利用染色质免疫共沉淀技术确定转录因子RIN调控的靶基因

以粉红期番茄果实为材料,用含不同浓度甲醛的缓冲液交联DNA和蛋白质,利用超声波将其染色质随机断裂成大小为200-1 000 bp的片段,用RIN蛋白的特异性抗体免疫沉淀与RIN蛋白结合的DNA片段,然后解交联和纯化DNA片段,最终用普通PCR试验和测序验证与转录因子RIN结合的DNA序列。结果表明,适用于番茄果实的最佳ChIP试验条件为:用1%甲醛溶液交联DNA和蛋白质的复合物;用20%功率,工作6 s,间隔10 s,脉冲3次超声破碎该复合物,可以得到适当大小的片段,用于后续的试验。普通PCR和测序验证结果证明转录因子RIN与LeACS2和LeACS4启动子区域的CArG box序列结合。

染色质免疫共沉淀分析丁酸钠对γ珠蛋白基因启动子组蛋白乙酰化的作用

目的建立基于Real-time PCR分析的染色质免疫共沉淀(ChIP)方法,探讨丁酸钠对γ-珠蛋白基因启动子区组蛋白乙酰化的作用。方法将K562细胞分为0.5 mmol/L丁酸钠处理48 h组和K562细胞组,每组取1×107细胞用实验。采用抗乙酰化组蛋白H3及H4抗体分别对两组细胞进行ChIP,荧光定量PCR分析不同处理细胞Gγ-、Aγ-珠蛋白基因启动子区乙酰化H3和H4(acH3,acH4)水平。结果各细胞组组内Gγ-和Aγ-珠蛋白基因启动子区域acH3、acH4水平高于阴性对照necdin基因。与K562细胞相比,NaB处理组Gγ-珠蛋白基因启动子区acH3和acH4水平分别升高3.1和2.6倍,Aγ-珠蛋白基因启动子区acH3和acH4水平分别升高3.7和3.2倍(P<0.01)。结论建立了基于荧光定量PCR分析的ChIP技术用于研究珠蛋白基因启动子区域组蛋白的表观遗传修饰,并进一步证实了丁酸钠对γ-珠蛋白基因启动子区域组蛋白乙酰化的作用。

植物染色质免疫共沉淀方法

染色质结构的动态变化和基因的适时适量表达,在植物生长发育过程中起着非常重要的作用。研究染色质结合蛋白和DNA的时空结合关系,对认识这些复杂的生命过程有重大意义。染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation)就是在体内染色质环境下研究蛋白质和DNA结合关系的方法,本研究利用先提核再甲醛交联的方法,详细叙述了该方法的6个主要步骤。通过对拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型Col-0和突变体met1中组蛋白H3K9甲基化在At4g03870转座子上差异的研究,认为染色质免疫共沉淀方法可行、稳定,此方法不仅适用于单个基因与蛋白结合关系的研究,还适用于特异蛋白结合位点的全基因组学研究。

染色质免疫共沉淀法对猪链球菌反应调控因子CovR靶基因的筛选

目的猪链球菌CovR是具有全局调控作用的负反应调控因子。文章采用染色质免疫共沉淀(chromatin immu-noprecipitation,ChIP)方法筛选转录调控因子CovR的靶基因,为进一步开展CovR调控机理研究提供条件。方法利用甲醛固定猪链球菌2型05ZYH33菌株活细胞,超声波破碎法将DNA随机断裂成100～500bp大小不同的片段,再利用CovR特异性单抗免疫沉淀该蛋白质-DNA片段解交联并分离纯化DNA。针对8个潜在的靶标基因启动子区设计引物,分别用设计的引物对免疫共沉淀的DNA样品进行PCR扩增,验证CovR与DNA的结合。结果最佳ChIP实验条件为1%甲醛交联DNA与蛋白质的复合物;功率80 W、工作10 s、间隔30 s、超声40次破碎该复合物,可得到100～500 bp大小不同的片段用于后续实验。PCR结果显示SSU1668基因和SSU1732基因启动子区扩增出阳性条带,另外6种基因的启动子区未扩增出阳性条带。结论 CovR抗体免疫沉淀得到的DNA片段中含有SSU1668基因和SSU1732基因启动子区,表明SSU1668基因和SSU1732基因是CovR的靶基因。

