基于减毒单增李斯特菌递呈鸡柔嫩艾美耳球虫MIC3抗原的重组疫苗免疫保护效果的评估

本实验室前期构建的基于毒力基因改造的减毒单增李斯特菌(LM-1)被证实是一种较为安全的疫苗载体。为构建表达鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)毒力蛋白MIC3的重组减毒单增李斯特菌(LM)疫苗候选株并评估其对雏鸡的免疫保护效果,本研究在LM-1基础上采用同源重组的方法将MIC3蛋白关键功能区(aa159~aa252)编码基因(475 bp~756 bp)定点整合至LM-1基因组中,并与LM溶血素O(LLO,其编码基因为Rly)融合表达获得重组LM-1-MIC3菌株并经PCR鉴定;western blot检测LM-1-MIC3中MIC3和LLO的表达;测定细菌体外生长曲线检测LM-1-MIC3的体外生长能力;将野生菌株EGO-e、LM-1、LM-1-MIC3分别感染雏鸡72 h和144 h后,分别剖杀,取各组雏鸡肝脏和脾脏,经菌落计数对雏鸡肝脾载菌量进行测定并评估LM-1-MIC3在雏鸡体内的增殖能力;将野生株EGD-e、LM-1和LM-1-MIC3感染雏鸡并结合临床症状及致死率评估LM-1-MIC3对雏鸡的安全性;将LM-1-MIC3免疫雏鸡并建立E.tenella感染模型,研究其对雏鸡抗球虫感染的免疫保护效果。PCR鉴定结果显示正确构建重组菌株LM-1-MIC3;western blot结果显示LM-1-MIC3分泌的融合蛋白LLO-MIC3能够在培养上清液中大量表达;细菌体外培养结果显示LM-1-MIC3体外生长能力与EGD-e和LM-1无显著差异,表明融合LLO的MIC3不会影响LM-1的生长;雏鸡肝脾载菌量测定结果显示,与EGD-e组相比,各时间段LM-1-MIC3组雏鸡肝脾载菌量均极显著降低(P<0.01),感染LM-1-MIC3后雏鸡均存活且无明显临床症状,表明LM-1-MIC3对雏鸡致病力高度减弱,可以作为减毒疫苗载体;免疫保护试验结果显示在攻虫10 d后,LM-1-MIC3免疫组雏鸡的存活率高于LM-1免疫组及PBS对照组,且该组鸡无明显临床症状,剖杀后盲肠病变评分极显著低于LM-1和PBS组(P<0.001),表明LM-1-MIC3对雏鸡有良好的免疫保护效果。本研究构建了重组减毒株LM-1-MIC3,并证实该重组菌对雏鸡具有较好的免疫保护效果,为减毒LM载体疫苗在防控重要动物传染病中的研究与应用奠定了科学基础。

柔嫩艾美耳球虫BJ株核酸疫苗的构建及其免疫保护效果研究

将 E.tenella BJ株的保护性抗原基因 TA4插入真核表达载体中 ,然后在其上游融合方式插入 Et1A基因 ,构建成核酸疫苗并进行体外表达。IFAT检测表明 ,p CT转染细胞的荧光亮度高 ,p CTE载体大 ,转染效率低 ,荧光较弱。动物保护性试验中 ,间隔一周两次免疫鸡后攻虫发现 ,核酸疫苗对球虫感染具有明显的保护作用 ,可显著减轻球虫感染引起的机体增重下降 ,其中 ,重组干扰素联合 p CT中剂量 (5 0 μg)免疫时 ,鸡的增重效果最为明显 ,盲肠病变值也最小 ,ACI可达 16 7.2。试验还发现 ,5 0 μgp CTE可达到 10 0 μg p CT的抗球虫效果 ,ACI在 16 0以上 。

巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫早熟株对8种抗球虫药的敏感试验

为检测巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫早熟株对常用抗球虫药的敏感性,选用地克珠利、氯苯胍、二硝托胺、癸氧喹酯、尼卡巴嗪、马杜米星、盐霉素和拉沙洛西等8种抗球虫药进行鸡体试验,通过抗球虫活性百分比(percent of optimum anticoccidial aetivity,POAA)、病变记分减少率(reduction of lesion scores,RLS)、相对卵囊产量(relative oocyst production,ROP)和抗球虫指数(anticoccidial index,ACI)4项指标进行综合评价。结果表明,巨型艾美耳球虫早熟株对8种药物敏感;柔嫩艾美耳球虫早熟株对盐霉素轻度敏感,对地克珠利、氯苯胍、二硝托胺、癸氧喹酯、尼卡巴嗪、马杜米星和拉沙洛西敏感。本研究结果可为对球虫早熟株疫苗的开发与应用提供实验依据。

雏鸡免疫柔嫩艾美耳球虫早熟株和毒株的细胞免疫反应

AA肉鸡雏鸡分别经口免疫柔嫩艾美耳球虫毒株早熟株 ,用免疫组化ABC法染色检测小肠、盲肠扁桃体、脾脏中CD4 +、CD8+T淋巴细胞动态变化 ;用淋巴细胞转化实验MTT法检测T淋巴细胞活性。结果表明 :球虫免疫鸡后 ,CD4 +T淋巴细胞在一次免疫后迅速增殖 ,第 6天达到第一峰 ,免疫柔嫩艾美耳球虫毒株的鸡盲肠与脾脏中CD4 +T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到 38%和 4 4 % ,免疫早熟株的鸡盲肠与脾脏中CD4 +T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到 36 %和 4 3% ,而二次免疫后和对照相比很少有显著差异。CD8+T淋巴细胞在一次免疫后比CD4 +增殖速度慢 ,第 9天达到第一峰 ,免疫柔嫩艾美耳球虫毒株的鸡在此日盲肠与脾脏中CD8+T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到 37%和 4 7% ,免疫早熟株的鸡在此日盲肠与脾脏中CD8+T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到 36 %和 4 8% ,二次免疫后迅速大量增殖 ,免疫柔嫩艾美耳球虫毒株的鸡在二免后第2天盲肠与脾脏中CD8+T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到 39%和 5 0 % ,免疫柔嫩艾美耳球虫早熟株的鸡在二免后第 2天盲肠与脾脏中CD8+T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到 37%和 5 0 %。且CD8+T淋巴细胞总体水平比CD4 +T淋巴细胞多。

陕西省杨凌区柔嫩艾美耳球虫早熟株选育及致病性研究

采用球虫早熟系虫株选育的方法,反复收集感染后最先排出的卵囊,选育出杨凌地区鸡柔嫩艾美耳球虫早熟株并对早熟株的潜伏期、致病性及繁殖能力进行了研究。结果表明,经18代选育的鸡柔嫩艾美耳球虫杨凌早熟株的潜伏期比母株缩短了24h;早熟株卵囊的形态与母株相似,但没有母株卵囊的大;早熟株的繁殖能力低于母株,每羽鸡所排卵囊总量与剂量呈正相关,而每个卵囊的繁殖能力与剂量呈负相关;早熟株的致病性低于母株。

柔嫩艾美耳球虫早熟株的内生发育及其致病性

为了给鸡球虫早熟弱毒疫苗的开发提供依据,对柔嫩艾美耳球虫(Eim eria tenella) 北京株经10 代早熟选育获得的早熟株的内生发育研究发现,其第2 代裂殖生殖发育较快,第2 代裂殖体含裂殖子较少,提前进入配子生殖,从而造成卵囊“早熟”。该早熟株致病性大大下降,经口感染10×104 个/只的致病性仅相当于剂量0.1×104 个/只亲本毒株的致病性。该虫株可作为研制早熟弱毒苗用虫株。

