烟草柠檬酸合成酶基因的克隆及其光诱导型植物表达载体的构建

紫花苜蓿为多年生优质豆科牧草。我国南方地区酸性土壤分布比较广,铝害比较严重,限制了紫花苜蓿在南方地区的推广利用。提高有机酸合成酶基因的表达活性,增加有机酸的合成与分泌,有利于增强植物的耐铝性。本研究根据Genebank中已知的烟草柠檬酸合成酶(Citrate Synthase,cs)基因的序列,通过RT-PCR从烟草总RNA中扩增cs基因的cDNA,亚克隆于T载体得到重组载体pMD18-cs,对pMD18-cs中的插入片断进行核酸序列分析确认为cs基因的cDNA全长。用光诱导型启动子(Rubisco,小亚基的启动子)和双元载体pPZP211构建了cs基因的光诱导型植物表达载体pPZP211-PrbcS-cs,为利用基因工程手段提高紫花苜蓿耐铝毒能力,促进其在南方地区推广利用奠定了物质基础。

紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因的克隆及对烟草的转化

柠檬酸合成酶是调节植物体内有机酸的活性酶之一,增加植物体内的柠檬酸可以提高植物对土壤中磷的吸收以及抗铝毒性。通过从紫花苜蓿(Medicago sativaL.)中克隆柠檬酸合成酶基因(MsCS),以期获得该基因全长,并为将来研究紫花苜蓿耐铝性以及对磷的吸收方向提供基础。首先利用cDNA末端快速扩增方法(RACE),克隆获得MsCS的cDNA全序列,然后利用pBI121构建植物超表达载体pBI-MsCS,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草(Nicotiana tabacumL.)。结果显示:该基因序列全长为2031 bp,开放阅读框1551 bp,编码517个氨基酸,与其他物种的柠檬酸合成酶具有高度的同源性。获得17株卡那抗性植株。经PCR检测有6株为阳性植株,初步表明该基因已整合到烟草的基因组中。

利用农杆菌介导法获得转柠檬酸合成酶基因粳稻及其耐低磷的研究

利用根癌农杆菌介导法将柠檬酸合成酶CS基因导入吉林省主栽超级粳稻品种吉粳88中。经PCR检测,获得162株转基因阳性植株。转基因植株后代进一步经过PPT抗性筛选、分子检测和耐低磷筛选,获得5株(T3代)耐低磷性状明显且农艺性状较好的转基因植株。对转基因植株柠檬酸合成酶活性和柠檬酸含量的测定以及形态学和产量性状调查结果表明:转基因植株优于非转基因对照植株。

牡丹PsCS基因的克隆及序列分析

以牡丹品种‘赵粉’(Paeonia suffruticosa L.cv.‘Zhao Fen’)为试材,采用RT-PCR和RACE方法从雄蕊中获得了一个牡丹柠檬酸合成酶(citrate synthase,CS)基因cDNA全长,命名为PsCS,GenBank登录号为HQ449568。其cDNA全长1 564 bp,包含75 bp的5'非编码区、73 bp的3'非编码区和一个长度为1 416 bp编码471个氨基酸的开放阅读框。序列比对和系统进化分析表明,PsCS与葡萄的亲缘关系最近,相似性达89.4%以上。

浙江省蜱标本中斑点热群立克次体rOmpA和gltA基因检测

目的了解浙江省部分山区蜱中感染斑点热群立克次体的状况,探讨以外膜蛋白A(rOmpA)和柠檬酸合成酶基因(gltA)为靶基因的PCR方法可行性。方法利用PCR方法,检测天台县左溪镇和临安县西天目地区共46组蜱类标本中rOmpA和gltA基因特异片段。对所检测到的阳性结果进行克隆与序列测定,并进行聚类分析。结果从46组蜱标本中检测发现2组长角血蜱中斑点热群立克次体的rOmpA和gltA基因片段均为阳性,核酸序列基本一致,但推测斑点热群立克次体种的进化位置存在差异。结论浙江省部分山区存在蜱中感染斑点热群立克次体的状况。利用rOmpA和gltA基因能从标本中检测到斑点热群立克次体,但从2个结果推测立克次体的分类位置存在差异。