柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白Et RON2 L1-2特性与功能初步分析

为研究柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2(RON2)同源分子——Et RON2 L1-2的分子特性与功能,利用实时荧光定量PCR、Western blot、入侵抑制试验、间接免疫荧光试验以及双分子荧光互补实验(BiFC)等方法分析其生物学特征。结果发现Et RON2 L1-2蛋白序列与Et RON2仅有29.69%的同源性,转录水平和蛋白水平均在第二代裂殖子阶段最高。抗r Et RON2 L1-2抗体对子孢子入侵细胞有明显抑制作用。Et RON2 L1-2蛋白主要分布于经PBS孵育子孢子的胞质和表面,并分布于经完全培养基孵育或入侵DF-1细胞后2 h子孢子的顶端;其表达量在滋养体和未成熟裂殖体增加,且在带虫空泡膜也有分布;在第二代裂殖子中主要分布于整个胞质。Et RON2 L1-2与柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原4(AMA4)之间存在互作关系。

柔嫩艾美耳球虫保守蛋白EtCHP35特性和功能初步研究

鸡球虫病是由几种艾美耳属寄生虫寄生引起的一种家禽肠道疾病。目前,对于该病控制仍然主要依赖于抗球虫药物,但长期广泛地使用药物造成了球虫耐药性的产生。为研究球虫耐药性产生的分子机制,本实验室前期对柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药株、地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株以及敏感株进行了转录组测序并获得了敏感株与耐药株的差异表达基因,发现柔嫩艾美耳球虫保守蛋白35(EtCHP35)在盐霉素耐药株和马杜拉霉素耐药株mRNA转录水平显著上调。本研究以柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊cDNA第一链为模板,成功克隆了柔嫩艾美耳球虫保守蛋白35(EtCHP35)基因,并在原核表达系统中成功表达了重组蛋白(rEtCHP3)。利用实时荧光定量PCR分析了该基因在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段以及不同虫株(敏感株和耐药株)的mRNA转录水平,结果显示EtCHP35基因在敏感株孢子化卵囊的mRNA转录水平最高;与敏感株相比,EtCHP35的mRNA转录水平在马杜拉霉素耐药株和盐霉素耐药株上调,但在地克珠利耐药株mRNA转录水平无差异,且随着盐霉素耐药株浓度的升高,EtCHP35的mRNA转录水平也升高。间接免疫荧光定位结果表明该蛋白主要分布在子孢子和第二代裂殖子的表面和顶部。因此,推测该蛋白可能参与了虫体在宿主体内的生长发育、对宿主细胞的识别附着、逃避宿主免疫应答以及球虫对离子载体类药耐药性产生的过程。

柔嫩艾美耳球虫微管蛋白β链基因EtTBC的克隆、表达及特性的初步分析

鸡球虫病是一种由艾美耳属原生动物寄生虫引起的肠道疾病,是影响家禽业的最重要疾病之一。目前,球虫病的控制主要依赖于抗球虫药物的使用,但由于药物的长期广泛使用导致了球虫的严重耐药性。为研究其耐药性机制,本实验室前期对柔嫩艾美耳球虫敏感株、地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株、盐霉素耐药株进行了转录组测序分析,发现与敏感株相比,柔嫩艾美耳球虫微管蛋白β链(Et TBC)仅在地克珠利耐药株高表达。本研究在此基础上,克隆、表达了EtTBC,并初步分析了其功能及与地克珠利的关系;以柔嫩艾美耳球虫敏感株cDNA为模板成功克隆了EtTBC基因,构建了原核表达重组质粒pET28a-Et TBC,并成功诱导表达了重组蛋白r Et TBC;利用qPCR对柔嫩艾美耳球虫敏感株不同发育阶段以及不同虫株(耐药株、敏感株和田间耐药株)的mRNA转录水平进行了分析,结果显示,该基因的转录水平在敏感株未孢子化卵囊阶段最高,且其mRNA转录水平仅在地克珠利耐药株上调;间接免疫荧光定位结果表明该蛋白主要分布在子孢子除折光体外的细胞质和表面,第二代裂殖子的细胞质和表面。

柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白EtRON2_(L2)特性与功能初步分析

利用RT-PCR、间接免疫荧光实验、免疫印迹实验、抗体中和实验以及BiFC等方法对柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2同源分子—Et RON2_(L2)的特性和功能进行研究。结果发现Et RON2_(L2)氨基酸序列与常规的Et RON2仅有26.63%的同源性,mRNA水平在第二代裂殖子中最高,而蛋白水平在第二代裂殖子和子孢子阶段最高;Et RON2_(L2)在游离的第二代裂殖子和子孢子阶段主要分布于胞质,而在入侵后子孢子中主要分布于虫体表面;抗rEt RON2_(L2)多克隆血清处理组明显抑制子孢子入侵细胞;Et RON2_(L2)与EtAMA3之间存在互作关系。本研究为探究Et RON2_(L2)在球虫入侵过程中的作用机制奠定基础。

柔嫩艾美耳球虫感染鸡盲肠内容物非靶向代谢组学分析

【目的】基于非靶向代谢组学探究感染柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)后鸡盲肠内容物中代谢物的变化差异,为识别和鉴定鸡球虫病潜在的生物标志物及治疗靶点提供参考依据。【方法】将60羽健康罗曼粉鸡随机分为正常组和模型组,每组30羽,模型组经口灌服柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊(1×104个/羽),正常组经口灌服等体积生理盐水,连续灌服5 d,然后解剖试验鸡,无菌采集鸡盲肠内容物,基于非靶向代谢组学分析正常组和模型组鸡盲肠内容物,筛选出显著差异代谢物进行KEEG代谢通路富集分析。【结果】从模型组与正常组的鸡盲肠内容物中共筛选到253种显著差异代谢物,其中,上调表达的显著差异代谢物有184种,包含L-酪氨酸、L-蛋氨酸、L-谷氨酰胺、牛磺酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸乙酯、胆碱和磷酸胆碱等;下调表达的显著差异代谢物有69种,包括脱氧腺苷、L-缬氨酸、N-(5-氨基戊基)乙酰胺和N-乙酰-L-谷氨酸等。正离子模式下,主要有牛磺酸、磷酸胆碱、甜菜碱、L-亮氨酸、L-谷氨酰胺、胆碱、神经鞘氨醇和L-色氨酸等20种代谢物上调表达;负离子模式下,主要有花生四烯酸、牛磺酸、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、琥珀酸、黄嘌呤、尿嘧啶和L-谷氨酰胺等20种代谢物上调表达。鸡盲肠内容物显著差异代谢物主要被富集到ABC转运蛋白、氨酰tRNA生物合成、赖氨酸降解、嘧啶代谢、嘌呤代谢、不饱和脂肪酸生物合成等20条KEEG代谢通路上。【结论】柔嫩艾美耳球虫感染后鸡盲肠代谢物发生显著变化,主要影响ABC转运蛋白、氨酰tRNA生物合成、氨基酸代谢、嘧啶代谢和嘌呤代谢等代谢通路。因此,牛磺酸、磷酸胆碱、L-谷氨酰胺、花生四烯酸等显著差异代谢物可作为潜在的生物标志物,用于鸡球虫病诊断检测。

玉屏风加减煎剂对德化黑鸡柔嫩艾美耳球虫的抗感染效果

【目的】探明玉屏风加减煎剂对柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)感染德化黑鸡抗氧化、抗炎、免疫功能的影响及抗球虫效果。【方法】将120只45日龄德化黑鸡随机分为6组,分别是空白对照组(K组)、感染对照组(G组)、常山青蒿低剂量组(CQL组)、玉屏风加减低剂量组(YL组)、常山青蒿高剂量组(CQH组)、玉屏风加减高剂量组(YH组),除空白对照组外,其余各组均感染柔嫩艾美耳球虫,24 h后开始连续7 d饮水给药,第8 d测定比较各组抗球虫指数、免疫功能、抗氧化能力等指标的差异。【结果】与感染对照组(G组)相比,中药处理组CQH、YH、CQL、YL的血便、盲肠病变症状依次减轻。除CQH组外,其他组盲肠病变计分、盲肠黏膜下淋巴细胞密度显著或极显著下降(P<0.05或P<0.01);除CQH组OPG显著下降(P<0.05)外,其他3个中药组OPG下降极显著(P<0.01);YL组和YH组盲肠上皮细胞脱落计分极显著降低(P<0.01)。与CQL、CQH组相比,YL、YH组MDA、盲肠病变计分、盲肠上皮细胞脱落计分和OPG下降极显著(P<0.01)。与G组相比,4个中药组IL-6、 IFN-γ、TNF-α、丙二醛(MDA)含量极显著降低(P<0.01),而IL-2含量、 SIgA水平、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、总抗氧化能力(T-AOC)极显著升高(P<0.01);YL组IL-2含量、 SIgA水平、GSH-Px活性、SOD活性、CAT活性极显著增高(P<0.01),YH组GSH-Px、 SOD活性极显著升高(P<0.01)。与K组相比,G组、CQL组、YL组、CQH组、YH组的相对增重率分别是79.88%、 103.49%、 107.27%、 95.05%、 96.06%,抗球虫指数(anti-coccidialindex,ACI)分别是96、165.5、177、133.5、162.5。【结论】玉屏风加减煎剂对人工感染柔嫩艾美耳球虫德化黑鸡具有更好抗炎、抗氧化、提高免疫功能的免疫调节作用,并相应具有更好的抗球虫效果,且以玉屏风加减低剂量组(YL)抗球虫效果最好。

