微生物柚苷酶的研究进展

柚苷酶是一种具有α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶两种酶学活性的酶,在柑橘类产品脱苦、鼠李糖和普鲁宁制备及类固醇的生物转化等方面具有广泛的应用前景。柚苷酶来源广泛,其主要来源为微生物。不同来源柚苷酶的酶学性质往往会存在差异,从而影响其应用领域。系统地从柚苷酶来源、微生物产酶、活力测定、分离纯化与性质、克隆表达、结构、固定化及应用等方面对柚苷酶进行了综述,有助于指导其更好地科学研究和工业化应用。

产柚苷酶菌株改良、性质及其在柑橘酒中的应用研究进展

柚苷酶是由α-L-鼠李糖苷酶及β-D-葡萄糖苷酶组成的复合酶,不同来源的柚苷酶在酶学性质和结构特性上有一定的差异,目前柚苷酶的主要来源是真菌,真菌来源的柚苷酶最适温度为50~60℃,最适pH值范围为4.0~6.0,但柚苷酶的整体结构、两种单组分酶的比例构成,至今尚无详尽的报道。柚苷酶作用于柑橘酒时,不仅能脱苦,还能提高柑橘酒的香气,其在提高柑橘酒的品质方面具有潜在的应用价值。本文对柚苷酶的酶学特性、结构特性、柑橘酒中的苦味物质及柚苷酶在柑橘酒中的应用等进行了综述,以期为柚苷酶的进一步研究和应用提供理论支持。

海藻酸钙/硅胶/羧甲基壳聚糖复合微球固定化柚苷酶的研究

柚苷酶可对柑橘类水果中的柚皮苷等苦味物质进行水解,从而实现果汁的脱苦或普鲁宁等医药中间体的制备。作者采用滴入法制备具有环境友好且易获得特性的海藻酸钙/硅胶/羧甲基壳聚糖复合微球,以此作为载体,用于柚苷酶的固定化研究。结果表明,在硅胶/羧甲基壳聚糖质量比1.0∶1.5、交联时间2.0 h、固定化温度25℃、偶联时间4 h、给酶量465.6 U/mL的实验条件下,复合微球固定化柚苷酶的比活力、载酶率和酶活力回收率分别可达203.33 U/g、36.80%和62.15%。同时,相比游离柚苷酶,该复合微球固定化柚苷酶对pH和温度变化均显示出更好的稳定性,且更易操作和储藏。此外,海藻酸钙/硅胶/羧甲基壳聚糖复合微球固定化柚苷酶的应用能够进一步拓宽柚苷酶在食品、医药等领域的深入发展。

柚苷废水中乳酸菌的筛选及其发酵工艺优化

本研究从自然发酵的柚苷废水中筛选获得了1株产酸和增殖能力较强的乳酸菌柚1,利用形态学、生理生化和16S rDNA测序鉴定其为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。以柚1作为发酵菌种进行柚苷废水发酵工艺优化,通过单因素和正交试验对发酵培养基热处理工艺、培养基组分和发酵条件进行优化,结果表明:发酵培养基的最佳热处理工艺为65℃水浴5 min,发酵培养基的最佳配方为:柚苷废水+1%玉米粉+1%豆粕,最适发酵条件为:接种量1.5%,培养温度32℃,培养时间30 h,在此条件下发酵柚苷废水中的菌数可达9.72×10^(8)cfu/mL,总酸度为11.62 g/L,乳酸含量为6.36 g/L。通过发酵处理,为柚苷废水的饲料化利用提供了可能,并为动物养殖提供了一种富含益生菌、有机酸及柚果中水溶性提取物的潜在饲料添加剂产品。

柚苷酶生产菌的选育

柚苷酶作为苦味物质柚苷的分解酶有望在柑桔加工生产得到应用。研究设计和试验了1种新的柚苷酶筛选模型,在堆积过腐坏柑桔的土壤中分离了多株产柚苷酶菌株。其中SN01产酶最高,摇瓶产酶达291U/ml,初步鉴定为黑曲霉。经NTG诱变、筛选,育成菌株SN90,其摇瓶产酶可达1282U/ml。研究发现菌株SN90的产酶过程需要柚苷诱导并对葡萄糖浓度不敏感,为低分解代谢物阻遏型突变株,因而该菌株具有较好的工业应用潜力。