柔嫩艾美耳球虫早熟株免疫剂量研究

为了确定柔嫩艾美耳球虫（Eimenatenella）早熟株合适的免疫剂量，本文设立7个早熟株免疫攻虫组、1个不免疫攻虫组和1个不免疫不攻虫组，免疫组的免疫剂量为孢子化卵囊100、200、400、600、800、1000和2000个／羽，经嗉囊感染，7日龄首次免疫，14日龄以同等剂量进行第二次免疫，21日龄以8×10^4个／羽的同源母株进行攻虫，28日龄结束试验，以存活率、增重、肠道病变记分、血便数量、卵囊减少率为观测指标。对免疫保护效果较好的3个免疫剂量进行重复试验，同时设置商品化球虫疫苗对照组，免疫方法、试验周期、试验指标同第一批试验。结果显示：攻虫后，不免疫攻虫组出现5％死亡，而各免疫组来出现死亡；各免疫组卵囊减少率在61．57％～69．52％；200～2000免疫组的增重与不免疫不攻虫组差异不具备显著统计学意义（P〉0．05）；600～2000免疫组的肠道病变记分和血便数量均明显少于不免疫攻虫组（P〈0．05）。用600、800和1000进行重复试验，三个免疫组攻虫期间均来出现死亡，而不免疫组和疫苗对照组均出现5％死亡；三个免疫组的增重均明显高于不免疫攻虫组和疫苗对照组（P〈0．05）；早熟株免疫组的肠道病变记分和血便数量明显低于不免疫攻虫组（P〈0．05），而疫苗对照组与不免疫攻虫组的相当（P〉0．05）；卵囊减少率在66.30％-78．75％，高于疫苗对照组的51．82％。结果表明，该柔嫩艾美耳球虫早熟株保持了良好的免疫原性，不同免疫剂量均能诱发鸡产生免疫保护力，其中600、800和1000个／羽的免疫效果均优于疫苗对照组，可考虑以600个／羽作为该早熟株在疫苗制备中的推荐免疫剂量。

柔嫩艾美耳球虫山西株早熟系的免疫特性

对鸡柔嫩艾美耳球虫山西株早熟系的免疫特性进行了研究。结果表明:该株的早熟系与亲本株具有相同的免疫原性,但致病性大大降低;其最佳免疫剂量和次数:首次免疫为1500个/只,14 d后以2000个/只二免,二免后免疫保护期可达90 d以上,免疫后鸡群的抗球虫能力与血清中特异性IgG的变化规律一致;提示该早熟系具备早熟疫苗株的免疫特性。

柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)早熟株与亲本株致病性和繁殖力的研究

通过对经15代选育的柔嫩艾美耳球虫(E. tenella)山西株的早熟株与其亲本株的繁殖力和致病性进行比较研究,证实早熟株的潜隐期比亲本株缩短21 h,繁殖力下降40%左右;对致病性的研究显示,早熟株感染后对鸡只增重、AC I的影响较小,对11日龄雏鸡的半数感染量和半数致死量较亲本株增大,肠道病变记分较亲本株下降。由此认为,该早熟株符合球虫早熟株的特性,可用于鸡球虫病早熟苗的制作。

柔嫩艾美耳球虫早熟耐药株对几种抗球虫药的敏感性

为了探讨鸡柔嫩艾美耳球虫早熟耐药株对常用抗球虫药的敏感性，采用尼卡巴嗪、氯苯胍、球痢灵、地克珠利和常山酮5种抗球虫药，对由晋球1号球虫疫苗虫株复制的病鸡进行防治试验，通过相对卵囊产量（ROP）、相对增重率、抗球虫指数（ACI）、病变记分减少率（RLS）和最适抗球虫活性百分率（PoAA）5项指标进行综合评定。结果表明，柔嫩艾美耳球虫早熟耐药株对盐酸氯苯胍无抗药性，对地克珠利有轻度抗药性，对常山酮、球痢灵、尼卡巴嗪有部分抗药性，它们的抗球虫指数为187．46～246．75，达到了抗球虫效果。

柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)“早熟株”对雏鸡免疫保护力的影响

实验采用人工培育的不同剂量柔嫩艾美耳球虫( E.tenella) “早熟株”接种雏鸡,测定出雏鸡血钠、血钾、血钙、血糖、血红蛋白的变化。结果表明,不同剂量的“早熟株”对所测定的雏鸡生理生化指标均有影响,其中2-0 ×104/ 只指标基本与对照组相同,对雏鸡有较好的保护作用,该剂量可作为未来弱毒苗的参考剂量。

