草鱼柠檬酸合酶基因SNP筛选及与生长性状的关联分析

根据草鱼(Ctenopharyngodon idella)EST-SNP库中预测的柠檬酸合酶基因的1个Contig序列,设计引物扩增该基因的部分序列,然后采用PCR产物直接测序法筛选SNP突变点。测序的序列经比对后,共筛选到2个在内含子10上的SNP突变点:A-386G和C-499G。随机选择同批繁殖和同塘混养的144尾草鱼对2个SNP位点用Snapshot方法进行检测和分型,并统计基因型频率。A-386G位点的AA基因型占47.10%,AG基因型占38.41%、GG基因型占14.49%;C-499G位点的CC基因型占31.85%,CG基因型占46.67%,GG基因型占21.48%,均属于中度多态位点。利用一般线性模型(GLM)分析2个SNP位点与草鱼6个生长性状(体质量、体长、体高、头长、尾柄长和尾柄高)的相关性,结果显示,A-386G和C-499G位点的不同基因型在这6个生长性状均值有差异,但均不存在显著差异。将这2个SNP不同基因型两两组合,一共组成7种双倍型(去掉频率小于3%的组合D2和D5),GLM相关分析表明5种双倍型在5个生长性状(体质量、体长、体高、尾柄长和尾柄高)上均存在差异,其中在头长上存在显著差异,D6双倍型(A-386G/AG和C-499G/GG)在6个生长性状上均值均最大,属于生长优势双倍型。本研究显示,筛选到的柠檬酸合酶基因上的2个SNP位点具有用于草鱼生长性状的分子辅助育种的潜力。

柠檬酸合酶的分子生物学研究进展

柠檬酸合酶(citrate synthase,CS)是细胞内多种重要代谢途径的关键酶。CS可催化草酰乙酸和乙酰辅酶A之间的缩合反应生成柠檬酸和辅酶A。通常革兰氏阳性细菌、古菌以及真核细胞的CS为同源二聚体,而革兰氏阴性细菌的CS为同源六聚体。根据其在细胞内的定位不同,CS可分为线粒体CS、乙醛酸循环体CS、过氧化物酶体CS。这些同工酶在能量代谢、植物脂肪的代谢、脂肪酸的氧化及细胞解毒过程中起着重要作用。不同来源的CS空间结构、催化机制和动力学性质十分相似。针对其生化特性、空间结构特点、催化机制以及分子进化等研究进展进行综述。

光诱导和组成型启动子控制柠檬酸合酶基因过量表达对转基因烟草耐铝性影响的比较

分别用光诱导型启动子（PrbcS）和组成型启动子（Ca MV35S）驱动柠檬酸合酶基因（cs）在转基因烟草中过量表达,比较转基因烟草中柠檬酸的含量和分泌量及其铝耐受性的变化.结果表明：诱导型转基因株系的CS酶活性是野生型的2.3~2.4倍,组成型转基因株系的酶活性是野生型的1.6~2倍;在30μmol·L-1铝胁迫下,诱导型转基因植株的根相对伸长量是野生型的2.8~2.9倍,组成型的根相对伸长量是野生型的2~2.3倍;在无铝或300μmol·L-1铝胁迫下,转基因烟草叶片和根中柠檬酸含量均高于野生型,其中诱导型转基因植株叶片中柠檬酸含量高于组成型转基因植株,转基因烟草柠檬酸的分泌量分别是野生型的1.8~2.0倍和3.0~3.3倍;在有铝胁迫的珍珠岩基质上培养时,转基因烟草的生长情况好于野生型.这些结果证明,与Ca MV35S相比,采用PrbcS启动子控制cs基因的过量表达可更有效地增加转基因烟草中CS的酶活性及叶片中柠檬酸的合成量,同时也能更有效地提高转基因烟草柠檬酸的分泌量,从而增强其对铝毒害的抵御能力.