染色质免疫共沉淀超声波破碎条件的研究

意在找出拟南芥幼苗适宜的染色质免疫共沉淀(ChIP)超声波破碎的条件,为后期抗体的沉淀提供适当大小的片段。以拟南芥(Columbia ecotype)幼苗为材料,用1%浓度甲醛的缓冲液交联DNA和蛋白质,利用超声波将其染色质随机断裂成适当大小的片段。结果表明,适用于拟南芥幼苗的最佳ChIP试验条件为:用1%甲醛溶液交联DNA和蛋白质的复合物;用65%功率,每次工作20s,间隔4min,8次破碎该复合物,可以得到400～800bp大小的片段,用于后续的试验。经本实验的研究得到了拟南芥幼苗染色质免疫共沉淀超声波破碎的最佳条件,为后续实验奠定了基础。

斜卧青霉转录调控蛋白Hac1染色质免疫共沉淀分析方法的建立

【目的】对斜卧青霉转录调控因子Hac1进行染色质免疫共沉淀(CHIP)试验,为其调控机制及生物学功能研究奠定基础。【方法】以斜卧青霉为材料,DTT诱导转录调控因子Hac1表达,用交联Buffer处理菌丝,使Hac1与靶基因交联,超声破碎染色质后,进行解交联染色体检验,研究不同交联时间(5,10,20,30,40min)、不同菌丝用量(10mL CHIP缓冲液中分别添加0.25,0.50,1.00,1.50g菌丝)及不同超声功率(15,20,25,30 W)、超声时间(1,3,5s)、超声间隔时间(10,20,30,40s)、超声次数(15,25,30,40次)对试验效果的影响。在优化的条件下对菌丝进行处理,获得合格的DNA片段,进行CHIP试验,采用随机PCR方法检测染色质免疫共沉淀效果。【结果】适用于斜卧青霉Hac1的最佳染色质免疫共沉淀试验的条件为:交联时间控制在20min以内;最佳菌丝用量为10mL CHIP缓冲液中加入1g菌丝;25 W超声功率,工作时间5s,间隔时间40s,超声30次。在优化的条件下富集DNA片段,进行随机PCR,结果在500~750bp间可见明显的扩增条带。【结论】优化了斜卧青霉转录调控因子Hac1CHIP条件,成功进行了CHIP试验。

利用染色质免疫共沉淀测序研究Twist1结合的靶DNA序列

目的:利用染色质免疫共沉淀测序研究Twist1结合的靶DNA序列,比较过表达Bcl-2和正常状态下Twist1结合靶DNA序列的变化。方法:筛选常态表达Twist1的肝癌细胞系,分别转染Bcl-2表达质粒和对照空载体,收集转染后细胞以甲醛交联DNA,收集样品进行染色质免疫共沉淀,获得与Twist1蛋白结合的DNA片段进行测序分析。结果:通过对5种肝癌细胞系进行筛选,观察到HepG2可表达Twist1,其与DNA结合序列在空载体对照组和Bcl-2过表达组具有很大的差别,结合DNA数量分别为68条和212条,其中共享序列154条。结论:Twist1在不同环境下与DNA结合位点多达212个,涉及粘附分子、细胞骨架、信号转导、代谢和转录调节等多种生物学功能。

基于水稻原生质体的染色质免疫共沉淀技术优化及应用

植物转录因子是植物体内调节基因表达的重要蛋白,参与多种生物学功能的调控。研究植物转录因子调控靶基因的常用方法为染色质免疫共沉淀法(chromatin immunoprecipitation,ChIP),但抗体特异性、遗传材料构建的耗时性等因素却大大限制了ChIP技术的应用范围和效果。本文通过对水稻原生质体瞬时转化、甲醛固定、免疫沉淀核酸的超声波破碎等条件的优化,建立了基于水稻原生质体的染色质免疫共沉淀技术体系(chromatin immunoprecipitation system based on rice protoplasts,ChIP-RP);并通过本技术体系验证了水稻转录因子OsNF-YA4蛋白对靶基因序列的富集作用。本技术体系将减少制备特异性抗体或构建稳定遗传材料的局限,有利于水稻转录因子直接调控靶基因的快速筛选和验证,推动水稻转录因子调控功能的分子机制解析。