柔嫩艾美耳球虫莫能菌素耐药株筛选及其与敏感株基因组SNP密度分布差异分析

【目的】明确莫能菌素耐药虫株与敏感虫株在基因水平的差异,进而解析莫能菌素耐药性产生的分子机制。【方法】通过模拟田间感染的方式诱导柔嫩艾美耳球虫对莫能菌素的耐药性。第1次诱导试验,将400只14日龄无球虫鸡平均分为2组,分别为Ⅰ组(接种不加药组)和Ⅱ组(莫能菌素推荐剂量组),按照100 mg/kg在基础饲粮中添加莫能菌素。从Ⅰ组中随机选择10只鸡,接种对莫能菌素敏感的柔嫩艾美耳球虫豪顿株,剂量为5000卵囊/鸡。自接种后8 d开始,将Ⅰ组新鲜粪便抛洒到Ⅱ组垫料上模拟球虫田间感染,连续抛洒17 d。接种后33 d,随机剖检Ⅱ组10只鸡,收集盲肠内卵囊。第2次诱导试验,将100只14日龄无球虫鸡作为Ⅲ组(莫能菌素高剂量组),按照133 mg/kg在饲料中添加莫能菌素,随机选择10只鸡接种收集的卵囊,剂量为5000卵囊/鸡。接种后17 d,莫能菌素添加量提高至400 mg/kg。接种后27 d,收集盲肠卵囊。以抗球虫指数(ACI)、病变记分减少率(RLS)、相对卵囊产量(ROP)和最适抗球虫活性百分率(POAA)四项指标综合判定诱导株的耐药性。提取耐药株或敏感株孢子化卵囊基因组并进行基因组重测序,通过单核苷酸多态性(SNP)密度分布解析耐药株与敏感株之间的差异。【结果】第1次诱导试验,接种后33 d获得耐100 mg/kg莫能菌素的卵囊(1×莫能菌素诱导株)。第2次诱导试验,接种后27 d获得耐400 mg/kg莫能菌素的卵囊(4×莫能菌素诱导株)。4×莫能菌素诱导株的ACI为121,POAA为25.4%,RLS为33%,POP为64%。与参考基因组相比,敏感株基因组SNP共12191个,耐药株基因组SNP共74931个,耐药株在第11号染色体3.3~4.2 Mb区间内SNP富集分布,该区间内3个基因ETH2_1113700、ETH2_1113500和ETH2_1113600的SNP位于编码区。【结论】本研究获得了对莫能菌素完全耐药的柔嫩艾美耳球虫耐药株。在第11号染色体,耐药株与敏感株的SNP分布具有显著差异,筛选到3个耐药候选基因。