几种树脂对柚苷的吸附作用研究

对5种大孔树脂进行了柚苷静态等温吸附、动态吸附、解吸和果皮柚苷提取液吸附试验。结果表明这五种树脂对柚苷的吸附和解吸性能良好，其中A、B、C3种树脂效果最佳，它们的单分子层的饱和吸附量分别是95．3mg／g，111．5mg／g和115．0mg／g，对浓度1mg／ml柚苷的无泄漏吸附量分别是34．7mg／ml，32．8mg／ml和37．5mg／ml。只需要2～3倍床体积的95％乙醇即可全部洗脱柚苷。它们可用于柚苷的回收和提纯，以及抽和葡萄柚汁的脱苦。

一株产柚苷酶菌株黑曲霉的分离及菌种鉴定的初步研究

设计试验了一种新的柚苷酶产生菌的选育模型,以橘皮粉为唯一的碳和氮源,通过富集培养的方式从腐烂的橘皮上筛选出一株高产柚苷酶生产菌株A166。对该菌株进行摇瓶发酵测定酶活力达到955.6 U/mL。通过对该菌株的形态特征、培养特征的观察,对照《真菌鉴定手册》初步判定该菌株为黑曲霉(Aspergillus nigeer)。并对该菌株所产柚苷酶对柑桔类果汁进行了一定的脱苦性实验。

柚苷酶在柑桔果醋加工中的应用

在柑桔果醋加工中 ,利用柚苷酶进行脱苦实验 ,结果表明 :发酵温度在 2 5℃— 2 8℃ ,酸度控制在 0 5— 0 8g/ 10 0mL ,柚苷酶加量在 15 μ/mL ,柚苷酶有较佳的活性 ;酒精度为 6 0 %— 8 0 %(V)时 ,有利于醋酸发酵 ,制得的果醋清亮透明 ,酸甜可口 ,果香明显 ,基本无苦味。

环氧基树脂固定化青霉菌柚苷酶的工艺条件

采用国产Seplite LX-1000EP树脂对青霉菌柚苷酶进行固定化,以期提高其稳定性和利用效率。将单因素试验和Box-Behnken试验设计结合对影响Seplite LX-1000EP树脂固定化柚苷酶的主要影响因素进行分析、优化。结果显示,最佳固定化条件为:酶液pH 6.5、固定化温度为26.6℃、载体投放量为0.79 g、固定化时间为24 h,此时固定化柚苷酶酶活达到3 949.32 U/g,酶活回收率提高至44.79%,蛋白固定率为98.43%,说明将Seplite LX-1000EP树脂用于柚苷酶的固定化是切实可行的。

MCM-41固定化柚苷酶脱苦葡萄柚汁

以介孔分子筛MCM-41为载体,戊二醛为交联剂,采用吸附-交联法进行了柚苷酶的固定化。研究了酶液浓度、戊二醛浓度、吸附交联时间和固定化pH对固定化效果的影响,对影响固定化效果的因素进行了分析。确定最佳的固定化条件为:酶液浓度为0.4mg/mL,戊二醛浓度2.0%,吸附交联时间为6h,固定化pH为4.0(醋酸缓冲液)。采用海藻酸钠和聚乙烯醇对制备的固定化酶进行二次包埋处理,并应用于葡萄柚汁的脱苦。结果显示,游离酶和MCM-41固定化酶对果汁的脱苦率分别为96.65%和92.90%,海藻酸钠和聚乙烯醇二次固定化的柚苷酶脱苦率分别为72.64%和70.90%。脱苦后的果汁营养成分与理化指标均有一定程度降低。为柚苷酶的固定化提供了一种新型的载体材料,为固定化柚苷酶在果汁脱苦中的工业化应用提供了理论基础。

