染色质解旋酶DNA结合蛋白7表达与肝癌临床病理特征及预后的关系

目的通过研究肝癌组织内染色质解旋酶DNA结合蛋白7(CHD7)的表达及其与肝癌患者临床病理特征及预后的关系,探讨CHD7作为肝癌预后预测指标的可行性。方法将286例肝切除术后病理确诊为肝细胞肝癌的标本制作成组织芯片。采用免疫组化法检测肝癌及癌旁肝组织中CHD7的表达水平,分析其与肝癌患者临床病理特征及预后之间的关系。结果免疫组化结果显示CHD7在肝癌组织中表达明显高于对应的癌旁肝组织。CHD7高表达与肿瘤数目、肿瘤包膜完整性、肿瘤血管侵犯、TNM分期及BCLC分期密切相关,与肝癌患者术后总体生存率呈负相关,而与肝癌患者术后复发率呈正相关。结论 CHD7在肝癌中明显高表达,可作为肝癌患者预后的独立预测指标之一。

染色质解旋酶/ATP酶的DNA结合蛋白1样基因致瘤机制研究进展

染色质解旋酶/ATP酶的DNA结合蛋白1样基因(CHD1L)是一种新近被证实与在许多实体瘤中表达增多的致癌基因,它定位于第1号染色体q21区。CHD1L在肝细胞癌和其他肿瘤中的功能性研究提示,该基因在肿瘤形成过程中可以引起细胞增殖、调节G1/S过渡期并且可以抑制细胞凋亡。CHD1L活化的潜在机制可能是通过结合凋亡蛋白Nur77,或通过上调CHD1L调控的靶基因(如ARHGEF9、SPOCK1或TCTP)受体以激活蛋白激酶B通路,从而干扰细胞死亡程序。CHD1L目前已经被认为是一种新的可独立评价一些实体性肿瘤进展、预后以及生存率的生物标志物。现有的对CHD1L的认识在将来也许可以激励大家进行对一些特定肿瘤的靶向治疗研究。

染色质解旋酶DNA结合蛋白对舌鳞状细胞癌CAL27细胞侵袭和转移影响的研究

目的探讨染色质解旋酶DNA结合蛋白(CHD1L)影响舌鳞状细胞癌侵袭和转移的分子机制,为临床抑制舌鳞状细胞癌的侵袭和转移提供新的靶点。方法运用Ualcan网站分析CHD1L在正常上皮组织和原发性头颈鳞状细胞癌组织中的表达情况,分析有无淋巴结转移对头颈鳞状细胞癌组织中CHD1L表达情况的影响;通过GEPIA网站分析CHD1L在头颈鳞状细胞癌中的表达与生存率的关系;蛋白质印迹法检测人舌鳞状细胞癌细胞CAL27和人正常皮肤细胞HaCaT中CHD1L蛋白的表达水平;用RNA干扰质粒敲低人舌鳞状细胞癌细胞CAL27中的CHD1L后,将细胞分别命名为SiCHD1L/CAL27及Scr/CAL27;蛋白质印迹法检测CHD1L在每组细胞中的表达情况;EdU增殖实验检测每组细胞增殖能力的改变;伤口愈合实验检测每组细胞迁移能力的改变;蛋白质印迹法检测上皮间质转化(EMT)标志物上皮钙黏着蛋白和波形蛋白的表达水平。结果Ualcan数据库显示:CHD1L在原发头颈鳞状细胞癌组织中表达高于正常上皮组织中的表达,在出现淋巴结转移的头颈鳞状细胞癌组织中表达更高。GEPIA网站分析显示:CHD1L表达量高的头颈鳞状细胞癌患者总生存率较表达量低的患者明显降低。蛋白质印迹结果显示:人舌鳞状细胞癌细胞CAL27中CHD1L表达高于人正常皮肤细胞HaCaT中CHD1L的表达,敲低CHD1L以后CAL27细胞中CHD1L的表达量明显低于Scr/CAL27组细胞。EdU增殖实验结果显示:SiCHD1L/CAL27组细胞增殖能力明显降低。伤口愈合实验显示:SiCHD1L/CAL27组迁移能力降低,SiCHD1L/CAL27组细胞上皮钙黏着蛋白表达量增加而波形蛋白表达量降低。结论CHD1L促进舌鳞状细胞癌细胞的EMT,促进舌鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移侵袭能力。

