橘核柠檬苦素葡萄糖基转移酶基因(lgt)的克隆与表达分析

目的:从橘核主要来源品种大红袍Citrus reticulata‘Dahongpao’的总RNA中克隆获得柠檬苦素葡萄糖基转移酶基因(lgt),并对其进行生物信息学相关表达分析。方法:提取橘核总RNA,克隆获得了lgt基因序列,通过生物信息学对其蛋白的特征进行分析,构建lgt与其相关物种lgt的系统进化树,利用RT-PCR分析橘核不同时期的lgt基因表达量,并进行分析。结果:克隆获得lgt基因的总长度为1 372 bp,编码457个氨基酸,利用生物信息学分析其属于糖基转移酶超家族的亲水性蛋白,有较多的α-螺旋和自由卷曲,存在于真核生物细胞质,通过RT-PCR分析种子在脱水干燥时期表达量最低,其次为形态建成时期,成熟时期表达量最高。结论:首次从大红袍中成功克隆lgt基因,为橘核中柠檬苦素类物质合成及调控机制奠定了基础。

台湾文旦柚和蜜柚之柠檬苦素葡萄糖转移酶研究

柑橘类果汁在加工过程,在风味上受柠檬苦素影响甚巨,本研究针对台湾柚类柠檬苦素葡萄糖转移酶基因(limonin glucosyltransferase gene, lgt),选殖出一1600 bp片段,并对其作用活性位置预测出一段转录的44胺基酸序列,得到一个完整的开放框架(open reading frame),此段功能性基因有助于未来进行构筑与选殖,应用于柑橘类果汁在风味改进的研究。本研究亦探讨台湾的文旦柚和蜜柚lgt在开花至成熟时期的表现情况。结果得知,蜜柚中仅有第二型存在,且果实中含有大量lgt表现,而文旦同时具有两型lgt存在,但表现量相较于蜜柚低,此结果可应证前人之结论,即文旦柚于果实成长后期采收,因 lgt表现量不足,而导致其果实中仍含有大量苦味化合物仍有存在,导至于加工过程中苦味化合物的生成。本研究利用內果皮以快速蛋白纯化系统(FPLC) HiTrap Q管柱进行纯化,得分子量大约40 kDa之LGTase,并以2,2'-二辛可宁酸(bicinchoninic acid)定量蛋白质为0.6,1 mg/ml,此方法有助提高柚类加工过程中果皮废弃物的利用性。

柠檬苦素类似物糖基转移酶基因(citLGT)在转基因锦橙中的异位表达分析

【目的】分析柠檬苦素类似物糖基转移酶基因(citLGT)在柑橘中的异位表达。【方法】构建了CaMV 35S启动子控制下citLGT的超量和RNAi抑制表达载体。采用农杆菌介导的遗传转化方法将上述植物表达载体分别转化‘锦橙’[Citrus sinensis(Linn.)Osbeck‘Jincheng’]上胚轴。经GUS组织化学染色及PCR检测共获得20株转基因阳性植株。利用qRT-PCR分析转基因植株中citLGT基因的表达。【结果】超量表达citLGT的转基因植株中citLGT的表达量显著高于对照,而RNAi转基因植株中citLGT的表达量则被显著抑制。【结论】本实验为阐明了citLGT基因影响后苦味性状的分子机制和基因工程改良柑橘延迟苦味性状提供了有价值的材料。

β-葡萄糖苷酶对胡柚汁脱苦效果的研究

胡柚汁营养丰富,但也有柠檬苦素、柚皮苷等苦味物质。由于这些苦味物质的存在,限制了胡柚的深加工和消费者的需求。本实验利用β-葡萄糖苷酶对胡柚果汁进行了脱苦研究。结果表明,在50℃下pH5的胡柚汁中添加200U/Lβ-葡萄糖苷酶作用60min,对胡柚果汁脱苦效果良好,而对VC等营养成分的损失不明显。

橘核柠檬苦素类化合物积累与功能基因表达的灰色关联度分析

目的研究橘核传统药用品种大红袍Citrus reticulata‘Dahongpao’中柠檬苦素类化合物生物合成机制与转运规律。方法利用UPLC法测定橘种子生长发育过程中茎、叶、果皮及种子中的柠檬苦素、诺米林、黄柏酮等柠檬苦素类化合物的量,采用灰色关联度分析方法,与克隆获得的角鲨烯合成酶基因(ss)、角鲨烯环氧酶基因(se)、葡萄糖基转移酶基因(lgt)表达量进行关联度分析。结果不同器官中柠檬苦素类化合物在种子中得到最大积累;不同器官中柠檬苦素类化合物的积累与ss、se、lgt基因表达均有较大的关联,但在种子中柠檬苦素的积累与ss、se、lgt基因表达最密切,其中ss基因表达对柠檬苦素、诺米林、黄柏酮的积累贡献最大。结论本实验为柠檬苦素类化合物合成机制与转运规律提供可靠、科学的依据。

椪柑柠檬苦素-UDP-葡萄糖基转移酶基因的克隆、分析及表达

目的克隆中药橘核主要来源品种椪柑Citrus reticulata的柠檬苦素-UDP-葡萄糖基转移酶(limonoid-UDP-glucosyl transferase gene,LGT)基因,并进行生物信息学及表达分析为橘核有效成分合成及调控机制研究提供基础。方法克隆获得LGT序列,通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析,构建LGT与相关物种LGT的系统进化树,利用RT-PCR分析橘皮、橘肉以及橘核中LGT基因表达量,并进行分析和比较。结果测序所得椪柑LGT序列全长为1 530 bp,具有1 509 bp的完整开放阅读框,编码502个氨基酸。并对其蛋白二级、三级结构进行了分析和预测。基因表达分析结果发现椪柑LGT基因在橘核中表达量最低,其次为橘皮,表达量最高为橘肉。结论成功克隆、分析并表达了椪柑LGT基因,为橘核中柠檬苦素类物质合成及调控机制研究提供基础。

柚苦味形成相关基因CmLGT的克隆与分析

为研究柚苦味形成的分子机理,以梁平柚为材料,采用PCR和RT-PCR技术扩增获得了柠檬苦素类化合物葡萄糖转移酶(LGT)基因CmLGT的DNA序列和cDNA序列。cDNA长1536bp,推测的编码蛋白CmLGT包含511个氨基酸,理论分子量为57.5ku,具有1个含有44个氨基酸残基的UDP-葡萄糖结合域(UDP-glucose Binding Domain),2个含有4个氨基酸残基的保守糖基化位点。扩增得到的CmLGT基因DNA和cDNA存在26个碱基的差异,可能是DNA和cDNA分别进行扩增时,其模板为同一位点上的等位基因造成的。