水稻柠檬酸合酶编码基因的初步研究

以粳稻cDNA为模板,设计一对特异性引物,获得编码水稻柠檬酸合酶基因的cDNA序列,全长为1470bp,ORF区含475个氨基酸,推定蛋白序列与红葡萄、烟草、甜菜、拟南芥和柑橘等物种都有较高的同源性(>70%),氨基末端含一线粒体靶信号。Southern分析表明此基因在水稻基因组中具有多个拷贝数。经0.4mmol/LIPTG诱导,根据Western印迹分析获得预测的蛋白大小为59kD。

香蕉柠檬酸合酶基因MaGCS的克隆及生物信息学分析

采用RACE-PCR的方法首次在香蕉中获得一个柠檬酸合酶基因的cDNA序列。经序列测定和Blastx比对分析表明,该cDNA全长1885bp,编码513个氨基酸残基,具有植物柠檬酸合酶基因的特征结构域,并与其他植物来源的乙醛酸循环体的柠檬酸合酶具有很高的序列相似性,将其命名为MaGCS(Musa glyoxysomal citrate synthase),并对其进行生物信息学分析,初步预测其理化性质及功能等。

森林草莓柠檬酸合酶基因的表达分析

我们解析了森林草莓的1个线粒体柠檬酸合酶基因(Fvmcs)和1个乙醛酸循环体柠檬酸合酶基因(Fvgcs)。它们具有柠檬酸合酶基因特有的结构和功能域,并且与其它植物的柠檬酸合酶有很高的序列相似性。在各种组织以及不同发育阶段的果实中,2个柠檬酸合酶基因都是组成型的表达。本研究为提高草莓果实品质和植物抗逆性提供科学依据。

油菜柠檬酸合酶基因的克隆及在逆境下的表达

柠檬酸合酶是植物多种代谢途径的限速酶,及代谢变化的标志酶。为了解油菜柠檬酸合酶基因的生理功能,以甘蓝型油菜叶片cDNA为模板,设计特异性引物,获得一编码柠檬酸合酶基因的cDNA序列,全长1 659 bp,ORF区含476个氨基酸残基,序列比对显示其蛋白序列与拟南芥有较高的同源性(96.0%),氨基末端含一线粒体靶信号。聚类分析表明,油菜柠檬酸合酶基因与其他植物内该基因高度同源。对油菜幼苗进行植物生长调节物质、高温和低温、强光照和弱光照、盐、菌核病、干旱和水渍等处理,采用半定量PCR法对油菜叶片柠檬酸合酶基因的表达模式进行检测,发现在盐胁迫、暗光和强光的处理下,柠檬酸合酶基因的表达基本没有变化;在水渍、干旱、IAA和6-BA胁迫下,其表达有所升高,但出现峰值的时间不同,ABA对表达模式的影响与IAA相反;感染菌核病后其表达降低;对GA3的应答呈鞍型。对部分处理采用荧光定量PCR验证,其结果与半定量PCR结果基本一致。

甜橙柠檬酸合酶基因的克隆及其表达分析

柠檬酸合酶与柠檬酸的积累密切相关。为了研究该基因的功能及其调控,通过设计特异性引物对甜橙柠檬酸合酶基因进行了克隆,采用半定量PCR法对哈姆林叶片、果肉和果皮中该基因的表达模式进行检测。克隆得到甜橙柠檬酸合酶基因的cDNA序列,全长1535bp,ORF区含471个氨基酸残基,序列比对显示,哈姆林甜橙柠檬酸合酶基因与其他植物的该基因高度同源。半定量PCR结果显示果肉和果皮中柠檬酸合酶基因在各个时期的表达基本没有变化,而叶片中其表达水平随果实发育成熟不断降低,与果实中柠檬酸含量变化趋势相同。说明叶片中柠檬酸合酶基因表达与果实酸含量正相关。

酸橙柠檬酸合酶基因电子克隆和生物信息学分析

通过电子克隆技术对酸橙柠檬酸合酶(CS)基因进行预测。以甜橙CS序列为探针,基于NCBI中酸橙的EST数据库和CAP3在线软件进行序列拼接,利用生物信息学数据库及相关软件对拼接序列结构和功能进行预测分析。结果表明:酸橙CS基因全长1535 bp,包含1416 bp的开放阅读框,编码471个氨基酸,该蛋白为亲水性蛋白。结果可为进一步解释基因的分子功能奠定理论及实验基础。