柔嫩艾美耳球虫早熟株的选育及其免疫原性研究

运用Jeffers(1975)法进行了柔嫩艾美耳球虫早熟株的选育,经过连续13代的选育,获得了柔嫩艾美耳球虫早熟株,该虫株的潜隐期为121h,比柔嫩艾美耳球虫亲本毒株的潜隐期提前了22h以上.免疫攻毒试验的结果表明柔嫩艾美耳球虫早熟株和其亲本毒株一样也具有免疫原性.

柔嫩艾美耳球虫早熟耐药株对磺胺类抗菌药的耐药性研究

目的:检测柔嫩艾美耳早熟耐药株对4种磺胺类抗菌药的耐药性,为鸡球虫疫苗的临床应用提供依据。方法:采用鸡体实验法,以最适抗球虫活性百分数(POAA)、病变记分减少率(RLS)、相对卵囊产量(ROP)和抗球虫指数(ACI)四项指标综合判定接种5×104个柔嫩艾美耳早熟耐药株对消炎磺、磺胺嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶、磺胺氯吡嗪钠4种磺胺类抗菌药的耐药性情况。结果:磺胺嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶、磺胺氯吡嗪钠的POAA均小于界定值50%,为阳性,只有消炎磺的POAA值大于50%,为阴性。四种药物的RLS和ROP值均为阳性。消炎磺、三甲氧苄氨嘧啶的ACI值为160-179,具有中等抗药能力,磺胺嘧啶、磺胺氯吡嗪钠的ACI值低于160,为阳性,具有完全的耐药性。结论:柔嫩艾美耳早熟耐药株对消炎磺、三甲氧苄氨嘧啶具有中等程度的抗药性,磺胺嘧啶、磺胺氯吡嗪钠具有完全的耐药性。

杨凌地区柔嫩艾美耳球虫早熟株对雏鸡免疫效果的研究

用杨凌地区鸡柔嫩艾美耳球虫早熟株和母株分别免疫鸡,对免疫前后鸡体的平均增重、饲料转化率、盲肠病变记分和卵囊抑制率等指标进行了分析。结果发现,早熟株免疫组对球虫再攻击时的卵囊减少率分别为77.3%和67.6%,高于母株免疫组的41.7%和57.1%,且对同种同株球虫攻虫时的保护力优于同种不同株球虫。经2次免疫后,早熟株免疫组的鸡平均增重、饲料转化率均高于母株免疫组和对照组,而盲肠病变记分小于后者;早熟株免疫组经球虫攻击后卵囊的繁殖量明显减少,且卵囊抑制率均在91%以上。

柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)早熟株的选育及其生物学特性的研究

本研究对柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)北京株进行10代早熟选育,获得早熟弱毒株,对其生物学特性研究证实:该早熟株潜隐期为123h,比亲本毒株缩短了21h;内生发育研究发现其第二代裂殖生殖发育较快,第二代裂殖体含裂殖子较少,提前进入配子生殖;该早熟株繁殖能力下降,仅为毒株为24.75%;该早熟株致病性大大下降,经口感染发现剂量为10×10~4/只的早熟株的致病性仅相当于剂量10×10~2/只亲本毒株的致病性;对其免疫原性研究发现;①分别用剂量为1000个卵囊/只的早熟株丝。

鸡柔嫩艾美耳球虫早熟耐药株的放松传代及其特性研究

为了进一步验证鸡柔嫩艾美耳球虫早熟耐药株经本动物(鸡)连续传代后的毒力和遗传稳定性,为虫种种子传代提供依据,试验对鸡柔嫩艾美耳球虫早熟耐药株(Etpp)用11日龄敏感鸡连续放松传代10次,其潜隐期、排卵囊高峰、卵囊产量、致病性和免疫原性均保持了早熟耐药株(Etpp)的特征,说明所选育的虫株(Etpp)在遗传上具有稳定性。

