橘核柠檬苦素葡萄糖基转移酶基因(lgt)的克隆与表达分析

目的:从橘核主要来源品种大红袍Citrus reticulata‘Dahongpao’的总RNA中克隆获得柠檬苦素葡萄糖基转移酶基因(lgt),并对其进行生物信息学相关表达分析。方法:提取橘核总RNA,克隆获得了lgt基因序列,通过生物信息学对其蛋白的特征进行分析,构建lgt与其相关物种lgt的系统进化树,利用RT-PCR分析橘核不同时期的lgt基因表达量,并进行分析。结果:克隆获得lgt基因的总长度为1 372 bp,编码457个氨基酸,利用生物信息学分析其属于糖基转移酶超家族的亲水性蛋白,有较多的α-螺旋和自由卷曲,存在于真核生物细胞质,通过RT-PCR分析种子在脱水干燥时期表达量最低,其次为形态建成时期,成熟时期表达量最高。结论:首次从大红袍中成功克隆lgt基因,为橘核中柠檬苦素类物质合成及调控机制奠定了基础。

台湾文旦柚和蜜柚之柠檬苦素葡萄糖转移酶研究

柑橘类果汁在加工过程,在风味上受柠檬苦素影响甚巨,本研究针对台湾柚类柠檬苦素葡萄糖转移酶基因(limonin glucosyltransferase gene, lgt),选殖出一1600 bp片段,并对其作用活性位置预测出一段转录的44胺基酸序列,得到一个完整的开放框架(open reading frame),此段功能性基因有助于未来进行构筑与选殖,应用于柑橘类果汁在风味改进的研究。本研究亦探讨台湾的文旦柚和蜜柚lgt在开花至成熟时期的表现情况。结果得知,蜜柚中仅有第二型存在,且果实中含有大量lgt表现,而文旦同时具有两型lgt存在,但表现量相较于蜜柚低,此结果可应证前人之结论,即文旦柚于果实成长后期采收,因 lgt表现量不足,而导致其果实中仍含有大量苦味化合物仍有存在,导至于加工过程中苦味化合物的生成。本研究利用內果皮以快速蛋白纯化系统(FPLC) HiTrap Q管柱进行纯化,得分子量大约40 kDa之LGTase,并以2,2'-二辛可宁酸(bicinchoninic acid)定量蛋白质为0.6,1 mg/ml,此方法有助提高柚类加工过程中果皮废弃物的利用性。

柠檬苦素类似物糖基转移酶基因(citLGT)在转基因锦橙中的异位表达分析

【目的】分析柠檬苦素类似物糖基转移酶基因(citLGT)在柑橘中的异位表达。【方法】构建了CaMV 35S启动子控制下citLGT的超量和RNAi抑制表达载体。采用农杆菌介导的遗传转化方法将上述植物表达载体分别转化‘锦橙’[Citrus sinensis(Linn.)Osbeck‘Jincheng’]上胚轴。经GUS组织化学染色及PCR检测共获得20株转基因阳性植株。利用qRT-PCR分析转基因植株中citLGT基因的表达。【结果】超量表达citLGT的转基因植株中citLGT的表达量显著高于对照,而RNAi转基因植株中citLGT的表达量则被显著抑制。【结论】本实验为阐明了citLGT基因影响后苦味性状的分子机制和基因工程改良柑橘延迟苦味性状提供了有价值的材料。

柠檬苦素诱导塔宾曲霉UA13高产柠檬苦素转化酶的研究

以柠檬苦素为代表的三萜化合物是柑橘类水果在加工过程中产生“后苦味”的主要原因,采用酶法转化使柠檬苦素的含量降低是目前较适合果汁加工业的方法。该研究以实验室前期分离并经等离子体(atmospheric room temperature plasma,ARTP)诱变获得的塔宾曲霉UA13为出发菌株,采用柠檬苦素作为诱导物对其进行产酶诱导,并对菌株的发酵产酶工艺和酶的底物亲和性进行研究。结果表明,在1 L发酵罐培养基中,接种量10%(体积分数)、初始pH值5.0、搅拌转速250 r/min、30℃的最适条件下发酵,柠檬苦素转化酶活力最高可达48.52 U/mL。酶对柠檬苦素的底物亲和性研究结果表明,柠檬苦素转化酶的K m值为0.622 mmol/L,说明诱导后的菌株UA13所产酶对柠檬苦素的亲和力增强。同时研究结果显示,柠檬苦素转化酶具有较好的耐热性和耐酸性,在柑橘果汁加工业中具有非常好的应用前景。

