鸡球虫病是一种由艾美耳属原生动物寄生虫引起的肠道疾病,是影响家禽业的最重要疾病之一。目前,球虫病的控制主要依赖于抗球虫药物的使用,但由于药物的长期广泛使用导致了球虫的严重耐药性。为研究其耐药性机制,本实验室前期对柔嫩艾美...鸡球虫病是一种由艾美耳属原生动物寄生虫引起的肠道疾病,是影响家禽业的最重要疾病之一。目前,球虫病的控制主要依赖于抗球虫药物的使用,但由于药物的长期广泛使用导致了球虫的严重耐药性。为研究其耐药性机制,本实验室前期对柔嫩艾美耳球虫敏感株、地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株、盐霉素耐药株进行了转录组测序分析,发现与敏感株相比,柔嫩艾美耳球虫微管蛋白β链(Et TBC)仅在地克珠利耐药株高表达。本研究在此基础上,克隆、表达了EtTBC,并初步分析了其功能及与地克珠利的关系;以柔嫩艾美耳球虫敏感株cDNA为模板成功克隆了EtTBC基因,构建了原核表达重组质粒pET28a-Et TBC,并成功诱导表达了重组蛋白r Et TBC;利用qPCR对柔嫩艾美耳球虫敏感株不同发育阶段以及不同虫株(耐药株、敏感株和田间耐药株)的mRNA转录水平进行了分析,结果显示,该基因的转录水平在敏感株未孢子化卵囊阶段最高,且其mRNA转录水平仅在地克珠利耐药株上调;间接免疫荧光定位结果表明该蛋白主要分布在子孢子除折光体外的细胞质和表面,第二代裂殖子的细胞质和表面。展开更多
旨在真核表达系统中高效表达柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3(Eimeria tenellacalcium-dependent protein kinase-3,EtCDPK3),获得有活性的天然蛋白,利用毕赤酵母表达系统对该基因进行了表达。将EtCDPK3基因连接到毕赤酵母表达载体pPIC9K...旨在真核表达系统中高效表达柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3(Eimeria tenellacalcium-dependent protein kinase-3,EtCDPK3),获得有活性的天然蛋白,利用毕赤酵母表达系统对该基因进行了表达。将EtCDPK3基因连接到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,构建重组质粒pPIC9K-EtCDPK3。重组质粒通过电击转化入酵母细胞GS115后,用组氨酸缺陷培养基和G418分别进行筛选,获得含重组质粒的酵母表达细胞。重组酵母细胞在含1%甲醇的BMMY培养基中诱导产生目的蛋白,培养收集1-4 d的部分上清。经SDS-PAGE检测,所表达的蛋白相对分子质量约为49 kD。Western blotting表明,该蛋白能与兔抗EtCDPK3血清特异性结合。结果表明,柔嫩艾美耳球虫CDPK3基因在毕赤酵母中成功地进行了表达。展开更多
为了研究柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)感染对鸡血清细胞凋亡相关蛋白的影响,探讨柔嫩艾美耳球虫与宿主相互作用,将240只体重接近的7日龄海兰灰公雏鸡分为4组:A组为不感染不诱导凋亡组;B组为不感染诱导凋亡组;C组为感染不诱导凋亡组;...为了研究柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)感染对鸡血清细胞凋亡相关蛋白的影响,探讨柔嫩艾美耳球虫与宿主相互作用,将240只体重接近的7日龄海兰灰公雏鸡分为4组:A组为不感染不诱导凋亡组;B组为不感染诱导凋亡组;C组为感染不诱导凋亡组;D组为感染诱导凋亡组。诱导凋亡的处理方法是采血前2.5 h按6.4 mL/kg体重灌服40%酒精诱导凋亡,不诱导凋亡的处理则同时灌服与40%酒精等体积的生理盐水替代。