柞蚕核型多角体病毒和家蚕核型多角体病毒的同义密码子使用模式分析

基因组中的基因和基因密码子组成不同使柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)与家蚕核型多角体病毒(BmNPV)间不能交叉感染。通过计算有效密码子数(ENc)、相对同义密码子使用度(RSCU)、GC含量、GC3s含量、密码子适应指数(CAI),比较分析ApNPV和BmNPV同义密码子使用模式差异。ApNPV和BmNPV的密码子偏好性均较弱,但二者的ENc值和GC含量差异显著;除碱基组成外,还存在其它因素影响密码子使用模式,但各影响因素的贡献率均较低,在基于密码子使用频率的对应分析中BmNPV的第1、第2向量轴贡献率均低于ApNPV;ApNPV的基因表达水平与GC含量、GC3s含量以及ENc值极显著相关(r分别为0.418、0.735、-0.628,P=0.000),而BmNPV的基因表达水平只与GC3s含量呈弱相关(r=0.214,P=0.010)。分析结果显示,ApNPV和BmNPV的密码子偏好性虽均较弱,但同义密码使用模式及其影响因素存在差异。

柞蚕核型多角体病毒侵染对柞蚕幼虫体内部分保护酶活性的影响

研究柞蚕幼虫被柞蚕核型多角体病毒(Ap NPV)侵染后,体内主要保护酶活性的变化,有利于了解Ap NPV对柞蚕的致病机制。测定柞蚕4龄幼虫被Ap NPV侵染后血淋巴中几种保护酶的活性,结果表明:柞蚕幼虫被Ap NPV侵染后,其血淋巴中的过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性逐渐升高,分别在接种后第4和第3天达到最大值0.11 U/(m L·min)、573.97 U/(m L·min),之后又逐渐下降;血淋巴中的过氧化氢酶(CAT)活性则表现出降低-升高-降低的变化趋势,在接种后第5天达到峰值378.44 U/(m L·min)。在柞蚕对Ap NPV侵染的免疫防御过程中,POD、SOD是首先作出应答反应的保护酶,CAT是在前二者之后起作用的保护酶,并且试验组柞蚕幼虫血淋巴中的POD活性始终高于发育同期的对照组幼虫,故推测POD是起主要作用的保护酶。

利用柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)表达载体系统在柞蚕蛹中表达人生长激素

为探究柞蚕核型多角体病毒（ApNPV）表达载体一柞蚕蛹表达系统用于表达哺乳动物活性蛋白的可行性，利用该表达系统表达医用蛋白人生长激素（hGH）。构建插入hgh基因的转移表达载体pApM748BE／hgh，将该转移表达载体质粒DNA与病毒ApNPV-△ph／Aefp／hgh’基因组DNA共转染樗蚕（Philosamiacynthiam）培养细胞Pc一01，用末端稀释法筛选获得重组病毒ApNPV-△ph／Aefp／hgh。采用Westernblotting和ELISA方法，检测到柞蚕蛹感染重组病毒ApNPV—△ph／-△ph／Aefp／hgh／hgh’后第7天体液中就有hGH明显表达；感染后第13～14天蛹体液中的hGH含量保持较高水平，重组hGH的最高表达量可达251．18肛g／mL；感染后第15～20天仍可以检测到hGH的表达，但表达产物出现降解现象。用活化的人红白血病细胞K562检测利用ApNPV表达载体系统在柞蚕蛹表达的重组hGH的体外活性，结果显示其对K562细胞的增殖具有明显的促进作用。