UDP葡萄糖的等位基因结构：苦柠檬素葡萄糖转移酶影响温州蜜柑和脐橙的苦柠檬素苦涩水平

为了建立用于测定温州蜜柑(Citrus unshiu)和脐橙(C．sinensis)苦柠檬素苦涩水平的分子标记，本文描述了苦柠檬素葡萄糖转移酶转录的遗传背景在积累无苦味苦柠檬素糖甙方面的性状特征。本研究对编码苦柠檬素葡萄糖转移酶的两种类型cDNA无性系(CitLGT-1和CitGT-2)

柑桔果醋加工中柠檬苦素的微生物酶降解研究

在柑桔果醋加工中 ,利用微生物酶进行脱苦研究 ,结果表明 ,经柚苷酶处理后的果酒 ,再经微生物柠檬苦素降解酶处理 ,能较好地除去果醋的柠檬苦素 ,发酵后的果醋其柠檬苦素降低率达 5 5 6%。微生物柠檬苦素降解酶最适pH值为 7 0 ,最适反应温度为40℃ ,在

柚苷酶处理、果汁浓缩和低温贮藏对柚子果汁中柠檬苦素的影响

采用高效液相色谱法测定柠檬苦素含量,以柚子果汁为对象研究柚苷酶处理、果汁浓缩和低温贮藏等工序对柑橘果汁中柠檬苦素含量的影响。结果表明,液相色谱方法可使柠檬苦素、普鲁宁、柚皮苷和柚皮素完全分离,消除了柚皮素对柠檬苦素测定的影响;柠檬苦素检出限为0.95μg/m L,定量限为3.17μg/m L,样品回收率为102.6%~104.2%,相对标准偏差为0.34%~1.04%。柚苷酶水解过程中的加热及果汁浓缩和低温贮藏等操作都能促进柠檬苦素的从果汁中结晶析出,综合采用柚苷酶水解、浓缩和低温贮藏等操作,并经过离心分离可去除柚汁中78%的柠檬苦素,使果汁中柠檬苦素含量降低到19μg/m L。

柠檬苦素降解菌C6降解特性及活性降解酶的分离纯化

对从新鲜醋醅中分离到的一株柠檬苦素降解菌C6(Raoultella ornithinolytica)在酸性条件下的柠檬苦素降解特性进行了研究,并对相关酶系进行了分离纯化。分别从菌龄、接种量、培养时间、柠檬苦素浓度4个因素考察了该菌株对柠檬苦素的降解情况,结合响应面优化了该菌株的降解条件,并在最适条件下对其降解速率进行评价。进一步通过硫酸铵沉淀、Sephadex G-100凝胶过滤层析及DEAE-纤维素柱层析对菌株C6发酵上清液中的柠檬苦素降解酶逐步纯化。结果表明,菌龄10 h、底物柠檬苦素质量浓度为4 mg/L、接种量1%的条件下,作用时间为12 h时菌株C6对柠檬苦素的降解速率可达到91.28%±0.17%,其中作用时间9 h以后降解速率显著增加,经纯化后获得相对分子量约为27 ku的电泳纯柠檬苦素降解酶,纯化倍数为9.44。结果可为该菌株及其酶的进一步开发利用提供理论依据。