聚乙烯醇-海藻酸钙固定化柚苷酶

利用聚乙烯醇(PVA)-海藻酸钙为载体,通过戊二醛交联,制备水不溶性的固定化柚苷酶凝胶颗粒。结果显示:添加戊二醛和延时包埋法制备的固定化酶凝珠活力较高。固定化酶的优化工艺为:以9.0g/100mLPVA与1.0g/100mL海藻酸钠为载体,固化剂CaCl2的质量浓度为1.0g/100mL,酶液质量浓度2.0mg/mL,固定化时间10h。同时对固定化酶与游离酶的性质进行比较研究:柚苷酶经PVA-海藻酸钙固定化后,其反应最适pH值和最适温度没有改变,但热稳定性提高,重复使用6次仍保持60%的酶活力。

Penicillium sp. 1523产柚苷酶摇瓶发酵培养基优化

采用单因素试验、Plackett-Burman设计和响应面分析相结合的方法,对Penicillium sp.1523产柚苷酶的摇瓶发酵培养基配方进行优化。单因素试验结果显示:发酵培养基中的最优碳源为玉米粉,最优氮源为豆饼粉;Plackett-Burman设计筛选出影响柚苷酶产量的3个重要因素为玉米粉、豆饼粉和柚苷,在此基础上运用最陡爬坡试验逼近最大响应值区域,再利用Box-Behnken试验设计及响应面分析法进行回归分析,获得最佳培养基配方为:玉米粉31.14g/L、豆饼粉31.53g/L、柚苷1.65g/L、K2HPO4 1.00g/L、ZnSO4 0.10g/L、MgSO4.7H2O 0.06g/L、CaCl20.10g/L。在优化后的条件下摇瓶发酵产柚苷酶酶活力为(891.79±6.33)U/mL,与模型预测值接近,发酵产酶量比优化前提高70.8%。

黑曲霉DB056柚苷酶制剂对琯溪蜜柚果汁的脱苦效果

采用高效液相色谱法测定琯溪蜜柚果汁中柚皮苷及其降解产物的变化,研究黑曲霉DB056柚苷酶制剂脱苦琯溪蜜柚果汁的优化条件;并且在此优化条件下,使用该柚苷酶制剂对琯溪蜜柚鲜柚汁、浑浊浓缩柚汁和澄清浓缩柚汁进行脱苦。结果表明:黑曲霉DB056柚苷酶制剂催化琯溪蜜柚果汁中柚皮苷水解成普鲁宁和柚皮素;该柚苷酶制剂在40～55℃、果汁自然pH值条件下对琯溪蜜柚鲜柚汁进行脱苦,酶用量90U/mL、处理时间80min,柚皮苷脱除率达到89%;处理不同浓缩程度的浑浊浓缩柚汁,脱苦率约为80%左右。结果说明黑曲霉DB056柚苷酶制剂对琯溪蜜柚果汁具有良好的脱苦作用。

不同温度、pH和无机离子对黑曲霉A66菌株产柚苷酶活力影响的初步研究

对黑曲霉产柚苷酶的最适温度和pH进行了研究，发现最适反应温度在60℃，最适反应pH在5．0左右。同时研究了不同的无机离子在不同浓度下对柚苷酶活性稳定性的影响，发现I^-，Zn^2＋能促进柚苷酶活性的提高，Cu^2＋在（0—0．004）mg／mL的范围内也能激活柚苷酶的活性。

产柚苷酶菌株B04的分离及产酶特性研究

柚苷酶作为金柚和柑桔果实中主要苦味物质的分解酶有望在深加工生产中得到应用。本研究在金柚树林下土壤和金柚皮腐烂液中分离得到产柚苷酶菌株。研究证明采用添加低浓度蔗糖作为碳源的高层试管法是可行的初筛方法;复筛得到菌株B04,产酶需要诱导,酶底物柚苷和产物鼠李糖均有诱导作用,其中柚苷诱导作用更好,而且添加量为0.02%时菌株产酶能力较强;B04发酵类型为非生长偶联型,30℃,175r/min旋转摇床培养,60h菌体量最大,96h酶活力最高,达到342U/mL。

NTG诱变筛选高产柚苷酶抗药性突变株

通过筛选柚苷酶产生菌3-54菌株孢子的敏感抗生素最低致死浓度,采用NTG对出发菌株孢子进行诱变处理,将诱变后的孢子涂在含纳他霉素致死浓度(2.0 U/mL)的平板筛选培养基上,获得了大量的抗药性致死突变株。再结合透明圈法,经过透明圈初筛和多次摇瓶复筛,从180个纳他霉素抗性基因突变株中筛选得到1株摇瓶发酵单位达770.06 U/mL的3-54-NTG-16号菌株,比出发菌株的产酶能力提高了近100%。