常山散对雏鸡感染柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段的防治效果

旨在研究中药常山散对雏鸡感染柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段抗球虫效果和免疫功能的影响。试验设置6大组,分别为攻虫前1天、攻虫当天、第2天、第3天、第4天和第5天给药时间点设计组,每个设计组包括3个处理组,分别为Ⅰ组(健康对照组)和Ⅱ组(感染对照组),饲喂基础饲粮;Ⅲ组(常山散推荐剂量组),按照0.1g·kg^(-1)在基础饲粮中拌料饲喂,连续给药4 d,每组10只鸡,共180只。16日龄时,Ⅱ组和Ⅲ组每只鸡口服5×10^(4)个柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊。结果表明:与Ⅰ组相比,Ⅲ组的日均增重(average dialy gain, ADG)在球虫发育前期(攻虫前1天、攻虫当天)差异不显著(P>0.05),发育后期显著降低(P<0.05),Ⅱ组在球虫发育的整个时期ADG均显著降低(P<0.05),降低幅度大于Ⅲ组。与Ⅰ组相比,Ⅱ组和Ⅲ组的日均采食量(average daily feed intake, ADFI)有所下降,其中Ⅱ组下降最为明显,Ⅲ组有所改善。与Ⅱ组相比,中药常山散显著(P<0.05)降低感染雏鸡每克粪便卵囊数(oocysts per gram, OPG)。球虫感染破坏盲肠黏膜的完整性,使盲肠肌膜增厚。中药常山散可减轻球虫感染引起的肠黏膜损伤。与Ⅱ组相比,饲粮中添加常山散可降低盲肠病变评分(P<0.05)。攻虫前1天、攻虫当天和第2天试验组中Ⅲ组的抗球虫指数(anticoccidial index, ACI)分别为198.83、190.23、165.49,攻虫第3、4和5天试验组中Ⅲ组的ACI分别为150.53、155.00和146.18,说明在球虫发育的前期给药,常山散具有良好的抗球虫效果,后期随着球虫在鸡体内的发育,常山散的治疗效果降低。与Ⅱ组相比,常山散增加血液中免疫球蛋白IgA、IgM、IgG含量,提高脾脏指数和法氏囊指数。综上所述,常山散可改善感染雏鸡的生长性能,显著降低感染雏鸡OPG和盲肠病变评分,增强感染雏鸡免疫功能。

柴胡皂苷体内外抗鸡柔嫩艾美耳球虫的研究

为了探究柴胡皂苷对柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)体内外感染的影响,本实验采用CCK-8法检测2倍倍比稀释(0.384 g/L~0.0645 g/L)的柴胡皂苷对MDBK细胞活力的影响,结果显示,浓度为0.0645 g/L的柴胡皂苷对MDBK细胞的活力影响最小,并且可以促进细胞的生长,因此以该浓度的柴胡皂苷进行后续试验。本研究设置阴性对照组(NC)、E.tenella感染组(PC)、磺胺嘧啶钠对照组(WM)以及柴胡皂苷治疗组(CA)。除NC组外,每组细胞加入1.6×10^(6)个E.tenella子孢子,4 h后WM组加入0.5 g/L磺胺嘧啶钠,CA组加入0.0645 g/L柴胡皂苷,继续培养至不同时间,分别提取4组细胞蛋白,通过western blot检测感染E.tenella的MDBK细胞中p65蛋白的磷酸化水平;采用荧光定量PCR(qPCR)检测4组细胞中炎症因子的转录水平。Western blot结果显示,培养至24 h时,4组细胞中p65蛋白磷酸化水平均无显著差异;感染48 h与72 h时,与WM和PC组相比,CA组细胞中p65蛋白磷酸化水平极显著降低(P<0.001),但与NC组之间无显著差异(培养48 h)和极显著高于NC组(P<0.001,培养72 h)。qPCR结果显示,培养24 h和48 h,各组细胞中各细胞因子的相对转录水平虽有不同,但在培养72 h时,与PC组和WM组相比,CA组MDBK细胞中促炎因子IL-1β、IL-8、TNF-αmRNA的转录水平极显著降低(P<0.001);24 h时,CA组细胞中抑炎因子IL-10 mRNA的转录水平极显著低于WM组(P<0.0001),但在48 h和72 h时,IL-10 mRNA的转录水平逐渐升高,并极显著高于其他3组(P<0.0001)。将13日龄白羽肉鸡设为上述4个组。除NC组外,每组雏鸡均口服感染2×10^(4)个E.tenella孢子化卵囊。感染后2 d,CA组雏鸡口服0.0645 g/L柴胡皂苷,1 mL/只,WM组雏鸡口服0.5 g/L磺胺嘧啶,1 mL/只,共服用7 d。感染后4 d~8 d,采用血球计数板计算每组鸡粪便卵囊排出率。感染后8 d将各组鸡称重后剖杀,观察盲肠的剖检病变,并通过计算各组肉鸡的相对增重率、存活率、卵囊值以及盲肠病变值计算每组雏鸡的抗球虫指数(ACI);分别于感染后4 d、6 d和8 d分别剖杀10只鸡,取盲肠组织制备病理切片,观察各组鸡盲肠组织的病变。结果显示,CA组鸡粪便卵囊排出率为22.00%,极显著低于PC组(P<0.0001),极显著高于WM组(P<0.0001);ACI为173.13,极显著高于PC组和WM组(P<0.0001),达到中效抗球虫水平;剖检病变观察可见PC组雏鸡的盲肠肠壁变薄,长度变短,高度肿胀,而CA组鸡盲肠肠壁逐渐恢复正常形态,与WM组雏鸡盲肠改善结果接近;组织病变可见,与PC组和WM组相比,CA组盲肠无炎性细胞浸润且肠绒毛肠壁形态完整,未观察到E.tenella裂殖子。以上结果首次证实柴胡皂苷在体内外均可有效抑制E.tenella对细胞的感染,并且能够改善与修复E.tenella对雏鸡盲肠的损伤,本研究为天然中药成分用于治疗E.tenella的感染提供参考依据。