植物叶片染色质免疫共沉淀方法的优化

以拟南芥成熟叶片为材料,探索3种不同型号超声破碎仪器的染色质免疫共沉淀(Ch IP)超声破碎条件.根据超声破碎结果推荐使用Covaris M220 Focused-ultrasonicator仪器,并将该仪器破碎条件设置为10%duty cycle、75 Watts Intensity Peak Incident power、200 cycle per Burst、7℃bath temperature、破碎时间12 min时,可获得约500 bp的DNA片段.同时,为检测不同H3K9ac抗体用量对染色质免疫沉淀效率的影响,通过半定量和实时荧光定量PCR检测确定初始量0.25 g的拟南芥叶片所需H3K9ac抗体的最适用量为3μL.此外,以不同衰老程度的水稻旗叶为材料,根据上述破碎条件,进一步优化超声破碎时间,同样可以获得合适的DNA片段,根据优化的样品与抗体用量比例,通过免疫沉淀可以获得适用于后期实时定量PCR(Ch IP-q PCR)和高通量测序(Ch IP-seq)分析的DNA样品.

一种微小染色质免疫共沉淀方法的建立

染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)是目前研究蛋白与DNA相互作用的强有力的技术之一。然而传统的ChIP实验方法的最大缺陷是要求大量的细胞数,这限制了它应用于少量细胞数的样品。在传统ChIP实验的基础上综合国外文献建立了一种能在少量细胞样品中进行的染色质免疫共沉淀实验,称之为微小染色质免疫共沉淀(miniChIP)。并通过对诱导前后的MEL细胞中表达的β珠蛋白基因簇组蛋白H4乙酰化(acH4)的研究,证实了其可靠性和特异性。结果显示:高敏位点HS2和活跃基因β-maj的启动子区域存在一定的组蛋白H4乙酰化水平,DMSO诱导后显著增加,而不活跃基因Ey的启动子区域则检测到极低水平的组蛋白H4乙酰化,且诱导后无明显变化。

染色质免疫共沉淀测序技术研究进展

染色质免疫共沉淀测序(chromatin immunoprecipitation followed by sequencing,ChIP-seq)是研究目的蛋白与DNA相互作用的重要方法,被广泛应用于转录因子、组蛋白修饰等分布与功能的研究。研究人员通过对细胞分离、染色质片段化以及测序文库构建等关键步骤不断优化,使ChIP-seq适合少量细胞的分析。近年来发展迅速的CUT&RUN(cleavage under targets and release using nuclease)、CUT&Tag(cleavage under targets and tagmentation)技术,利用特异性抗体使酶“靶向”结合目标蛋白,通过MNase酶切或Tn5转座酶切割染色质,简化了实验操作流程。本文介绍了ChIP-seq的原理及其数据分析方法,比较ChIP-seq优化方法和衍生技术。总结了在植物生长发育过程中,转录因子和组蛋白修饰在生物钟调控、激素信号转导、光信号途径、胁迫响应等方面研究与染色质免疫共沉淀测序技术的应用。

基于染色质免疫共沉淀的高通量测序数据集的顺式调控模体发现算法

针对新一代测序(NGS)的染色质免疫共沉淀的高通量测序(ChIP-Seq)数据集的模体发现问题,提出一种基于费舍尔(Fisher)精确检验的模体发现算法——Fisher Net。首先运用费舍尔精确检验计算所有k长短序的P值并筛选出模体的种子;然后,构建初始模体的位置赋权矩阵;最后,用位置赋权矩阵扫描所有k长短序形成最终模体。通过小鼠胚胎干细胞(m ESC)和红细胞、人类淋巴母细胞系的ChIP-Seq数据集以及ENCODE数据库的数据进行验证,结果表明所提算法精度和计算速度均高于其他常见的模体发现算法,并且能够发现超过80%的已知转录因子核心模体及其辅调控因子模体。该算法在保证高精度的同时可以应用到大规模测序数据集。