柔嫩艾美耳球虫F2株弱毒疫苗最佳免疫剂量和安全性的研究

为了研究柔嫩艾美耳球虫F2株弱毒疫苗对肉鸡免疫的安全性和最佳免疫剂量,试验分两部分进行研究,试验一通过观察相对增重率、成活率、病变记分、克粪便卵囊值、抗球虫指数,以及ELISA法检测不同剂量免疫后肉鸡体内的抗体水平来确定最佳免疫剂量;试验二按照试验一确定的最佳免疫剂量的5,10,15,20倍免疫健康雏鸡,免疫后从病变记分、增重、盲肠病变等指标评估疫苗的致病变作用。综合试验一和试验二的结果,观察各组鸡的临床症状、免疫和攻虫结果、免疫后的效果。结果表明:柔嫩艾美耳球虫F2株弱毒疫苗在预防肉鸡球虫病方面是安全和有效的,并且在3日龄和10日龄每只鸡分别免疫4 000个卵囊能取得比较理想的效果。

不同地理株鸡柔嫩艾美耳球虫致病性的研究

采用盲肠病变记分、每克粪便含有的卵囊数、粪便记分、肉鸡增重等检查方法对来自山东、吉林、黑龙江、北京4个不同地区的鸡柔嫩艾美耳球虫的致病性进行了研究。将上述各株球虫分别接种10日龄AA肉鸡,并于接种后5d开始进行各项指标的检测。结果表明:山东株(S株)的致病性最强,黑龙江株(H株)和吉林株(J株)的致病性次之,北京株(B株)最弱。

鸡球虫病四价活疫苗对毒害艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫的免疫效果观察

为评价一种商品化鸡球虫病四价活疫苗[柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)、巨型艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫]对E.necatrix和E.tenella的免疫保护效果,本研究基于试验鸡血便记分、存活率、相对增重率、病变值、卵囊值及抗球虫指数(ACI)等指标对其免疫效果进行检测。结果表明,免疫攻虫组抗E.necatrix和E.tenella的ACI分别为157.3和135.6,均低于160,表明该球虫疫苗抗两种球虫的效果均为低效。然而,免疫攻虫组鸡血便数量、血便记分、增重、卵囊产量和病变记分等指标均优于阳性对照组。综合指标显示,该疫苗对E.necatrix和E.tenella具有一定的免疫保护力,但单纯采用疫苗并不能够达到防控鸡球虫病的目的。

柔嫩艾美耳球虫野外抗药性虫株的RAPD分析

用RAPD方法对柔嫩艾美耳球虫 (Eimeriatenella)的 8个分别来源于黑龙江、北京、四川、甘肃和广东的中山、新会、东莞以及广州近郊的江村镇的野外分离虫株和 2个药物敏感性虫株进行了遗传多态性分析。同时用 9种抗球虫药物即马杜霉素 (5mg/kg)、盐霉素 (6 0mg/kg)、莫能霉素 (12 0mg/kg)、拉沙菌素 (90mg/kg)、克球多(15 0mg/kg)、常山酮 (3mg/kg)、氯氢苯乙氰 (1mg/kg)、尼卡巴嗪 (12 5mg/kg)和球痢灵 (12 5mg/kg)分别对 8个野外虫株进行抗药性试验 ,8个虫株对上述药物均有不同程度的抗药性。RAPD分析表明 :10个样品都有相似而清晰的主带 ,每个泳道有 5～ 13条带不等 ,大小为 0 18～ 2 10kb。它们之间的相似率 (SI)大于 4 0 5 8% ,最大的为90 72 % ,这种相似率属种内变异水平。根据SI值可把 10个样品划分为 3个类群 :广东虫株类群 ,群内比较 ,平均SI值为 76 6 0 % ;广东省外虫株类群 ,群内比较的平均SI值为 72 14 % ;敏感株类群 ,其间的SI值为 89 2 7%。在另一方面 ,广东株与广东省外株、敏感株之间比较 ,其SI的平均值分别仅为 6 3 0 3%和 4 7 2 5 % 。