柠檬苦素抑制胃癌细胞转移的作用及机制研究

目的探究柠檬苦素(Limonin)抑制胃癌细胞转移的作用及机制。方法首先,对胃癌细胞(BGC-823、SGC-7901、AGS、MGC-803)进行体外培养。随后,利用细胞增殖实验(MTS)检测柠檬苦素(0、180、260、340、420、500μmol·L-1)对胃癌细胞增殖的影响;利用划痕愈合实验研究柠檬苦素(0、40、60μmol·L-1)对胃癌细胞迁移能力的影响。进而建立裸鼠胃癌细胞BGC-823腹腔种植转移模型,给予柠檬苦素[0、12.5、25 mg·(kg·d)-1]腹腔注射治疗28 d后,检测其对胃癌转移的抑制作用。最后,利用Western blot初步研究柠檬苦素与信号转导和转录因子(STAT3)信号通路之间的关系。结果 MTS检测结果显示,柠檬苦素在500μmol·L-1浓度下对多种胃癌细胞增殖的半数抑制率不足50%。但划痕愈合实验发现,在40μmol·L-1浓度下可抑制多种胃癌细胞(BGC-823、SGC-7901、AGS、MGC-803)的迁移。体内实验显示,给药处理21 d,25 mg·kg-1柠檬苦素能预防并抑制裸鼠胃癌移植瘤转移灶的数量,且在该剂量下对小鼠体质量影响不明显。上述结果表明:柠檬苦素剂量依赖性地抑制小鼠肿瘤组织中的STAT3磷酸化和MMP-9蛋白的表达,但对增殖标记物Ki-67的抑制效果不明显。通过免疫组化及Western blot发现,该单体化合物能降低BGC-823细胞STAT3酪氨酸705位点的磷酸化(p Tyr705-STAT3)。结论柠檬苦素能有效预防并抑制胃癌细胞的转移,其作用机制与抑制STAT3的活化有关。

响应面法优化柠檬苦素降解酶的固定工艺

目的采用响应面法优化柠檬苦素降解酶的固定工艺。方法采用海藻酸钠-聚乙烯醇固定柠檬苦素降解酶,通过单因素和响应面实验对固定化条件进行优化,确定最佳的工艺参数。结果优化后的工艺参数为:以聚乙烯醇(0.2 g/100 mL)-海藻酸钠(5.0 g/100 mL)为载体,戊二醛(2 mL/100 mL)为交联剂,采用包埋法固定柠檬苦素降解酶,其中粗酶液浓度0.06 mg/mL、CaCl2浓度6 mg/mL、固定化时间22 h。此条件下的柠檬苦素降解率为(97.87±0.32)%。结论经优化后的工艺生产出的酶降解率高并且易于分离,具有很好的实际应用价值。

丁香酸和柠檬苦素对小鼠肝脏CYP450酶的影响

目的研究丁香酸和柠檬苦素对小鼠肝脏细胞色素P450主要亚型mRNA及蛋白表达水平的影响。方法C57BL/6小鼠随机分为空白对照组、丁香酸组、柠檬苦素组和苯巴比妥组,连续灌胃给药2周,末次给药后处死,提取小鼠肝脏总RNA及肝微粒体,荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术和蛋白质免疫印迹(Western blot)测定CYP450酶主要亚型mRNA和蛋白表达水平。结果在mRNA水平上,丁香酸对Cyp1a2、Cyp2c37、Cyp2d9 mRNA表达没有明显作用,柠檬苦素对Cyp1a2 mRNA的表达有显著诱导作用;在蛋白水平上,丁香酸对CYP1A1、CYP1A2、CYP3A、CYP2D和CYP2E1蛋白的表达有明显的诱导作用,柠檬苦素对CYP1A1、CYP1A2、CYP2A、CYP2D和CYP2E1有显著的诱导,对CYP2B和CYP2C蛋白表达产生抑制作用。结论丁香酸和柠檬苦素对细胞色素P450主要亚型均具有不同程度的诱导和抑制作用。

β-葡萄糖苷酶对胡柚汁脱苦效果的研究

胡柚汁营养丰富,但也有柠檬苦素、柚皮苷等苦味物质。由于这些苦味物质的存在,限制了胡柚的深加工和消费者的需求。本实验利用β-葡萄糖苷酶对胡柚果汁进行了脱苦研究。结果表明,在50℃下pH5的胡柚汁中添加200U/Lβ-葡萄糖苷酶作用60min,对胡柚果汁脱苦效果良好,而对VC等营养成分的损失不明显。

柠檬苦素降解酶的分离纯化与酶学性质

为从根本掌握柠檬苦素(下述均以IDE予以表述)的特性,深化其酶活力,本文将以柠檬苦素IDE的分离纯化与酶学性质研究作为切入点,在此基础上予以深入的探究,相关内容如下所述。