脂肪组分染色质免疫共沉淀研究方法的建立

目的:优化肾周等部位脂肪组织各组分染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)的实验方案。方法:测试了脂肪各组分细胞分离和染色质提取的不同方法,以优化脂肪组分的ChIP实验方法。结果:通过优化ChIP实验各步骤,减少了细胞损失、防止油脂污染,从而提高了脂肪各组分染色质提取的质量和数量。从4只小鼠的5个脂肪部位成功获得ChIP实验所需的染色质,为成熟脂肪细胞和血管基质组分(stromal vascular fraction,SVF)细胞生成了高质量的组蛋白修饰图谱。结论:本研究通过优化适合脂肪组织的ChIP实验方法,提高了新鲜脂肪组分染色质的数量和质量,可为成熟脂肪细胞和SVF细胞生成高质量组蛋白修饰图谱。

非交联染色质免疫共沉淀及其二代测序技术建库方法的优化

目的优化非交联染色质免疫共沉淀及其二代测序(Native ChIP-seq)技术,简化操作步骤,得到高质量ChIP-seq数据。方法裂解细胞,MNase切割DNA释放核小体,用组蛋白修饰的特异性抗体将组蛋白与DNA的复合物进行免疫共沉淀,蛋白酶K消化后进行DNA纯化,染色质免疫共沉淀(ChIP)产物用Tn5转座酶建库与传统建库两种方法进行文库构建并测序。结果与传统建库方法相比,Tn5转座酶建库经过Tn5片段化后直接进行目的DNA的扩增,操作简单,更加省时,效率更高;IGV可视化信号分布峰图显示两种建库方式获得的富集峰基本相同;两种建库方法获得的测序数据中,Tn5转座酶建库比传统建库获得更多的富集峰;Tn5转座酶建库后结果显示重复性良好,信噪比达到50%以上。结论Tn5转座酶建库能提高建库效率并得到更好的数据质量,适用于组蛋白修饰的检测,为表观遗传研究提供更好的技术选择。

低起始量的免疫共沉淀技术研究进展

将染色质免疫共沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)和第二代测序技术相结合的染色体免疫共沉淀测序技术(co-immunoprecitation followed by sequencing, ChIP-seq)是分析全基因组表观遗传学变化的重要方法,它可以快速、有效地检测到在全基因组范围内DNA与蛋白结合位点、转录因子结合位点(transcription factor binding site, TFBS)、组蛋白翻译后修饰(histone post-translation modifications, hPTMs)、核小体定位和DNA甲基化等。然而,长期以来ChIP-seq需要大量细胞来生成高质量数据集,这限制了ChIP在一些细胞数较低的样本如卵母细胞、早期胚胎细胞等研究领域的应用。近年来,在ChIP的基础上,研究人员提出了一系列降低样品起始量和实验成本、提高测序质量的低起始量ChIP-seq方法,促进了表观基因组学的发展。本文综述了ChIP原理和降低起始量的ChIP的方法学发展,并对其中几种比较重要的方法进行了比较,并总结了低起始量的ChIP-seq在表观遗传学研究中的应用。本文最后对低起始量ChIP技术的应用和发展进行了展望,为低细胞数样品在低起始量ChIP的选择提供了参考。

染色质免疫共沉淀测序技术及其在园艺植物中的应用研究进展

近年来,基于染色质免疫共沉淀技术(ChIP)与第二代测序技术结合的染色质免疫共沉淀测序技术(ChIP-seq)已被广泛用于研究DNA与蛋白质的相互作用,对解析园艺植物基因的表达与调控、靶基因筛选与定位、调控网络构建、染色质开放程度确认等方面具有较大的优势。本文综述了ChIP-seq技术的发展简史及其在园艺植物转录因子和组蛋白修饰中所取得的进展,以期为园艺植物DNA—蛋白互作研究提供参考。