紫外线诱变青霉P-M1选育柚苷酶高产菌株研究

采用紫外线对野生型柚苷酶产生菌青霉P-M1进行诱变处理以提高柚苷酶的产量,经过初步筛选最佳诱变条件为:孢子悬液(107个/mL)稀释度为10-5,15 W紫外灯,垂直照射距离为30 cm,处理时间为5 min。通过透明圈初筛和摇瓶复筛选育出一株柚苷酶高产菌株青霉PU-15,酶活达到334.3 U/mL,比出发菌株提高了137.4%,将其连续传代10次测定遗传稳定性,结果显示稳定性良好,是一株比较理想的柚苷酶高产菌株。

黑曲霉TC-01产柚苷酶对柚皮苷酶解作用的研究

柚皮苷是一类主要的类黄酮物质,它是引起柚类和葡萄果实苦味的主要来源,去除柚皮苷会使果汁苦味减轻,而柚皮苷酶能在不影响柑橘果汁品质的前提下较好地去除苦味。但是由于不同来源的柚苷酶的结构不同,其催化特性也不尽相同,本文通过利用前期筛选的黑曲霉(Aspergillus.niger TC-01)产柚苷酶对柚皮苷酶解作用进行研究,实验采用高效液相色谱法测定柚皮苷、普鲁宁和柚皮素的三者之间含量变化,确定酶解最适温度、时间、pH及酶用量,并测定TC-01产柚苷酶的米氏常数以确定酶解反应的最佳条件。结果表明,TC-01产柚苷酶酶解最适温度为60℃、酶解最适时间为30-40min,最适pH4.0,酶最佳用量为24u/mL。米氏方程为Y=0.0018X-3.0×10-6,其中Km值为598.8ug/mL,Vmax=2.06g/(min.mL)。此研究结果为柚苷酶的应用提供了理论依据。

青霉菌柚苷酶的分离纯化及酶学性质

对来源于Penicillium sp.1523的柚苷酶分离纯化工艺进行了系统分析,依次采用超滤、硫酸铵盐析和Sephadex G-200凝胶过滤层析操作对柚苷酶进行逐级纯化,通过SDS-PAGE电泳对各步骤的纯化结果进行分析鉴定,并考察了温度、pH及不同金属离子对酶活性的影响。结果显示纯化后的柚苷酶比活力达到4478.76U/mg,纯化倍数为11.99倍,活力回收率为38.10%。纯化后的柚苷酶经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定显示两条清晰的条带,说明该酶由两个亚基组成,其分子量分别为89ku和72ku;同时酶学性质研究发现最适温度为50℃,热稳定性不理想,最适pH为4.0,Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、EDTA、Cu2+对该酶酶活有促进作用,而Fe2+、SDS在低浓度时便对柚苷酶酶活表现出抑制作用。本研究为青霉菌柚苷酶的大规模生物转化及分子改性提供了实验基础。

柚苷酶处理、果汁浓缩和低温贮藏对柚子果汁中柠檬苦素的影响

采用高效液相色谱法测定柠檬苦素含量,以柚子果汁为对象研究柚苷酶处理、果汁浓缩和低温贮藏等工序对柑橘果汁中柠檬苦素含量的影响。结果表明,液相色谱方法可使柠檬苦素、普鲁宁、柚皮苷和柚皮素完全分离,消除了柚皮素对柠檬苦素测定的影响;柠檬苦素检出限为0.95μg/m L,定量限为3.17μg/m L,样品回收率为102.6%~104.2%,相对标准偏差为0.34%~1.04%。柚苷酶水解过程中的加热及果汁浓缩和低温贮藏等操作都能促进柠檬苦素的从果汁中结晶析出,综合采用柚苷酶水解、浓缩和低温贮藏等操作,并经过离心分离可去除柚汁中78%的柠檬苦素,使果汁中柠檬苦素含量降低到19μg/m L。