橘核柠檬苦素葡萄糖基转移酶基因(lgt)的克隆与表达分析

目的:从橘核主要来源品种大红袍Citrus reticulata‘Dahongpao’的总RNA中克隆获得柠檬苦素葡萄糖基转移酶基因(lgt),并对其进行生物信息学相关表达分析。方法:提取橘核总RNA,克隆获得了lgt基因序列,通过生物信息学对其蛋白的特征进行分析,构建lgt与其相关物种lgt的系统进化树,利用RT-PCR分析橘核不同时期的lgt基因表达量,并进行分析。结果:克隆获得lgt基因的总长度为1 372 bp,编码457个氨基酸,利用生物信息学分析其属于糖基转移酶超家族的亲水性蛋白,有较多的α-螺旋和自由卷曲,存在于真核生物细胞质,通过RT-PCR分析种子在脱水干燥时期表达量最低,其次为形态建成时期,成熟时期表达量最高。结论:首次从大红袍中成功克隆lgt基因,为橘核中柠檬苦素类物质合成及调控机制奠定了基础。

柠檬苦素类似物糖基转移酶基因(citLGT)在转基因锦橙中的异位表达分析

【目的】分析柠檬苦素类似物糖基转移酶基因(citLGT)在柑橘中的异位表达。【方法】构建了CaMV 35S启动子控制下citLGT的超量和RNAi抑制表达载体。采用农杆菌介导的遗传转化方法将上述植物表达载体分别转化‘锦橙’[Citrus sinensis(Linn.)Osbeck‘Jincheng’]上胚轴。经GUS组织化学染色及PCR检测共获得20株转基因阳性植株。利用qRT-PCR分析转基因植株中citLGT基因的表达。【结果】超量表达citLGT的转基因植株中citLGT的表达量显著高于对照,而RNAi转基因植株中citLGT的表达量则被显著抑制。【结论】本实验为阐明了citLGT基因影响后苦味性状的分子机制和基因工程改良柑橘延迟苦味性状提供了有价值的材料。

台湾文旦柚和蜜柚之柠檬苦素葡萄糖转移酶研究

柑橘类果汁在加工过程,在风味上受柠檬苦素影响甚巨,本研究针对台湾柚类柠檬苦素葡萄糖转移酶基因(limonin glucosyltransferase gene, lgt),选殖出一1600 bp片段,并对其作用活性位置预测出一段转录的44胺基酸序列,得到一个完整的开放框架(open reading frame),此段功能性基因有助于未来进行构筑与选殖,应用于柑橘类果汁在风味改进的研究。本研究亦探讨台湾的文旦柚和蜜柚lgt在开花至成熟时期的表现情况。结果得知,蜜柚中仅有第二型存在,且果实中含有大量lgt表现,而文旦同时具有两型lgt存在,但表现量相较于蜜柚低,此结果可应证前人之结论,即文旦柚于果实成长后期采收,因 lgt表现量不足,而导致其果实中仍含有大量苦味化合物仍有存在,导至于加工过程中苦味化合物的生成。本研究利用內果皮以快速蛋白纯化系统(FPLC) HiTrap Q管柱进行纯化,得分子量大约40 kDa之LGTase,并以2,2'-二辛可宁酸(bicinchoninic acid)定量蛋白质为0.6,1 mg/ml,此方法有助提高柚类加工过程中果皮废弃物的利用性。

柠檬苦素抑制乳腺癌细胞转移相关基因芯片分析

目的通过基因芯片技术检测不同浓度柠檬苦素抑制乳腺癌细胞转移过程中表达差异的基因,寻找柠檬苦素抑制乳腺癌细胞转移可能的相关基因及通路。方法选取乳腺癌MDA-MB-231细胞株,分别用两种不同浓度柠檬苦素(0、40和60μM)进行处理,将收集的细胞分为对照组C(未经柠檬苦素处理C1、C2、C3)及实验组T(经40μM柠檬苦素处理T1-T3,经60μM柠檬苦素处理T4-T6)并进行RNA的提纯;将RNA通过Affymetrix Gen-eChip PrimeView人类基因表达阵列进行分析,利用R语言limma包筛选出未经柠檬苦素处理和不同浓度柠檬苦素处理的MDA-MB-231中异常表达的基因;进而结合GO分析和KEGG分析,对差异基因的功能进行研究。结果根据基因芯片的数据进行分析,发现差异表达基因(DEGs)共438个,其中81个基因的表达上调,63个基因的表达下调(差异均在2倍以上)。通过基因库、Pubmed文献搜索各基因功能并结合GO分析、KEGG通路分析,从差异基因中筛选出柠檬苦素抑制乳腺癌转移相关的4个基因,分别是:人类1型胰岛素样生长因子受体(the human type 1 insulin-like growth factor receptor,IGF-1R)、胰岛素样生长因2(insulin-like growth factor-2,IGF2)、环磷酸腺苷反应元件结合蛋白1(cyclic AMP response element-binding protein 1,CREB1)和真核细胞翻译起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E,EIF4E)。结论基因芯片技术能快速有效地反映柠檬苦素抑制乳腺癌中相关基因改变,为乳腺癌靶向治疗提供参考。