“复方常青”对鸡柔嫩艾美耳球虫感染的疗效

为探究基于网状Meta分析配制出的中药组方“复方常青”对鸡柔嫩艾美耳球虫病的治疗效果,将180只黄羽肉鸡随机分为6组,分别为复方常青高、中、低剂量组(A、B、C),地克珠利组(D),不攻虫也不给药的阴性对照组(E)和攻虫不给药的阳性对照组(F)。除E组外,雏鸡在15日龄灌服1×10^(5)个球虫孢子化卵囊以构建感染模型;A、B、C组以中药原药兑水给药,给药浓度分别为5、2.5、1 mL/L,D组以地克珠利溶液1 mL/L兑水给药,并从18日龄起连续治疗5 d。通过增重情况、料肉比、盲肠病变、每克盲肠内容物卵囊数、存活率、抗球虫指数及细胞因子稳态来评价药物治疗效果。结果显示,A组对感染雏鸡增加体重、减轻盲肠病变、减少每克盲肠内容物卵囊数及提高存活率的作用优于其他治疗组,所获得的抗球虫指数最高(>180);B组对细胞因子IL-17、IL-10平衡作用优于其他治疗组。表明复方常青中药组方可有效的治疗鸡柔嫩艾美耳球虫病。

鸡柔嫩艾美耳球虫2种假定致密颗粒蛋白基因的克隆与表达

柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)是一种严重危害养鸡业健康发展的高致病性原虫,致密颗粒蛋白(dense granule proteins,GRAs)是顶复合器门原虫胞内寄生重要功能蛋白,具有较高的免疫学应用价值,然而目前尚未有关于球虫致密颗粒蛋白的确切报道。为发掘柔嫩艾美耳球虫GRAs并研究其功能,采用生物信息学、分子生物学、免疫学等技术从E.tenella北京株中鉴定到2种假定致密颗粒蛋白(hypothetical dense granule protein,hEtGRA)hEtGRA12、hEtGRA9,并用纯化后的蛋白分别免疫小鼠制备多克隆抗体,用ELISA、Western blot方法检测2种蛋白的抗原性。分子克隆结果表明,hEtGRA 12、hEtGRA 9基因编码区长度分别为1188、1110 bp,分别编码395、369个氨基酸,与其他顶复合器门原虫致密颗粒蛋白GRA12、GRA9物种间相似性分别为28.8%~39.6%、27.5%~29.5%;SDS-PAGE结果显示,重组蛋白rhEtGRA12、rhEtGRA9条带大小分别为63.6、67.0 ku;ELISA与Western blot结果表明,重组蛋白rhEtGRA12、rhEtGRA9均能诱导小鼠产生较高的抗体水平,且均可被鸡抗E.tenella阳性血清识别,表明具有较好的抗原性。该研究鉴定到2种球虫假定致密颗粒蛋白基因hEtGRA 12、hEtGRA 9,获得了重组蛋白rhEtGRA12、rhEtGRA9,为球虫致密颗粒蛋白基因功能和免疫应用研究奠定了基础。