siRNA沉默染色质解旋酶DNA结合蛋白1对卵巢癌HO-8910PM细胞增殖、侵袭、迁移的影响

目的:探究siRNA沉默染色质解旋酶DNA结合蛋白1(CHD1L)对卵巢癌HO-8910PM细胞增殖、侵袭、迁移及相关分子如核因子κB(NF-κB)、基质金属蛋白酶(MMP)的影响。方法:将si-CHD1L、si-NC质粒转染至卵巢癌HO-8910PM细胞,命名为si-CHD1L组、si-NC组,以未经转染细胞作为对照组,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞CHD1L mRNA表达; CCK-8法检测细胞增殖抑制情况;划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell小室系统检测细胞迁移、侵袭能力;蛋白免疫印迹(WB)检测NF-κB、MMP-2、MMP-9蛋白表达。结果:与对照组、si-NC组比较,si-CHD1L组细胞CHD1L mRNA表达降低(P<0.05),细胞增殖抑制率升高,细胞迁移能力降低,迁移、侵袭数量降低(P<0.05)。与对照组、si-NC组相比,si-CHD1L组NF-κB、MMP-2、MMP-9蛋白表达降低(P<0.05)。结论:siRNA沉默CHD1L能够抑制卵巢癌HO-8910PM细胞增殖、侵袭、迁移,并能抑制NF-κB、MMP蛋白的表达,为卵巢癌的靶向治疗提供一定的理论依据。

CHD4调控端粒功能促进宫颈癌HeLa细胞生长的机制研究

目的探讨染色质域解旋酶DNA结合蛋白4(CHD4)通过调控端粒功能对宫颈癌HeLa细胞增殖、迁移的影响。方法慢病毒感染构建CHD4稳定敲低的宫颈癌HeLa细胞系,实时荧光定量PCR(qPCR)和Western blot分别检测CHD4的mRNA和蛋白表达水平;将宫颈癌HeLa细胞分为对照组、shCDH4-1组、shCHD4-2组,CCK-8实验检测CHD4对HeLa细胞增殖能力的影响;集落形成实验检测细胞的集落数量;划痕愈合实验检测细胞迁移能力;裸鼠荷瘤实验观察移植瘤生长情况;免疫荧光-荧光原位杂交技术检测CHD4与HeLa细胞中端粒的共定位及各组细胞中端粒的损伤情况,端粒损伤以损伤因子γH2AX与端粒的共定位表示;中期染色体-荧光原位杂交技术检测各组细胞中端粒功能的变化,端粒信号缺失(SFE)或多端粒信号(MTS)的染色体比例升高代表端粒功能障碍。结果慢病毒感染成功构建CHD4稳定下调的HeLa细胞系(P<0.05)。与对照组相比,shCDH4-1组和shCHD4-2组的细胞增殖能力、集落形成能力、迁移能力、体内肿瘤生长能力均明显下降(P<0.05)。免疫荧光-荧光原位杂交实验表明,CHD4定位于HeLa细胞的端粒上。与对照组相比,CHD4的缺失不足以引起端粒的DNA损伤(P>0.05),但会导致HeLa细胞SFE的染色体比例明显增多(P<0.05)。结论CHD4可通过调控HeLa细胞的端粒功能,促进宫颈癌细胞的增殖和迁移。

染色质区解旋酶DNA结合蛋白5基因甲基化与结直肠癌的关系

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,在我国恶性肿瘤中的发病率列第3位,病死率列第5位[1].结直肠癌的发生机制尚不明确,近年来抑癌基因的异常甲基化成为研究热点.抑癌基因由于甲基化而失活,失去了抑癌作用,造成细胞发生单克隆增生形成肿瘤.染色质区解旋酶DNA结合蛋白5 （chromodomain helicase DNA binding protein 5,CHD5）基因是2003年被发现的抑癌基因,定位于人染色体1p36,可调控细胞增殖、凋亡和衰老,是肿瘤抑制调控系统的总开关.