柠檬苦素高效降解菌的分离筛选与鉴定

筛选出在酸性环境下高效降解柠檬苦素的菌株,扩展了生物法消除柑橘果汁中的苦味物质的应用领域。从新鲜醋醅中粗筛并分离出以柠檬苦素为唯一碳源的8株菌,其相应的柠檬苦素降解率均达70%以上,其中6、7、8号菌的柠檬苦素降解率较高,分别为95.14%、98.21%和94.31%。比较3株高效降解菌的胞外蛋白、胞内蛋白和菌液的柠檬苦素降解能力,3株菌中具有降解柠檬苦素的活性蛋白酶主要分布在细胞外,属于胞外蛋白酶,胞内蛋白对柠檬苦素几乎无降解作用,其中6号菌株胞外酶的柠檬苦素降解活性最强,柠檬苦素降解率为45.57%。形态学观察及分子生物学鉴定6、7、8号菌均属于拉乌尔菌属(Raoultella sp.)。菌株6具有高效降解柠檬苦素能力,能够成为今后降解柠檬苦素微生物源的优势菌种。

柠檬苦素调控Tiam1基因表达影响人体血管瘤内皮细胞VEGF/VEGFR2通路及诱导其凋亡的机制研究

目的:研究柠檬苦素Toonaciliatin A对血管瘤内皮细胞(HemEC)增殖、凋亡的影响及潜在作用机制。方法:胶原蛋白酶A分离HemEC细胞,MTT法测定不同浓度Toonaciliatin A对HemEC细胞生存率的影响,流式细胞术测定HemEC细胞凋亡率,Western blot检测蛋白表达,qRT-PCR检测RNA的表达。结果:Toonaciliatin A能够抑制HemEC增殖,促进HemEC细胞凋亡;Toonaciliatin A抑制Tiam1蛋白表达,过表达Tiam1逆转了Toonaciliatin A对HemEC的抑制作用;Toonaciliatin A能够抑制VEGF和VEGFR2蛋白表达,过表达Tiam1逆转了Toonaciliatin A对VEGF和VEGFR2蛋白表达的抑制作用。结论:柠檬苦素类似物Toonaciliatin A通过靶向Tiam1基因抑制VEGF/VEGFR2通路抑制HemEC细胞增殖,促进细胞凋亡。

酶法脱苦对琯溪蜜柚汁主要苦味物质及营养风味的影响

通过不同的柚苷酶添加量、温度、pH值、时间等单因素及正交试验对平和琯溪蜜柚汁酶法脱苦工艺进行优化,探讨不同脱苦条件对蜜柚汁主要苦味物质柚皮苷和柠檬苦素的去除率及营养风味物质维生素C损失率的影响。结果表明,平和琯溪蜜柚汁的最佳酶法脱苦工艺条件为:在琯溪蜜柚原汁pH状态下,添加0.8g·L^(-1)柚苷酶,置于45℃中水浴1h。在此条件下,蜜柚汁的柚皮苷去除率达90.25%、柠檬苦素去除率达87.09%、维生素C损失率为11.33%,能实现良好的风味特征。

椪柑柠檬苦素-UDP-葡萄糖基转移酶基因的克隆、分析及表达

目的克隆中药橘核主要来源品种椪柑Citrus reticulata的柠檬苦素-UDP-葡萄糖基转移酶(limonoid-UDP-glucosyl transferase gene,LGT)基因,并进行生物信息学及表达分析为橘核有效成分合成及调控机制研究提供基础。方法克隆获得LGT序列,通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析,构建LGT与相关物种LGT的系统进化树,利用RT-PCR分析橘皮、橘肉以及橘核中LGT基因表达量,并进行分析和比较。结果测序所得椪柑LGT序列全长为1 530 bp,具有1 509 bp的完整开放阅读框,编码502个氨基酸。并对其蛋白二级、三级结构进行了分析和预测。基因表达分析结果发现椪柑LGT基因在橘核中表达量最低,其次为橘皮,表达量最高为橘肉。结论成功克隆、分析并表达了椪柑LGT基因,为橘核中柠檬苦素类物质合成及调控机制研究提供基础。