柔嫩艾美耳球虫热休克蛋白90和组蛋白4对DF-1细胞凋亡的影响

为了探究柔嫩艾美耳球虫热休克蛋白90(EtHSP90)和组蛋白(EtH4)在体外对鸡胚成纤维细胞(DF-1细胞)凋亡的影响,本试验构建真核荧光表达质粒pEGFP-N1-EtHSP90和pEGFP-N1-EtH4并转染至DF-1细胞,用荧光显微镜观察转染效果,Western blot验证蛋白表达,流式细胞术检测DF-1细胞凋亡。结果显示,经验证成功构建重组质粒pEGFP-N1-EtHSP90和pEGFP-N1-EtH4。流式细胞术检测发现,pEGFP-N1-EtHSP90组早期凋亡率显著低于空白组、pEGFP-N1组和pEGFP-N1-EtH4组(P<0.05);pEGFP-N1-EtH4组早期凋亡率与空白组和pEGFP-N1组相比差异不显著(P>0.05)。因此,EtHSP90早期可抑制细胞凋亡,EtH4既不促进细胞凋亡,也不抑制细胞凋亡。本试验结果为后续深入探究2个蛋白的凋亡机制提供理论基础。

黄连厚朴复方水提物对鸡柔嫩艾美耳球虫病的疗效试验

为了增强药物的疗效以及更好提升病鸡的生长性能,本研究配伍黄连厚朴为核心的连朴水提物,以探究其抗球虫效果。黄连厚朴复方水提物的抗球虫指数(ACI)为169.48,达到良好抗球虫效果,能有效减少柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)感染造成的盲肠损伤、卵囊的排出数量以及血便的数量,恢复其生长性能;外周血清中的细胞因子结果表明,黄连厚朴复方水提物可以降低促炎因子在血清中的含量,提升白细胞介素10的含量,从而达到降低炎症的发生;黄连厚朴复方水提物可以提高抗氧化酶在感染期间的含量,减少过氧化物丙二醛和一氧化氮的含量,具有抗氧化应激的作用。研究表明,黄连厚朴复方水提物可能是治疗柔嫩艾美耳球虫感染的一种有效替代抗生素等化学合成药物的天然中草药。

对氯间甲酚及复方对氯间甲酚对鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊的抑杀效果

为验证苯酚类消毒剂对鸡球虫卵囊的抑杀作用,采用不同浓度的单体和复方对氯间甲酚消毒剂与未孢子化的柔嫩艾美耳球虫卵囊共孵育,检测其对卵囊孢子化率的影响;与孢子囊共同孵育,通过子孢子脱囊率评价其对子孢子释放的干扰。孢子化卵囊经过不同浓度消毒剂直接浸泡、粪便干扰下浸泡或喷雾处理后经口接种雏鸡,通过OPG和盲肠病变记分探究消毒剂处理对卵囊的繁殖力和鸡的致病性的影响。结果显示,2种消毒剂均可使孢子化率和子孢子脱囊率显著下降,且3种浓度的复方对氯间甲酚与3%氨水对照组(PC)的消毒效果无显著差异。直接浸泡处理试验结果显示,2%和3%复方对氯间甲酚(HTS2和HTS3)具有更为显著的抑杀效果,与PC无显著差异;粪便干扰试验结果显示,粪便作用下这两种消毒剂对球虫卵囊仍有理想的抑杀效果;喷雾处理试验结果显示,3%对氯间甲酚(HT3)对球虫卵囊抑杀效果最好,显著优于PC组(P<0.05),而2%对氯间甲酚(HT2)、HTS2和HTS3组的抑杀效果与PC组无显著差异。研究结果表明,不同浓度下这2种消毒剂对孢子化和未孢子化的柔嫩艾美耳球虫卵囊都有一定的抑杀作用,综合比较,复方对氯间甲酚消毒剂具有更强的抑杀球虫卵囊效果,具有代替氨水成为鸡球虫消毒剂的潜能。