染色质解旋酶DNA结合蛋白1样调控三阴性乳腺癌细胞对铂敏感性的作用及机制

目的观察染色质解旋酶DNA结合蛋白1样(CHD1L)调控三阴性乳腺癌(TNBC)细胞对铂(DDP)敏感性的作用并探索相关机制。方法收集212例乳腺癌患者和53例晚期TNBC患者组织标本,免疫组织化学法检测CHD1L表达水平,分析CHD1L表达与患者临床病理特征及对铂化疗疗效的相关性;采用细胞计数试剂盒(CCK-8)、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3试剂盒和蛋白质印迹法(Western blot)探究相关机制。组间比较采用t检验或χ^(2)检验。结果CHD1L在乳腺癌组织中表达高于癌旁组织(54.25%比18.40%,χ^(2)=58.90,P<0.01)且与高组织学分级(67.88%比29.33%,χ^(2)=29.02,P<0.01)和高细胞核增殖抗原(Ki-67)指数(64.17%比41.30%,χ^(2)=10.97,P<0.01)相关,其在TNBC亚型表达最高(68.18%);CHD1L阴性的TNBC晚期患者接受铂化疗的临床获益高于阳性患者(77.78%比42.86%,χ^(2)=4.52,P<0.05);CHD1L敲低后TNBC细胞存活和凋亡水平差异无统计学意义,但在DDP作用下敲低细胞存活率低于敲低前(97.00±2.00比43.67±2.52,t=28.74,P<0.05)且凋亡增加(0.87±0.21比4.33±0.60,t=-9.42,P<0.05),且磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/核因子-κB(NF-κB)通路相关蛋白在DDP作用下表达下调。结论CHD1L可能通过PI3K/Akt/NF-κB通路调控TNBC细胞对DDP的疗效。

人色素域解旋酶DNA结合蛋白5的基因克隆及其真核表达载体的构建

目的:克隆人色素域解旋酶DNA结合蛋白5(chromodomain helicase DNA-binding protein5,CHD5)基因并构建真核表达载体。方法:应用PCR扩增人CHD5基因的编码区,使用基因重组方法构建真核细胞表达载体peGFPc1-CHD5,实时定量PCR技术检测重组质粒peGFPc1-CHD5转染293T工具细胞后的过表达能力。结果:经过PCR方法,有效扩增了CHD5基因编码区,构建了peGFPc1-CHD5真核细胞表达质粒,测序分析表明所克隆的CHD5基因编码区序列无误。实时定量PCR检测结果表明重组质粒peGFPc1-CHD5能有效地过表达CHD5基因。结论:成功地构建了人CHD5的真核细胞表达载体peGFPc1-CHD5,并在293T工具细胞中实现过表达,为进一步研究奠定了实验基础。

喉鳞癌组织CHD5、E-cadherin、Smad4表达变化及其意义

目的探讨染色质区解旋酶DNA结合蛋白5(CHD5)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、Smad家族成员4(Smad4)在喉鳞癌组织中的表达变化及其意义。方法选择喉鳞癌组织及其配对的癌旁正常组织各35例份,采用免疫组化SP法检测两种组织CHD5、E-cadherin、Smad4表达。比较两种组织CHD5、E-cadherin、Smad4阳性表达,分析喉鳞癌组织CHD5、E-cadherin、Smad4阳性表达的关系及其与患者临床病理参数和预后的关系。结果喉鳞癌组织CHD5、E-cadherin、Smad4阳性表达率均低于癌旁正常组织(P均<0.05)。相关分析显示,喉鳞癌组织CHD5阳性表达与Smad4阳性表达呈正相关关系(r=0.810,P<0.05),与E-cadherin阳性表达无相关性(r=-0.263,P>0.05),E-cadherin阳性表达与Smad4阳性表达呈正相关关系(r=0.481,P<0.05)。喉鳞癌组织CHD5阳性表达与淋巴结转移、TNM分期有关,E-cadherin阳性表达与组织分化程度、淋巴结转移有关,Smad4阳性表达与淋巴结转移有关(P均<0.05)。CHD5、E-cadherin、Smad4阳性表达者术后生存时间>3年比例明显高于其阴性表达者(P均<0.05)。结论喉鳞癌组织CHD5、E-cadherin、Smad4低表达,其表达变化与喉鳞癌的恶性生物学行为和患者预后有关。