柠檬苦素对牛前体脂肪细胞分化过程中核纤层蛋白基因表达的影响

核纤层位于核膜内侧,主要由核纤层蛋白构成,对细胞核起重要的机械支持作用。编码核纤层蛋白的基因突变能导致人类肌肉、脂肪等组织病变,统称为核纤层病。为了研究柠檬苦素对牛前体脂肪细胞分化过程中核纤层蛋白基因表达的影响,试验利用qRT-PCR技术分析了编码核纤层蛋白的LMNA、LMNB1和LMNB2基因在牛前体脂肪细胞诱导分化过程中的表达变化,同时在细胞培养基中添加柠檬苦素,以分析柠檬苦素对细胞分化和核纤层蛋白编码基因表达的影响。结果表明:在培养基中添加柠檬苦素能够有效抑制牛前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化,试验组细胞中脂质沉积量极显著低于对照组(P<0.01)。LMNA基因在牛前体脂肪细胞中具有较高的表达水平,添加柠檬苦素的试验组LMNA基因表达水平有降低的趋势。试验组LMNB1和LMNB2基因表达量在诱导分化的第0.5天极显著低于对照组(P<0.01),在诱导分化的10~12 d试验组LMNB1基因表达量显著高于对照组(P<0.05)。LMNA、LMNB1和LMNB2基因在牛前体脂肪细胞诱导分化过程中具有相似的表达变化趋势,均在诱导分化开始的0.5~1 d表达量升高。说明柠檬苦素在牛前体脂肪细胞早期分化时具有抑制核纤层蛋白基因表达的作用,而在分化后期则能够促进核纤层蛋白基因表达。

CclSAUR49基因的表达特征及对类柠檬苦素生物合成的影响

【目的】探究CclSAUR49基因对柑橘类柠檬苦素生物合成的影响。【方法】通过高效液相色谱(HPLC)检测叶片中的诺米林和柠檬苦素含量;利用实时荧光定量PCR分析基因的表达量。分别从柚和湖北早实枳中克隆CclSAUR49基因编码序列(coding sequence,CDS)及启动子,利用瞬时转化烟草对CclSAUR49蛋白进行表达定位;通过遗传转化湖北早实枳分析该基因的组织表达特性及其对类柠檬苦素生物合成的影响。【结果】类柠檬苦素含量和CclSAUR49表达水平在2个沙田柚品种间以及叶片的生长发育中均呈显著负相关。CclSUAR49蛋白定位于质膜和细胞核。从湖北早实枳中克隆得到的CclSAUR49基因的启动子序列中不含吲哚乙酸(IAA)响应元件。启动子活性分析发现,Ccl-SAUR49基因主要在茎、根和老叶中表达,在嫩叶中没有表达。超量表达CclSAUR49导致类柠檬苦素含量显著降低,植株的叶片和节间显著伸长,茎增粗。【结论】柑橘CclSAUR49基因的表达有明显的组织特异性,对类柠檬苦素的合成或积累有抑制作用。

柠檬苦素调控Tiam1基因表达影响人体血管瘤内皮细胞VEGF/VEGFR2通路及诱导其凋亡的机制研究

目的:研究柠檬苦素Toonaciliatin A对血管瘤内皮细胞(HemEC)增殖、凋亡的影响及潜在作用机制。方法:胶原蛋白酶A分离HemEC细胞,MTT法测定不同浓度Toonaciliatin A对HemEC细胞生存率的影响,流式细胞术测定HemEC细胞凋亡率,Western blot检测蛋白表达,qRT-PCR检测RNA的表达。结果:Toonaciliatin A能够抑制HemEC增殖,促进HemEC细胞凋亡;Toonaciliatin A抑制Tiam1蛋白表达,过表达Tiam1逆转了Toonaciliatin A对HemEC的抑制作用;Toonaciliatin A能够抑制VEGF和VEGFR2蛋白表达,过表达Tiam1逆转了Toonaciliatin A对VEGF和VEGFR2蛋白表达的抑制作用。结论:柠檬苦素类似物Toonaciliatin A通过靶向Tiam1基因抑制VEGF/VEGFR2通路抑制HemEC细胞增殖,促进细胞凋亡。