人支气管上皮样细胞中苯并[a]芘代谢物-DNA加合物图谱:基于染色质免疫共沉淀测序技术

[背景]苯并[a]芘(BaP)的活性代谢产物7,8-二羟-9,10-环氧苯并[a]芘(BPDE)可与DNA加合,但BPDE-DNA加合物图谱尚不明确。[目的]采用染色质免疫共沉淀测序技术(ChIP-Seq),在全基因组水平上鉴定BPDE加合位点分布及加合基因,为深入研究BaP的毒作用机制提供依据。[方法]人支气管上皮样细胞16HBE培养至第四代达对数生长期。收获细胞并加入染色质免疫共沉淀裂解缓冲液,将裂解产物等分为实验组和对照组,实验组添加终浓度20μmol·L^(–1)的BPDE溶液,对照组添加相同体积的二甲基亚砜溶液,在37℃环境下孵育24 h。超声获得100~500 bp的染色质小片段。使用BPDE特异性抗体(anti-BPDE 8E11)富集与BPDE加合的DNA片段,高通量测序检测BPDE加合位点,使用MEME和DREME软件对前1000个峰序列进行模体分析,注释BPDE在全基因组水平的加合靶基因,并通过生物信息学技术对BPDE加合靶基因进行基因本体论(GO)功能分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析。[结果]高通量测序共检测出842个BPDE结合位点,在各染色体上均有分布。BPDE可以与基因编码区和非编码区共价结合,73.9%的结合位点分布在基因间区,19.6%分布在内含子区,上游2千碱基区域、外显子区、下游2千碱基区域及5′非翻译区也有少量分布。对前1000个峰序列进行分析,寻找到4条可靠的模体,发现富含鸟嘌呤(G)和腺嘌呤(A)的位点易于结合。对结合位点进行富集,共鉴定出199个BPDE加合靶基因,大多分布在1号、5号、7号、12号、17号和X染色体上。GO分析显示,靶基因主要富集于核酸和蛋白质结合,参与调节催化活性、转运活性、翻译延伸因子活性,在细胞分裂、分化、运动、物质运输和信息传递方面发挥重要作用。KEGG分析显示靶基因主要富集于心血管疾病、癌症、免疫炎症反应等相关通路。[结论]利用ChIP-Seq在全基因组水平上共鉴定出199个BPDE加合靶基因,主要影响细胞分裂、分化、运动、物质运输和信息传递等生物学功能,与心血管疾病、肿瘤及免疫炎症反应密切相关。

染色质免疫共沉淀技术的应用和研究进展

本文主要从染色质免疫共沉淀技术的基本原理、实验步骤、优缺点和应用等方面进行阐述,阐明了应用于ChIP技术下游的确定靶基因的不同方法,并对其中的两种重要方法作比较。特别介绍了ChIP技术在植物方面的最新研究进展,并对此技术作总结和展望。

染色质免疫共沉淀技术对羊种布鲁氏菌转录调控因子MucR靶基因的筛选

为研究羊种布鲁氏菌转录调控因子MucR蛋白的毒力相关机制,对染色质免疫共沉淀技术进行了优化。构建了表达MucRFlag融合蛋白的羊种布鲁氏菌菌株,并用商品化抗Flag标签抗体对MucRFlag蛋白进行富集,从而替代MucR蛋白抗体的制备过程。通过该染色质免疫共沉淀方法对羊种布鲁氏菌MucR蛋白的结合靶点基因进行了鉴定,结果显示:通过使用该方法鉴定出羊种布鲁氏菌MucR蛋白可以结合到BMEI0430和BMEI1364(mucR基因)的启动子序列上。结果表明优化的染色质免疫共沉淀技术适用布鲁氏菌转录调控因子结合靶点的研究。

乳腺组织染色质免疫共沉淀方法的改进

作为研究基因表达调控的重要方法,近年来染色质免疫共沉淀(ChIP)得到了越来越广泛的应用,但有关将乳腺组织作为ChIP材料的研究及其方法尚未见报道。采用传统的组织ChIP试剂盒处理乳腺组织时,存在样品回收率低、乳脂/乳蛋白影响杂交效率和超声积热等问题,针对以上问题对乳腺组织ChIP方法进行改进。新方法省略组织均一化步骤、用酶切-超声法代替超声法进行染色质片段化、在细胞裂解和酶切步骤间增加洗涤步骤。结果显示,与脾脏组织相比,乳腺组织不适合进行组织均一化处理。酶切-超声法比超声法更适于对乳腺组织进行染色质片段化。采用改进后的ChIP方法获得的DNA样品中,靶序列得到显著的富集,所得的DNA样品能够满足测序(ChIP-Seq)要求。结果说明,改进后的方法适用于乳腺组织染色质免疫共沉淀,并为研究乳腺组织基因表达调控奠定了基础。