柞蚕核型多角体病毒基因组编码VmiRNA的预测与功能分析

柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)是危害柞蚕的主要病原物之一。病毒microRNAs(VmiRNA)是由病毒基因组编码的小RNA分子,在病毒繁殖及与宿主的相互作用中发挥作用。采用高通量测序Solexa技术测定ApNPV感染柞蚕后的VmiRNA,并通过vMir软件预测ApNPV基因组可能编码的VmiRNA前体序列。在预测得到的16条前体序列中,有13条能够从病毒感染的柞蚕蛹脂肪体中扩增出条带,并有10条能在病毒基因组中找到同源序列。在ApNPV MicroRNA Solexa测序数据库中搜索到与这10条前体VmiRNAs相匹配的序列,用RT-PCR方法证明有9条能扩增出大小相应的片段,确定其为病毒基因组编码的VmiRNA的成熟序列。利用靶基因在线预测程序RNAhybrid预测到这些VmiRNA作用的135个可能的靶基因,其中有与免疫应答过程相关的基因36个,与免疫系统进程相关的基因19个,与免疫调节相关的基因8个,与免疫系统发育相关的基因9个。推测这些ApNPV基因组编码的VmiRNA在病毒与宿主之间的相互作用中扮演重要角色。

柞蚕核型多角体病毒ie-2和pe-38基因的克隆与序列分析

采用随机克隆方法,通过对插入pGEM-3Z载体的柞蚕核型多角体病毒基因组的部分片段进行测序和序列分析,获得了柞蚕核型多角体病毒基因组的2个极早期基因ie-2和pe-38的序列及pe-38的5′启动子区,其推定的开放阅读框分别编码295和302个氨基酸,并且内部含有一个保守的锌指结构和亮氨酸拉链。核苷酸和氨基酸同源性比较结果显示:柞蚕核型多角体病毒的ie-2和pe-38基因与黄杉毒蛾多角体病毒的同源性较高,与家蚕核型多角体病毒的同源性都很低;在分子进化方面,这2个基因的保守性不强,出现大片段缺失,是研究分子进化及物种关系比较典型的基因。

柞蚕核型多角体病毒对Tn-Hi5细胞的感染性及抗细胞凋亡分析

细胞凋亡是昆虫宿主细胞抗病毒感染及控制病毒复制增殖的一个复杂的分子生物学机制。前期研究发现柞蚕核型多角体病毒(Ap NPV)的重组病毒Ap NPV-Δph/egfp+能够感染非特异性宿主细胞Tn-Hi5,并表达EGFP蛋白。利用实时荧光定量PCR方法进一步检测分析Ap NPV-Δph/egfp+在Tn-Hi5细胞中的复制增殖特点以及子代病毒的感染性;通过检测细胞凋亡信号通路中类caspase-3蛋白酶活性,分析Ap NPV-Δph/egfp+感染Tn-Hi5细胞后对抗细胞凋亡的作用途径。结果显示,随着病毒感染时间的延长,Ap NPV-Δph/egfp+在Tn-Hi5细胞中的DNA拷贝数增加,被感染的Tn-Hi5细胞能够产生子代病毒,但病毒DNA拷贝数逐代减少;Ap NPV-Δph/egfp+感染Tn-Hi5细胞后可抑制放线菌素D诱导的细胞类caspase-3蛋白酶活性。研究结果证实Ap NPV能够在Tn-Hi5细胞中复制增殖,并具有抑制由放线菌素D诱导的细胞凋亡的作用。

柞蚕核型多角体病毒sod基因核心序列的克隆与分析

根据多种鳞翅目昆虫NPVsod基因的保守区序列设计引物,克隆了柞蚕NPV的sod基因中300个核苷酸的核心区序列。通过同源性比较发现,柞蚕NPV的sod基因与云杉卷叶蛾(Choristioneurefumiferana)和黄杉毒蛾(Orgyiapseudotsugata)NPV的sod基因的同源性较高,分别为80 1%和76 6%,而与家蚕NPV和苜蓿尺蠖NPV的同源性相对较远。

