因。采用RT-PCR法检测并比较LNCaP、LNCaP-AI细胞中雄激素受体差异靶基因表达水平。结果LNCaP、LNCaP-AI细胞中分别发现9021、4949个基因组测序数据富集区域,其中4143、2380个落在雄激素受体结合位点,将这些位点定位到基因组后分别得到2796、1854个雄激素受体相关基因(相同的基因有789个)。多数靶基因集中在肌动蛋白细胞骨架的调节、紧密连接、血管平滑肌收缩信号通路;LNCaP与LNCaP-AI细胞的差异靶细胞通路为黏着斑通路。从LNCaP与LNCaP-AI细胞测序得到的雄激素受体差异靶基因中筛选出富集程度较高的雄激素受体差异靶基因2个,即LIFR、PSMA6。LNCaP-AI细胞中LIFR、PSMA6 mRNA表达水平均明显高于LNCaP细胞(均P<0.05)。结论LIFR、PSMA6为PC细胞核内雄激素受体靶基因。