于柔嫩艾美耳球虫感染(每只鸡感染1×10^5个柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊)后第24、48、72、96、120 h,每组抽取10只鸡心脏采血,制备血清,采用ELISA法检测血清中细胞色素C(Cyto-C)、半胱氨酸蛋白酶(Cas)-9、Cas-8、Cas-3、B细胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Bcl-XL、BH3结构域凋亡诱导蛋白(Bid)的浓度。结果显示,感染后24、48、72、96 h D组Cyto-C、Cas-9、Cas-8、Cas-3的浓度均低于B组,感染120 h D组Cyto-C、Cas-9、Cas-8、Cas-3的浓度均显著高于B组(P<0.05),感染24、48、72、96 h D组Bcl-2/Bax和Bcl-XL/Bid值均高于B组,感染120 h D组的Bcl-2/Bax低于B组,Bcl-XL/Bid值高于B组。说明柔嫩艾美耳球虫感染早期通过Bcl-2/Bax值、Cyto-C、Cas-9、Cas-8、Cas-3浓度的增加来抑制宿主细胞凋亡,感染中晚期通过Bcl-2/Bax值、Cyto-C、Cas-9、Cas-8、Cas-3浓度的降低促进宿主细胞凋亡。展开更多
文摘鸡球虫病是一种由艾美耳属原生动物寄生虫引起的肠道疾病,是影响家禽业的最重要疾病之一。目前,球虫病的控制主要依赖于抗球虫药物的使用,但由于药物的长期广泛使用导致了球虫的严重耐药性。为研究其耐药性机制,本实验室前期对柔嫩艾美耳球虫敏感株、地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株、盐霉素耐药株进行了转录组测序分析,发现与敏感株相比,柔嫩艾美耳球虫微管蛋白β链(Et TBC)仅在地克珠利耐药株高表达。本研究在此基础上,克隆、表达了EtTBC,并初步分析了其功能及与地克珠利的关系;以柔嫩艾美耳球虫敏感株cDNA为模板成功克隆了EtTBC基因,构建了原核表达重组质粒pET28a-Et TBC,并成功诱导表达了重组蛋白r Et TBC;利用qPCR对柔嫩艾美耳球虫敏感株不同发育阶段以及不同虫株(耐药株、敏感株和田间耐药株)的mRNA转录水平进行了分析,结果显示,该基因的转录水平在敏感株未孢子化卵囊阶段最高,且其mRNA转录水平仅在地克珠利耐药株上调;间接免疫荧光定位结果表明该蛋白主要分布在子孢子除折光体外的细胞质和表面,第二代裂殖子的细胞质和表面。
文摘为了研究柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)感染对鸡血清细胞凋亡相关蛋白的影响,探讨柔嫩艾美耳球虫与宿主相互作用,将240只体重接近的7日龄海兰灰公雏鸡分为4组:A组为不感染不诱导凋亡组;B组为不感染诱导凋亡组;C组为感染不诱导凋亡组;D组为感染诱导凋亡组。诱导凋亡的处理方法是采血前2.5 h按6.4 mL/kg体重灌服40%酒精诱导凋亡,不诱导凋亡的处理则同时灌服与40%酒精等体积的生理盐水替代。于柔嫩艾美耳球虫感染(每只鸡感染1×10^5个柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊)后第24、48、72、96、120 h,每组抽取10只鸡心脏采血,制备血清,采用ELISA法检测血清中细胞色素C(Cyto-C)、半胱氨酸蛋白酶(Cas)-9、Cas-8、Cas-3、B细胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Bcl-XL、BH3结构域凋亡诱导蛋白(Bid)的浓度。结果显示,感染后24、48、72、96 h D组Cyto-C、Cas-9、Cas-8、Cas-3的浓度均低于B组,感染120 h D组Cyto-C、Cas-9、Cas-8、Cas-3的浓度均显著高于B组(P<0.05),感染24、48、72、96 h D组Bcl-2/Bax和Bcl-XL/Bid值均高于B组,感染120 h D组的Bcl-2/Bax低于B组,Bcl-XL/Bid值高于B组。说明柔嫩艾美耳球虫感染早期通过Bcl-2/Bax值、Cyto-C、Cas-9、Cas-8、Cas-3浓度的增加来抑制宿主细胞凋亡,感染中晚期通过Bcl-2/Bax值、Cyto-C、Cas-9、Cas-8、Cas-3浓度的降低促进宿主细胞凋亡。