β-葡萄糖苷酶对胡柚汁脱苦效果的研究

胡柚汁营养丰富,但也有柠檬苦素、柚皮苷等苦味物质。由于这些苦味物质的存在,限制了胡柚的深加工和消费者的需求。本实验利用β-葡萄糖苷酶对胡柚果汁进行了脱苦研究。结果表明,在50℃下pH5的胡柚汁中添加200U/Lβ-葡萄糖苷酶作用60min,对胡柚果汁脱苦效果良好,而对VC等营养成分的损失不明显。

椪柑柠檬苦素-UDP-葡萄糖基转移酶基因的克隆、分析及表达

目的克隆中药橘核主要来源品种椪柑Citrus reticulata的柠檬苦素-UDP-葡萄糖基转移酶(limonoid-UDP-glucosyl transferase gene,LGT)基因,并进行生物信息学及表达分析为橘核有效成分合成及调控机制研究提供基础。方法克隆获得LGT序列,通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析,构建LGT与相关物种LGT的系统进化树,利用RT-PCR分析橘皮、橘肉以及橘核中LGT基因表达量,并进行分析和比较。结果测序所得椪柑LGT序列全长为1 530 bp,具有1 509 bp的完整开放阅读框,编码502个氨基酸。并对其蛋白二级、三级结构进行了分析和预测。基因表达分析结果发现椪柑LGT基因在橘核中表达量最低,其次为橘皮,表达量最高为橘肉。结论成功克隆、分析并表达了椪柑LGT基因,为橘核中柠檬苦素类物质合成及调控机制研究提供基础。

柚苦味形成相关基因CmLGT的克隆与分析

为研究柚苦味形成的分子机理,以梁平柚为材料,采用PCR和RT-PCR技术扩增获得了柠檬苦素类化合物葡萄糖转移酶(LGT)基因CmLGT的DNA序列和cDNA序列。cDNA长1536bp,推测的编码蛋白CmLGT包含511个氨基酸,理论分子量为57.5ku,具有1个含有44个氨基酸残基的UDP-葡萄糖结合域(UDP-glucose Binding Domain),2个含有4个氨基酸残基的保守糖基化位点。扩增得到的CmLGT基因DNA和cDNA存在26个碱基的差异,可能是DNA和cDNA分别进行扩增时,其模板为同一位点上的等位基因造成的。

橘核柠檬苦素类化合物积累与功能基因表达的灰色关联度分析

目的研究橘核传统药用品种大红袍Citrus reticulata‘Dahongpao’中柠檬苦素类化合物生物合成机制与转运规律。方法利用UPLC法测定橘种子生长发育过程中茎、叶、果皮及种子中的柠檬苦素、诺米林、黄柏酮等柠檬苦素类化合物的量,采用灰色关联度分析方法,与克隆获得的角鲨烯合成酶基因(ss)、角鲨烯环氧酶基因(se)、葡萄糖基转移酶基因(lgt)表达量进行关联度分析。结果不同器官中柠檬苦素类化合物在种子中得到最大积累;不同器官中柠檬苦素类化合物的积累与ss、se、lgt基因表达均有较大的关联,但在种子中柠檬苦素的积累与ss、se、lgt基因表达最密切,其中ss基因表达对柠檬苦素、诺米林、黄柏酮的积累贡献最大。结论本实验为柠檬苦素类化合物合成机制与转运规律提供可靠、科学的依据。