柞蚕核型多角体病毒载体表达系统基因工程研究进展

柞蚕是一种野外饲养的经济昆虫，它以蛹滞育越冬，主要分布在我国东北部山区。我国柞蚕年产茧量６万ｔ左右，占世界柞蚕茧产量的９０％以上。柞蚕核型多角体病毒（ＡｐＮＰＶ）属杆状病毒科Ａ亚组，是柞蚕脓病的病原体，对柞蚕蛹十分敏感。建立柞蚕核型多角体病毒载体表达系统，以柞蚕蛹为宿主昆虫进行外源基因的大量表达生产，具有成本低、安全、易管理，可工业化生产等特点。本文概述柞蚕核型多角体病毒载体基因工程研究的进展，其中包括核型多角体蛋白基因的克隆，核苷酸序列分析，ｍＲＮＡ起始点的确定，转移载体的组建及所载外源基因在昆虫细胞和柞蚕体内的表达等。

柞蚕核型多角体病毒odv-e56基因的克隆与分析

为获得柞蚕核型多角体病毒(Antheraea pernyinucleopolyhedrovirus,ApNPV)基因组序列,采用随机克隆方法,建立ApNPV的质粒基因文库,并通过对插入片段进行克隆鉴定和序列分析,获得了编码包涵体衍生型病毒特异囊膜蛋白基因odv-e56。该基因上游具有晚期调控保守序列TTAAG,是一个晚期表达基因,阅读框为1125bp,共编码374个氨基酸。核苷酸和氨基酸同源性比较结果表明:ApNPV的odv-e56基因与黄杉毒蛾多角体病毒(OpNPV)和云杉卷叶蛾核型多角体病毒(CfNPV)的同源性较高,而与松树小叶蜂核型多角体病毒(NlNPV)和松环螺旋多角体病毒(NsNPV)的同源性最低。由此认为,杆状病毒科的odv-e56基因在进化上存在两种进化方式:一类以点突变为主,基因长度变化不明显;另一类突变以小片段的碱基增减为特征。

利用柞蚕核型多角体病毒表达系统表达谷氨酰胺果糖-6-磷酸酰胺转移酶

谷氨酰胺果糖-6-磷酸酰胺转移酶(glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase,GFAT)是己糖胺生物合成途径(HBP)中的限速酶,与蛋白质糖基化修饰密切相关。本研究克隆的柞蚕GFAT基因(ApGFAT)CDS由2 022个碱基构成,编码674个氨基酸。将该基因连接到柞蚕杆状病毒转移载体pApM748BE后与ApNPV-Δph/egfp+共转染Tn-High Five细胞获得重组病毒。将重组病毒注射到柞蚕蛹体内,收集发病蛹血淋巴,用镍离子螯合柱纯化得到纯化蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测表明,ApGFAT蛋白在柞蚕蛹体内得到成功表达,酶活力为0.978μmol/(min·mg)。

蓖麻蚕核型多角体病毒和柞蚕核型多角体病毒的密码子使用模式分析

蓖麻蚕核型多角体病毒(Phcy NPV)是柞蚕核型多角体病毒(Anpe NPV)的变种,不能感染柞蚕。通过病毒基因组GC含量、GC3s含量、有效密码子数、相对同义密码子使用度、密码子偏好参数的计算及ENc-plot分析、中性绘图分析、对应分析等,比较Phcy NPV和Anpe NPV的密码子使用模式。Phcy NPV、Anpe NPV分别只有1个和4个ORF的密码子偏好性较强。与Anpe NPV比较,Phcy NPV少数ORF的GC含量、GC3s含量、有效密码子数量和密码子偏好参数变化较大,但2种病毒ORF组间的GC含量、GC3s含量、有效密码子数和密码子偏好参数均无统计学差异(P=0.135、P=0.189、P=0.192、P=0.200)。2种病毒ORF组间,由同义密码子编码的18种氨基酸的密码子使用均无统计学差异(P>0.05),鉴定的17种偏好性密码子也均相同。GC碱基组成是影响2种病毒ORF组密码子使用模式的主要因素,而自然选择对GC碱基组成的影响大于突变压力,但2种病毒间自然选择的影响程度无统计学差异(P=0.770)。Phcy NPV在适应新宿主蓖麻蚕的进化过程中密码子使用模式变化较小,尚不能通过密码子使用模式分析解释杆状病毒在不同宿主间的交叉感染机制。