CHD1L在恶性肿瘤中的作用与机制研究进展

恶性肿瘤的发生发展与细胞增殖、凋亡或其他生物学过程中关键的癌症相关基因密切相关。染色质结构域解旋酶/ATP酶DNA结合蛋白1样基因(CHD1L)是一种新发现位于Chr1q21的致癌基因。CHD1L在许多人类正常组织中均有表达,且在肝癌、结直肠癌、胃癌、卵巢癌和神经胶质瘤等多种人类恶性肿瘤组织中高表达。CHD1L作为恶性肿瘤发生发展的促进因子,影响肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡和自噬等生物学过程,且其高表达与恶性肿瘤的不良预后密切相关。CHD1L在转录调控、维持染色体完整性和DNA修复中也发挥着重要作用。本文就CHD1L在恶性肿瘤中的作用及其机制研究进展进行综述,以期为CHD1L成为恶性肿瘤潜在标志物和临床治疗的新靶点提供参考。

CHD9:一个新的与流感病毒PA蛋白相互作用的宿主因子

PA蛋白是禽流感病毒(AIV)聚合酶的组成部分,对AIV的复制具有重要作用。为鉴定家鸭体内与AIV PA蛋白相互作用的宿主蛋白,本研究利用酵母双杂交系统,以表达A/goose/Hubei/65/05(H5N1)AIV PA蛋白的重组质粒为诱饵,筛选家鸭脑组织cDNA文库,鉴定得到一个cDNA片段,经测序分析表明,该cDNA片段编码蛋白为色素域解旋酶DNA结合蛋白9(CHD9)。将重组诱饵质粒pDEST32-PA与捕获的鸭cDNA重组质粒共转化MaV203受体菌,进行X-gal显色反应检测,分析结果显示,菌落可以迅速变蓝,并且菌落在SC-Leu-Trp-His+3AT 3种营养缺陷培养基平板上生长良好。证明CHD9与PA蛋白在酵母双杂交系统中具有较强的相互作用。CHD9的初步鉴定为研究AIV在机体中的复制过程奠定了基础。

CHD4基因表达对急性T淋巴细胞白血病细胞增殖和凋亡的影响及其启动子鉴定

目的:探讨人染色质解旋酶DNA结合蛋白4(recombinant chromodomain helicase DNA binding protein 4,CHD4)基因表达对急性T细胞淋巴细胞白血病细胞增殖和凋亡的影响及其启动子鉴定。方法:使用siRNA-CHD4瞬时转染T淋巴细胞白血病细胞(Jurkat)敲低CHD4基因表达,实时荧光定量q RT-PCR和Western blot检测细胞转染后CHD4表达量,流式细胞术测定细胞凋亡率及细胞周期变化;CCK-8分析测定CHD4基因对Jurkat细胞增殖的影响。根据生物信息学分析,以Jurkat细胞提取的全基因组DNA为模板,PCR扩增CHD4基因候选启动子区2 091 bp片段,以pGL3-Basic为载体,克隆含有CHD4基因候选启动子区的序列,制备重组质粒,并且构建一系列含CHD4基因候选启动子5′侧翼区截短序列质粒。将含CHD4启动子序列的质粒及截短序列质粒转染至Jurkat细胞和人胚胎肾T细胞(HEK293T),双荧光素酶报告基因检测各片段的启动子活性,确定CHD4基因启动子最小活性区域,并通过生物信息学方法分析该区域转录因子结合位点,构建结合位点突变的质粒,通过双荧光素酶报告基因检测,分析结合位点对CHD4转录的影响。结果:流式细胞检测结果发现,与对照组比较,CHD4抑制Jurkat细胞凋亡,转染siRNA-CHD4的Jurkat细胞G0/G1期比例显著升高,而S期比例下降(P<0.01);CCK-8检测CHD4基因对Jurkat细胞的增殖有促进作用(P<0.05);成功构建含有CHD4基因候选启动子序列的质粒及其截短序列质粒,与pGL3-Basic空载体相比,含有CHD4基因候选启动子序列的质粒活性明显增加(P<0.05)。CHD4基因最小活性区域位于转录起始位点-233~-13 bp,其中包含NF-κB、MZF1等转录因子结合位点;NF-κB对CHD4启动子活性具有正向调控作用。结论:CHD4基因对Jurkat细胞凋亡有抑制作用,并且促进其增殖。CHD4最小活性区域位于转录起始位点-233~-13 bp,转录因子NF-κB对CHD4基因启动子活性具有正向调控作用。