柔嫩艾美耳球虫重组Profilin蛋白对鸡的免疫保护效果评价

【目的】通过对柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)Profilin基因进行原核表达和纯化,探明重组Profilin蛋白对鸡的免疫保护效果。【方法】设计合成Profilin基因特异性引物,提取E.tenella孢子化卵囊总RNA,反转录成cDNA,用PCR扩增获得Profilin基因后连接至pET-32a(+)载体构建重组质粒pET-32a(+)-Profilin,在IPTG诱导下进行表达并纯化。用重组Profilin蛋白免疫雏鸡,随后经口服感染柔嫩艾美耳球虫卵囊,测定和统计雏鸡存活率、平均增重、血便计数、每克粪便卵囊数、卵囊产量、盲肠病变,计算抗球虫指数,观察盲肠组织病理学变化并测定血清中IL-2、IL-10、TNF-α、sIgA的水平以评估重组Profilin蛋白的免疫保护效果。【结果】成功表达了重组Profilin蛋白,大小为39.1 kDa。免疫保护试验表明:Profilin重组蛋白组鸡只存活率、鸡只血便数和OPG相对于感染不免疫攻虫组显著减少(P<0.05);50μg重组蛋白免疫组的体增重效果最好,达93%,卵囊产量最少,ACI效果最好;100μg重组蛋白免疫组的盲肠损伤最小,而免疫器官指数未见显著差异(P>0.05)。在攻虫后7 d,感染不免疫攻虫组血清中IL-2、TNF-α、IL-10以及sIgA水平相比于空白对照组均极显著升高(P<0.01),而重组蛋白免疫组血清中IL-2、TNF-α、IL-10以及sIgA水平极显著低于攻虫不免疫组(P<0.01)。【结论】柔嫩艾美耳球虫重组Profilin蛋白可减少感染雏鸡的增重损失和卵囊排出,引发雏鸡体内的细胞免疫和体液免疫,具有一定的免疫保护效果。

柔嫩艾美耳球虫贵阳株对6种抗球虫药物的耐药性试验

为探究柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella,E.tenella)贵阳株对6种抗球虫药物的耐药性,试验将1日龄黄羽蛋鸡144只随机分为地克珠利组(D组)、妥曲珠利组(T组)、莫能菌素组(M组)、盐酸氯苯胍组(Y组)、癸氧喹酯组(G组)和磺胺氯吡嗪钠组(H组)6个给药组及感染模型组(C组)和空白对照组(K组),每组18只鸡,在14日龄时,对6个给药组分别连续给药8 d;15日龄时,除K组外,其余各组一次口服接种E.tenella贵阳株孢子化卵囊2×10^(4)个,观察各组雏鸡临床症状,计算雏鸡增重、相对增重率、料肉比、盲肠病变记分、每克盲肠内容物卵囊数和存活率、最适抗球虫活性百分数、盲肠病变记分减少率、相对卵囊产量和抗球虫指数(ACI),综合判断E.tenella贵阳株对6种抗球虫药物的耐药性。结果表明:口服接种E.tenella贵阳株孢子化卵囊3 d后,除K组外,各组雏鸡均表现出食欲下降、排血便等临床症状;D组、G组和Y组雏鸡的食欲、饮水及精神状态等较C组稍好,症状较轻。D组增重和相对增重率最大,增重显著高于C组(P<0.05);且料肉比最低,显著低于C组(P<0.05)。D组、Y组和G组盲肠病变记分显著低于C组和H组(P<0.05);D组、T组、M组、Y组和G组每克盲肠内容物中的卵囊数显著低于C组和H组(P<0.05)。M组存活率为90%,其他各组均为100%;D组、G组、Y组ACI>180,D组最佳(ACI=196.60)。E.tenella贵阳株对地克珠利无耐药性,对盐酸氯苯胍和癸氧喹酯轻度耐药,对妥曲珠利中度耐药,对磺胺氯吡嗪钠和莫能菌素完全耐药。说明贵阳地区在防治E.tenella病时,应将地克珠利作为首选药物,盐酸氯苯胍和癸氧喹酯作为备选药物(抑制球虫在体内增殖的效果较好),停止使用妥曲珠利、磺胺氯吡嗪钠和莫能菌素,并注意轮换、交叉、联合用药,避免产生耐药性。