柞蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子的克隆与分析

以柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)DNA为模板,运用PCR技术钓取ApNPV(IE-1)基因的启动子片段,并将其克隆到pMD18-T载体上进行测序分析。将测序的2.7 kb DNA片段用EcoRⅠ和BglⅡ双酶切,回收3'端1.6 kb的DNA片段。将该片段插入到pGFP-N2表达载体上构建以其作为启动子的IE-1/pGFP-N2重组质粒。重组质粒经脂质体介导转染Hela细胞,结果可见绿色荧光蛋白(GFP)在细胞中的表达,证明钓取的IE-1基因启动子片段具有启动子的转录活性。

柞蚕核型多角体病毒PCR检测方法的建立

为了建立柞蚕核型多角体病毒(Antheraea pernyi nucleopolyhedrovirus,ApNPV)的早期检测技术,采用NCBI提供的BLAST软件在线检索ApNPV特异基因ORF142的序列后设计引物AP1,对ApNPV基因组DNA进行PCR扩增,得到约130 bp的片段,最低检测量为0.5 fg/mL病毒DNA。分别以感染ApNPV的柞蚕幼虫总DNA和ApNPV多角体悬液为模板,相同扩增条件下可扩增出大小一致的一条特异性片段,最低检测量分别为1 fg/mL幼虫总DNA和20～25 PIBs/mL ApNPV多角体。以柞蚕4龄幼虫为材料,人工模拟感染ApNPV后取幼虫血淋巴为检测物可以直接检出ApNPV,当添毒量为2.3×108PIBs/mL时,添毒36 h后即可检出,且病毒感染后的检出时间与添毒浓度呈正相关。采用该方法的检测过程只需3 h,快速而方便。

柞蚕核型多角体病毒结构多肽的分析

本文应用电子显微镜、离心分离沉淀和不连续的垂直板 SDS-PAGE等生物化学的分析方法和技术,对柞蚕核型多角体病毒(Antheraea pemyi NuclearPolyhedrosis Virus 简称 APNPV)的多角体蛋白、病毒粒子的结构多肽进行了分析。结果表明,纯化的多角体形态完整,病毒粒子具有典型的昆虫杆状病毒紫外吸收特征;经 EDTA 和热处理的多角体蛋白仅有一条主带,其分子量为29,500±500d;多角体蛋白的氨基酸组成中富含 Asp 和 Glu,而 His 的含量较低(Cys 和 Met未精确测定);病毒粒子至少有23种结构多肽,其分子量范围在17,000～77,900d之间,其中有5条主要的结构多肽。

柞蚕核型多角体病毒基因组编码VmiRNA的预测与功能分析

柞蚕核型多角体病毒（ApNPV）是危害柞蚕的主要病原物之一。病毒microRNAs（VmiRNA）是由病毒基因组编码的小RNA分子，在病毒繁殖及与宿主的相互作用中发挥作用。采用高通量测序Solexa技术测定ApNPV感染柞蚕后的VmiRNA，并通过vMir软件预测ApNPV基因组可能编码的VmiRNA前体序列。在预测得到的16条前体序列中，有13条能够从病毒感染的柞蚕蛹脂肪体中扩增出条带，并有10条能在病毒基因组中找到同源序列。在ApNPV MicroRNA Solexa测序数据库中搜索到与这10条前体VmiRNAs相匹配的序列，用RT-PCR方法证明有9条能扩增出大小相应的片段，确定其为病毒基因组编码的VmiRNA的成熟序列。利用靶基因在线预测程序RNAhybrid预测到这些VmiRNA作用的135个可能的靶基因，其中有与免疫应答过程相关的基因36个，与免疫系统进程相关的基因19个，与免疫调节相关的基因8个，与免疫系统发育相关的基因9个。推测这些ApNPV基因组编码的VmiRNA在病毒与宿主之间的相互作用中扮演重要角色。