CHD4、FBXW7和SPOP基因在子宫内膜癌中表达的研究现状

近年来,子宫内膜癌在国内的发病率明显升高,导致该类恶性肿瘤发生、发展的遗传因素很多。色素域解旋酶DNA结合蛋白4(CHD4)、F框/WD40域蛋白7(FBXW7)和SPOP基因是最新发现的三个遗传驱动基因,它们在人类细胞周期的进展及细胞的生长、分化中起着重要的作用,可引起恶性肿瘤的发生、发展及变化,使不良预后增加。该文就联系这三个基因各自的结构与作用机制,及其在子宫内膜癌中的表达现状进行综述。

宫颈癌组织CHD1L ECRG4蛋白表达及其与HR-HPV感染的临床关系研究

目的探讨宫颈癌组织染色质解旋酶DNA结合蛋白1样基因(CHD1L)、食管癌相关基因4(ECRG4)蛋白表达,并分析其与高危-人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染的临床关系。方法选取98例宫颈癌患者癌组织、癌旁正常组织采用免疫组化法检测CHD1L、ECRG4蛋白表达并对比,对比不同临床病理特征患者宫颈癌组织CHD1L、ECRG4蛋白表达;分析宫颈癌组织CHD1L、ECRG4蛋白表达与HR-HPV感染的临床关系。结果宫颈癌组织CHD1L蛋白表达阳性率高于癌旁正常组织,ECRG4蛋白表达阳性率低于癌旁正常组织,差异均有统计学意义(P<0.05)。Ⅲ~Ⅳ期、腺癌、未/低分化患者宫颈癌组织CHD1L蛋白表达阳性率均高于Ⅰ~Ⅱ期、鳞癌/其他、中/高分化患者,宫颈癌组织ECRG4蛋白表达阳性率均低于Ⅰ~Ⅱ期、鳞癌/其他、中/高分化患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。HR-HPV感染占比为77.55%,HR-HPV感染患者宫颈癌组织CHD1L蛋白表达阳性率高于无HR-HPV感染患者,ECRG4蛋白表达阳性率低于无HR-HPV感染患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。宫颈癌组织CHD1L与HR-HPV感染呈正相关(r=0.702,P=0.026),ECRG4蛋白表达与HR-HPV感染呈负相关(r=-0.792,P=0.010)。结论宫颈癌组织CHD1L蛋白表达阳性率高,ECRG4蛋白表达阳性率低,与临床分期、病理类型、分化程度均有关,且前者与HR-HPV感染呈正相关,后者于HR-HPV感染呈负相关。

宫颈癌及宫颈上皮内瘤变患者高危型HPV感染与组织中CHD7、BPTF表达的关系

目的探讨宫颈癌及宫颈上皮内瘤变(CIN)患者高危型人乳头状瘤病毒(HPV)感染与组织中染色质解旋酶DNA结合蛋白7(CHD7)、溴区结构域转录因子(BPTF)表达的关系。方法将2018年5月—2020年5月进行宫颈活检或手术时取得的104例宫颈癌组织标本作为宫颈癌组,82例CIN组织标本作为CIN组,54例正常宫颈组织标本作为对照组。比较3组CHD7、BPTF、高危型HPV表达及不同临床病理特征宫颈癌患者CHD7、BPTF表达,探讨CHD7和BPTF表达与宫颈癌患者高危型HPV感染和预后关系。结果宫颈癌组、CIN组和对照组CHD7、BPTF和高危型HPV阳性表达率逐渐降低,两两比较差异均有统计学意义(P<0.01)。国际妇产科联盟(FIGO)分期为Ⅲ或Ⅳ期、分化程度为低分化、浸润深度≥肌层1/2、有淋巴结转移、高危型HPV阳性的宫颈癌患者CHD7和BPTF阳性表达率高于FIGO分期为Ⅰ或Ⅱ期、分化程度为中高分化、浸润深度<肌层1/2、无淋巴结转移、高危型HPV阴性的宫颈癌患者(P<0.05,P<0.01)。Spearman相关性分析结果显示,CHD7、BPTF表达与宫颈癌患者高危型HPV感染均呈正相关(r=0.407、0.469,P<0.001)。随访3年,104例宫颈癌总生存率为43.27%(45/104)。CHD7阴性表达(76.19%,16/21)宫颈癌患者的3年生存率高于CHD7阳性表达(34.94%,29/83)宫颈癌患者(P<0.01);BPTF阴性表达(77.78%,14/18)宫颈癌患者的3年生存率高于BPTF阳性表达(36.05%,31/86)宫颈癌患者(P<0.01)。结论CHD7和BPTF在宫颈癌患者中高表达,且与高危型HPV感染和预后存在关联。