鸡柔嫩艾美耳球虫对托曲珠利的耐药性检测

为研究鸡柔嫩艾美耳球虫对不同剂量托曲珠利的耐药性,从张家口地区规模化养鸡场采集未使用过抗寄生虫药物鸡只的粪便并进行球虫卵囊分离和复壮。试验设5个感染用药组(Ⅰ组,25 mg/L剂量;Ⅱ组,50 mg/L剂量;Ⅲ组,75 mg/L剂量;Ⅳ组,100 mg/L剂量;Ⅴ组,125 mg/L剂量)和2个对照组(Ⅵ组,感染不用药组;Ⅶ组,不感染不用药组),Ⅰ~Ⅴ组采用托曲珠利饮水给药方式,Ⅵ组和Ⅶ组的鸡正常饲喂日粮,Ⅰ~Ⅵ组进行球虫感染,检测耐药虫株。结果显示,25 mg/L剂量组和50 mg/L剂量组的托曲珠利产生耐药,75 mg/L剂量组、100 mg/L剂量组和125 mg/L剂量组的托曲珠利不耐药。结果表明,张家口地区鸡柔嫩艾美耳球虫耐托曲珠利的浓度为50 mg/L,为张家口地区鸡球虫病的防治提供了参考。

不同杀虫剂对鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊孢子化的影响

为了解不同杀虫剂对鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊孢子化的影响,为鸡球虫病的防治提供参考。试验采用不同浓度的大灭25CS(1∶50、1∶100)、保安定500EC(1∶2500、1∶5000)、大灭G 15.1%ZC(1∶100、1∶200)、剑心200SC(1∶800、1∶1600)分别对鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊作用24、48 h,观察其对球虫卵囊孢子化的影响。结果表明,不同杀虫剂对鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊的孢子化均有一定的抑制作用,但其抑制作用随着时间的推移有所减弱;不同杀虫剂使鸡柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊的外观结构出现皱褶、凹陷等变化。这些试验结果为鸡柔嫩艾美耳球虫病的预防提供了新的思路。

中药组方预防多重耐药鸡柔嫩艾美耳球虫感染的效果探究

研究旨在探究自拟中药组方“香芪汤”对田间分离的多重耐药鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)感染的预防效果研究。72只10日龄雄性黄羽肉鸡随机分为6组,分别为空白对照组、感染组、中药预防组、中药防治组、地克珠利预防组和中药对照组。除空白对照组、中药对照组外,其余各组鸡于15日龄时经口灌服5×10~4个柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊(记为0 h);中药预防组、地克珠利预防组和中药对照组感染前120 h连续在饮水中添加相应药物至0 h,中药防治组感染前48 h在饮水中添加相应药物至感染后72 h。感染后192 h剖杀各组鸡,采集盲肠、脾脏、肝脏组织。记录并统计各组鸡脏器指数、相对增重率、盲肠病变记分、卵囊值和存活率,计算抗球虫指数(ACI);利用组织切片和扫描电镜观察盲肠损伤,试剂盒检测盲肠组织中炎症、氧化应激相关因子水平。结果显示:与感染组相比,中药预防组、中药防治组ACI值均显著升高(P<0.05),肝脏、脾脏指数均显著降低(P<0.05),盲肠黏膜组织结构损伤均明显减轻,盲肠组织中促炎因子(肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β)、丙二醛含量显著降低(P<0.05),抑炎因子白细胞介素-10含量、抗氧化酶(超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶)活性显著升高(P<0.05)。结果表明“,香芪汤”对多重耐药鸡柔嫩艾美耳球虫株感染具有良好的预防效果。

柔嫩艾美耳球虫和肠致病性大肠杆菌双重PCR检测方法的建立及流行病学调查应用

【目的】建立可同时检测柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella,E.tenella)和肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)的双重PCR检测方法,为临床E.tenella继发EPEC病的检测提供技术支持。【方法】基于E.tenella和EPEC(escV)分别设计2条特异性引物,并通过退火温度、模板浓度和引物浓度等优化多重PCR的反应条件,建立2种病原体的双重PCR检测方法,并运用该方法检测贵州地区490份肉鸡、蛋鸡粪便样品,进行流行病学分析。【结果】该方法所需模板DNA的最低浓度组合为3.5ng/μL,最佳退火温度为62℃,最佳引物浓度组合为0.1 nmol/μL。流行病学调查显示,贵州毕节样本中E.tenella和EPEC的阳性率均为36.36%,混合感染阳性率9.09%;贵州黎平仅有EPEC感染,阳性率为23%;贵州习水样本中未检测出阳性,锦屏样本中E.tenella阳性率为11.11%,EPEC阳性率为22.22%,无混合感染。总样本中E.tenella、EPEC及2种混合感染的阳性率分别为10.20%、18.37%和2.04%。【结论】建立的柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella,E.tenella)和肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)双重PCR检测方法具有特异性强、敏感性高和重复性好的优点。