柞蚕核型多角体病毒实时荧光LAMP检测方法的初步建立

柞蚕脓病是柞蚕生产上的主要病害之一,病原为柞蚕核型多角体病毒(Ap NPV)。建立快速而准确检测蚕体样品中Ap NPV的技术,将有助于对病害的早期诊断及流行病学调查和实施有效的防控措施。以柞蚕核型多角体病毒ORF142基因为靶基因,设计2组特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,利用实时荧光PCR技术进行检测分析。结果表明,设计与合成的2组引物均能对柞蚕核型多角体病毒基因组扩增出特异性产物,其中引物组2在63℃开始孵育60 min,反应起始扩增时间为12 min,当反应时间达到40 min时,扩增曲线的最大相对荧光强度(RFU)值达6 000,相对于引物组1具有更好的及时性,可缩短一半反应起始时间。初步建立的Ap NPV实时荧光LAMP检测方法相对于传统PCR方法,检测效率提高4倍左右。

柞蚕核型多角体病毒内源性非编码小RNA成熟体MD5作用的宿主靶基因及功能预测

研究病毒内源性非编码小RNA(VmiRNA)的靶标基因,有助于阐释病毒和宿主的互作关系及制定对病毒的防控策略。利用Solexa高通量测序技术及生物信息学方法,从柞蚕核型多角体病毒(Ap NPV)基因组中筛选出VmiRNA成熟体MD5,在预测其作用的宿主靶基因基础上,通过GO数据库分析靶基因的功能。结果显示由Ap NPV的VmiRNA MD5调控的宿主靶基因涉及细胞组成、分子功能、生物学过程等生物学途径,主要参与细胞内的分子结合、酶催化和免疫反应,其中与柞蚕免疫相关的靶基因共有4个。实时荧光定量PCR检测柞蚕蛹经Ap NPV诱导处理后VmiRNA MD5在脂肪体内明显上调表达(与对照相比提高了8倍),而与宿主免疫相关的3个靶基因的表达水平明显下调。对VmiRNA MD5 5'端上游启动子序列结构的分析显示,其含有免疫相关转录因子GMCSF、p53等的结合位点。推测VmiRNA MD5可能参与调控宿主柞蚕免疫相关基因的表达。

柞蚕核型多角体病毒IAP2亚细胞定位分析及其基因缺失对病毒复制的影响

柞蚕核型多角体病毒(AnpeNPV) IAP2属杆状病毒IAP-2类型蛋白,在病毒复制中的作用尚不清楚。本研究用RLM-RACE法分析Anpe-iap2基因的转录起始位点和终止位点,结果显示其转录起始位点位于ATG上游-4 nt,处于晚期基因启动子基序TAAG中;基因转录终止于TGA下游219 nt处,推算Anpe-iap2基因cDNA序列全长为952 bp。基因表达分析证实Anpe-iap2为病毒晚期表达基因。利用同源重组方法构建了Anpe-IAP2和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达的AnpeNPV重组病毒,共聚焦显微镜确定Anpe-IAP2在细胞质和细胞核中均有分布,以细胞核分布较多。利用λ-Red重组技术构建Anpe-iap2基因缺失型重组AnpeNPV,定量PCR检测结果表明缺失Anpe-iap2基因的重组AnpeNPV在Tn-Hi5细胞中的复制能力明显受到抑制,在柞蚕蛹中产生出芽型病毒粒子(BV)的数量显著减少。研究结果显示Anpe-iap2基因对AnpeNPV的复制和感染有重要作用,为深入了解AnpeNPV基因的功能和特性提供了新的依据。