胃癌组织中CHD1L表达及其临床意义

目的探讨染色质解旋酶DNA结合蛋白1样基因(CHD1L)在胃癌发生发展中的作用。方法采用实时定量RT-PCR和Western blot法观察3株人胃癌细胞系(AGS、N87、HGC-27)及正常胃黏膜上皮细胞中CHD1L mRNA和蛋白表达的差异;采用免疫组化法检测71例人胃癌组织及其配对癌旁组织中CHD1L蛋白表达,分析CHD1L与胃癌临床病理特征的关系。结果与正常胃黏膜上皮细胞比较,3株胃癌细胞系CHD1L mRNA和蛋白表达水平均明显上调(P<0.05);71例胃癌组织中CHD1L蛋白表达阳性率明显高于癌旁组织(P<0.05),CHD1L蛋白阳性表达与胃癌TNM分期、分化程度及淋巴结转移显著相关(P<0.05),与患者性别、年龄及肿瘤大小无相关性(P>0.05)。结论 CHD1L在胃癌的发生发展中起促进作用;CHD1L表达有助于判定胃癌恶性表型。

CHD5基因在食管癌中的表观遗传学改变

目的:研究食管癌发病过程中染色质解旋酶DNA结合蛋白5(Chromodomain helicase DNA-binding protein5,CHD5)基因表观遗传学改变,探讨CHD5基因甲基化作为食管癌诊断标志物的可行性.方法:用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific PCR,MSP)检测72例食管癌组织及成对癌旁组织,9例正常食管黏膜组织及4株食管癌细胞系中CHD5基因的甲基化状态,并用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测CHD5基因在上述食管癌细胞系的表达.结果:69%(50/72)食管癌组织发生CHD5基因启动子区甲基化,32%(23/72)癌旁组织发生甲基化,差异具有统计学意义(χ2=20.254,P<0.05).9例食管正常组织未发生甲基化,2株食管癌细胞系中由于基因启动子区甲基化导致CHD5基因表达缺失,经5-aza-deoxycytidine处理96h后CHD5重新表达.结论:食管癌中CHD5基因频繁发生甲基化,表观遗传学改变是其基因表达的重要调节机制,CHD5基因甲基化有可能作为食管癌诊断的标志物.

沉默CHD1L对前列腺癌PC3细胞恶性生物学行为的影响及其可能机制

目的:探讨染色质解旋酶DNA结合蛋白1样基因(chromodomain helicase/ATPase DNA binding protein 1-like gene,CHD1L)对前列腺癌细胞侵袭、迁移能力的影响及其可能的作用机制。方法:采用实时荧光定量PCR技术检测前列腺癌细胞株LNCAP、PC3、DU145以及前列腺上皮细胞株RWPE-1中CHD1L mRNA表达水平;转染siRNA干扰前列腺癌PC3细胞CHD1L的表达,并用Transwell侵袭实验和划痕实验分析沉默CHD1L对前列腺癌细胞侵袭和迁移能力的影响;Western blotting检测PC3细胞MMP-9、N-钙黏蛋白和E-钙黏蛋白的表达水平。结果:CHD1L mRNA在前列腺癌细胞中的表达水平明显高于前列腺上皮细胞(P<0.01),其中以前列腺癌PC3细胞的表达水平最高。侵袭实验中,干扰组的穿膜细胞数明显低于阴性对照组和空白对照组[(49.67±6.67)vs(113.67±5.69)和(112.00±12.49)个,P<0.05)。划痕实验中,干扰组48 h伤口愈合率也低于阴性对照组和空白对照组[(21.27±3.27)%vs(48.47±5.72)%和(49.93±3.35)%,P<0.05]。干扰组细胞MMP-9和N-钙黏蛋白表达下调,E-钙黏蛋白表达上调。结论:沉默CHD1L可降低前列腺癌PC3细胞的侵袭迁移能力,该作用可能是通过调控MMP-9和EMT相关蛋白表达实现的。