矢车菊素-3-葡萄糖苷抑制环氧丙酰胺诱导的MDA-MB-231细胞内谷胱甘肽的降低

为探讨食源性成分降低丙烯酰胺及主要致毒代谢物环氧丙酰胺对人体的危害作用,利用比色法、酶活性检测及免疫分析等方法,从细胞谷胱甘肽及其相关酶解毒的角度,研究了不同浓度的矢车菊素-3-葡萄糖苷对环氧丙酰胺引起的人类乳癌细胞MDA-MB-231毒性的影响.结果表明,与环氧丙酰胺单独处理的细胞相比,矢车菊素-3-葡萄糖苷预处理后,能够显著降低细胞毒性及胞内活性氧水平,明显提高细胞内还原型谷胱甘肽含量,抑制谷胱甘肽过氧化物酶与谷胱甘肽S转移酶活性的升高,并且提高两种酶的蛋白表达量.矢车菊素-3-葡萄糖苷对环氧丙酰胺引起的MDA-MB-231细胞毒性具有明显的抑制作用.

一种L-选择素配体合成酶在子宫内膜异位症种植窗期内膜中的表达

目的检测N乙酰氨基葡萄糖6磺基转移酶(Nacetylglucosamine6Osulfotransferase),一种合成L选择素配体的关键酶,在生育年龄的子宫内膜异位症患者及非子宫内膜异位症妇女种植窗期子宫内膜中的表达。方法采用RTPCR技术检测8例子宫内膜异位症患者和20例非子宫内膜异位症妇女种植窗期子宫内膜中N乙酰氨基葡萄糖6磺基转移酶的表达。结果种植窗期子宫内膜有该酶的表达;子宫内膜异位症组表达的灰度值为0.124±0.069,明显少于对照组0.511±0.25(P<0.05)。结论子宫内膜异位症患者在位子宫内膜种植窗期N乙酰氨基葡萄糖6磺基转移酶的基因表达呈降调状态,这种异常表达可能与子宫内膜异位症患者胚胎的种植率低下以及异位病灶的发病机制有关,成为导致不孕的病理环节之一。

黄芩素在溃疡性结肠炎模型大鼠肝、肠微粒体中酶促反应动力学研究

目的考察黄芩素在正常和溃疡性结肠炎大鼠肝、肠微粒体中的酶促反应动力学差异。方法采用3%葡聚糖硫酸钠连续自由饮用10 d,诱导溃疡性结肠炎大鼠模型,分别制备正常和溃疡性结肠炎大鼠肝、肠微粒体,通过建立大鼠肝、肠微粒体体外孵育体系对黄芩素代谢进行研究,采用HPLCDAD检测方法对代谢产物黄芩苷进行定量测定,应用Graph Pad Prism 5.0软件分析数据,对比黄芩素在正常和溃疡性结肠炎模型中的酶促反应动力学常数最大反应速率(Vmax)和米氏常数(Km)。结果黄芩素(5~150μmol·L^(-1))在正常和溃疡性结肠炎大鼠肝微粒体中的代谢属于经典的米氏方程,Km分别为(59.13±7.756)、(57.45±6.699)μmol·L^(-1),Vmax分别为(6.086±0.3234)、(7.447±0.347)μmol/(min·mg),而在肠微粒体中符合底物抑制动力学特征,抑制速率(Ki)分别为(166.4±58.31)、(141.7±41.17)μmol·L^(-1),Vmax分别为(4.130±0.6035)、(5.797±0.7903)μmol/(min·mg)。不管是正常组还是模型组,黄芩素在肝脏中的代谢速率要显著高于肠微粒体;与正常组相比,溃疡性结肠炎大鼠肝、肠微粒体中黄芩素葡萄糖醛酸化反应的速率显著升高,同时发现了黄芩素的一个新代谢产物,可能为黄芩苷的同分异构体。结论溃疡性结肠炎疾病状态能够显著升高葡萄糖醛酸化转移酶的活性,可能是导致黄芩苷在疾病状态下体内暴露强度增加的因素之一。