一种L-选择素配体合成酶在子宫内膜异位症种植窗期内膜中的表达

目的检测N乙酰氨基葡萄糖6磺基转移酶(Nacetylglucosamine6Osulfotransferase),一种合成L选择素配体的关键酶,在生育年龄的子宫内膜异位症患者及非子宫内膜异位症妇女种植窗期子宫内膜中的表达。方法采用RTPCR技术检测8例子宫内膜异位症患者和20例非子宫内膜异位症妇女种植窗期子宫内膜中N乙酰氨基葡萄糖6磺基转移酶的表达。结果种植窗期子宫内膜有该酶的表达;子宫内膜异位症组表达的灰度值为0.124±0.069,明显少于对照组0.511±0.25(P<0.05)。结论子宫内膜异位症患者在位子宫内膜种植窗期N乙酰氨基葡萄糖6磺基转移酶的基因表达呈降调状态,这种异常表达可能与子宫内膜异位症患者胚胎的种植率低下以及异位病灶的发病机制有关,成为导致不孕的病理环节之一。

基于UPLC定量指纹图谱与UPLC-QE-Plus-MS/MS技术的吴茱萸(石虎)标准汤剂量值传递研究

目的借助UPLC定量指纹图谱与UPLC-QE-Plus-MS/MS技术,研究吴茱萸Euodiae Fructus[石虎Euodia rutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalis(Dode)Huang]标准汤剂的量值传递规律。方法通过对18批吴茱萸(石虎)样品进行检测,获得吴茱萸(石虎)饮片和标准汤剂的对照指纹图谱,并采用UPLC-QE-Plus-MS/MS技术,对标定的吴茱萸(石虎)共有峰进行鉴定。通过峰个数传递、相似度比较、有效成分含量转移率、出膏率测定等,对吴茱萸(石虎)标准汤剂的量值传递规律进行研究。结果在饮片与标准汤剂中共标定25个对照指纹图谱共有峰,包括5个生物碱类化合物(去氢吴茱萸碱、evodiaxinine、吴茱萸酰胺、吴茱萸碱、吴茱萸次碱)、12个有机酸类化合物(咖啡酰葡萄糖酸及其同分异构体、阿魏酰葡萄糖酸及其同分异构体、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、阿魏酰奎宁酸等)、7个黄酮类化合物(香树素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芦丁、金丝桃苷、柠檬黄素-3-O-芸香糖苷、柯伊利素-7-O-芸香糖苷、水仙苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷)、1个柠檬苦素类化合物(柠檬苦素)。经测定饮片中25个共有峰均传递到标准汤剂中,共有峰传递率为100%。以每批次吴茱萸(石虎)饮片的指纹图谱为对照,对应批次标准汤剂的指纹图谱相似度均大于0.9。以有效成分柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱为指标,吴茱萸(石虎)标准汤剂中指标成分的转移率均在其均值±30%范围内。18批标准汤剂的出膏率也在其均值±30%范围内。结论制备过程量值传递情况稳定,制备工艺可行,可为吴茱萸(石虎)配方颗粒的质量标准研究提供依据。

在体吸收谱效相关研究吴茱萸汤治疗偏头痛活性成分

目的阐明治疗偏头痛的传统方剂吴茱萸汤(Wuzhuyu Decoction)的有效成分和作用机制。方法利用单向在体肠灌流方法获得10种WZYD在体吸收成分谱,同时建立利血平致偏头痛小鼠模型,检测血清与脑组织中一氧化氮及其合成酶水平及脑组织内5-羟色胺、去甲肾上腺素、多巴胺的含量,将吸收谱与药效指标进行谱效相关分析,确定影响药效的主要成分。结合网络药理学方法对吴茱萸汤治疗偏头痛的有效活性成分和潜在作用靶点进行分析,获得潜在治疗靶点以及生物学过程等,并对网络中的关键靶点和成分进行分子对接。结果吴茱萸汤中9种在体吸收成分对药效指标具有不同的作用,综合药效趋势中,吸收含量越高作用越好的前3位成分为吴茱萸苦素(rutaevine,Rv)、柠檬黄素-3-O-β-D-葡萄糖苷(limocitrin-3-O-β-D-glucoside,Lcs)、吴茱萸次碱(rutaecarpine,Ru),吸收含量越低作用越好的前3位成分为6-姜辣素(6-gingerol,6-Gi)、吴茱萸碱(evodiamine,Ev)、人参皂苷Rg_(1)(ginsenoside Rg_(1),Rg_(1))。网络药理学分析,吴茱萸汤作用于前列腺素内过氧化物合成酶2、5-羟色胺转运体、瞬时受体电位香草酸亚型1等受体蛋白,涉及118个生物学过程、21个细胞组分、21个分子功能和24条信号通路。结论吴茱萸汤中活性成分的吸收量与药效存在相关关系,可能是通过抑制神经源性炎症、影响5-羟色胺能信号通路的传导发挥治疗作用。