小鼠CHD5基因siRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建小鼠染色质区解旋酶DNA结合蛋白5(CHD5)基因干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)重组腺病毒载体并在NIH3T3细胞中验证其干扰作用.方法:人工合成靶向CHD5的siRNA干扰序列,用分子克隆的方法插入到穿梭载体pSES-HUS上,并与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,得到pAdeasy-SES-HUS-CHD5siRNA重组质粒,在HEK293细胞中包装成重组腺病毒Adr-simCHD5,然后感染NIH3T3细胞,用RT-PCR和Western Blot方法检测其对CHD5mRNA和蛋白表达的干扰效果.结果:得到高滴度Adr-CHD5siRNA重组腺病毒,RT-PCR和Western Blot结果表明该重组腺病毒能有效地降低CHD5基因的表达.结论:成功构建Adr-CHD5siRNA重组腺病毒载体,并在NIH3T3细胞上实现CHD5基因表达抑制,为进一步研究CHD5基因功能奠定了基础.

CRISPR/Cas9敲除CHD5基因促进前列腺癌细胞增殖

染色质域解旋酶DNA结合蛋白5(chromodomain helicase DNA binding protein 5,CHD5)是人类肿瘤中一个重要的抑癌基因,是肿瘤抑制网络的控制开关,但是它在前列腺癌发生发展中的作用却少有研究。本研究利用CRISPR/Cas9技术敲除前列腺癌细胞PC-3中CHD5基因,探索敲除CHD5基因对PC-3细胞增殖能力的影响。研究根据CRISPR/Cas9靶点设计规则设计了3组特异性sgRNA,连接到pLenti-U6-sgRNA-SFFV-Cas9-2A-Puro质粒构建表达载体。测序鉴定后将重组表达载体转染293T细胞包装慢病毒。包装慢病毒滴度分别为CHD5-sgRNA-17.84×10^9 TU/mL,CHD5-sgRNA-25.83×10^9 TU/mL,CHD5-sgRNA-35.23×10^9 TU/mL。用CHD5-sgRNA慢病毒感染PC-3细胞,嘌呤霉素筛选阳性细胞,Western印迹检测CHD5蛋白的表达水平,CCK-8、克隆形成实验以及细胞周期检测对PC-3细胞增值能力的影响。Western印迹结果显示,CHD5-sgRNA-1组CHD5蛋白质水平无明显变化,CHD5-sgRNA-2组和CHD5-sgRNA-3组CHD5蛋白质表达水平显著低于空白组和阴性对照组,成功获得稳定敲除CHD5基因的PC-3细胞系,其中感染CHD5-sgRNA-2的PC-3细胞中CHD5蛋白水平最低,用于后续研究。CCK-8结果显示,敲除CHD5促进PC-3细胞的增殖能力。空白组、阴性对照组以及CHD5-gRNA-2组的克隆数分别为(32.50±1.50)、(35.33±2.02)和(50.83±4.25)。细胞周期分析结果显示,G2/M期细胞分别为(7.56±0.59)%、(8.33±0.61)%和(27.21±1.04)%,差异均有统计学意义(P<0.01)。Western印迹证实,CHD5敲除后,G2/M期周期相关蛋白质细胞周期蛋白B1、cdc25C和cdc2的表达量增加,phospho-cdc25C、phospho-cdc2以及p21的表达水平下降(P<0.05)。以上结果表明,CHD5敲除的PC-3细胞系构建成功,CHD5表达缺失通过上调细胞周期蛋白B1、去磷酸化cdc25C、cdc2以及下调p21表达促进前列腺癌PC-3细胞增殖。