苹果柠檬酸合酶3基因家族成员鉴定及表达分析

柠檬酸合酶(citrate synthase 3,CS3)是细胞代谢途径中的关键酶之一,其活性调节着生物体的物质和能量代谢过程。本研究旨在从苹果全基因组中鉴定CS3基因家族成员,并进行生物信息学和表达模式分析,为研究苹果CS3基因的潜在功能提供理论基础。利用BLASTp基于GDR数据库鉴定苹果CS3家族成员,通过Pfam、SMART、MEGA5.0、clustalx.exe、ExPASy Proteomics Server、MEGAX、SOPMA、MEME和WoLF PSORT等软件分析CS3蛋白序列基本信息、亚细胞定位情况、结构域组成、系统进化关系以及染色体定位情况。利用酸含量的测定和实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)技术检测苹果6个CS3的组织表达和诱导表达特性。苹果CS3基因家族包含6个成员,这些CS3蛋白包括473-608个不等的氨基酸残基,等电点分布在7.21-8.82。亚细胞定位结果显示CS3蛋白分别定位在线粒体和叶绿体。系统进化分析可将其分为3类,各亚家族基因数量分别为2个。染色体定位结果显示,CS3基因分布在苹果不同的染色体上。蛋白二级结构以α-螺旋为主,其次是无规则卷曲,β-转角所占比例最小。筛选的6个家族成员在不同苹果组织中均有表达,整体表达趋势从高到低依次为MdCS3.4相对表达含量最高,MdCS3.6次之,其他家族成员相对表达量依次为MdCS3.3>MdCS3.2>MdCS3.1>MdCS3.5。qRT-PCR结果显示,MdCS3.1和Md CS3.3基因在酸含量较低的‘成纪1号’果肉中相对表达量最高,酸含量较高的‘艾斯达’果肉中MdCS3.2和MdCS3.3基因相对表达量最高。因此,本研究对不同苹果品种中CS3基因相对表达量进行了检测,并分析了其在苹果果实酸合成过程中的作用。结果表明,CS3基因在不同苹果品种中的相对表达量存在差异,为后续研究苹果品质形成机制提供了参考。

过量表达钝齿棒杆菌柠檬酸合酶编码基因prpC2对L-精氨酸合成的影响

钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5是诱变选育的一株高产精氨酸菌株。柠檬酸合酶作为TCA途径的关键酶,对细胞胞内氨基酸代谢流调节有重要作用。在钝齿棒杆菌SYPA5-5中过量表达同源的柠檬酸合酶(citrate synthase)基因prp C2,研究其对精氨酸及副产物合成的影响。重组菌C.crenatum SYPA5-5/p DXW-10-prp C2胞内柠檬酸合酶比酶活提高了5.37倍,使L-精氨酸产量在5L发酵罐中达到44.7g/L,与对照相比提高了23.1%。同时,有机酸测定分析TCA循环的精氨酸前体柠檬酸及异柠檬酸的量有所提高,且赖氨酸合成前体草酰乙酸量减少,氨基酸测定分析L-精氨酸发酵中最主要的副产物L-赖氨酸浓度由原来的5.96g/L降到1.21g/L,降低了80%。

榔梅果实转录组分析及其柠檬酸生物合成途径关键酶基因结构与功能预测

榔梅作为孑遗树种,果实极具药用价值。为研究榔梅柠檬酸的生物合成途径,采用Illumina HiSeq XTen高通量测序技术对榔梅果实进行转录组测序,经过拼接组装后得到38936条unigene,其中28311条unigene被公共数据库成功注释,15193条unigene映射到265条KEGG代谢通路;18908条unigene可归类到59个GO功能亚类。在柠檬酸合成与代谢途径中,共有103条unigene编码15个关键酶参与柠檬酸循环。对柠檬酸合酶进行序列分析和同源建模,结果显示榔梅的柠檬酸合酶是以α螺旋为主的同源二聚体蛋白,酶的活性中心氨基酸高度保守。该研究为榔梅果实中柠檬酸生物合成途径的解析奠定了基础,促进了榔梅基因资源的保护和开发。

敲除aceA和gogat及过表达gltA对谷氨酸棒状杆菌GKGD合成α-酮戊二酸的影响

α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)在生命活动中具有重要的作用,被广泛应用于食品、医药等领域。以α-KG生产菌谷氨酸棒状杆菌GKGD为出发菌株,敲除其异柠檬酸裂解酶编码基因ace A以增加异柠檬酸供应,获得GKGD-1,摇瓶发酵条件下其α-KG产量和转化率分别提高14.72%和9.76%;敲除谷氨酸合酶编码基因gogat以降低L-谷氨酸生成量,获得GKGD-2,其α-KG产量和转化率分别提高7.39%和5.43%,L-谷氨酸生成量降低52.87%;过表达柠檬酸合酶编码基因glt A以进一步增加前体物供应,获得GKGD-3,其α-KG产量提高35.9%;于7.5 L发酵罐经30 h发酵,GKGD-3α-KG产量达49.5 g/L,较出发菌株提高36.4%,L-谷氨酸生成量降低50%。敲除ace A和gogat并过表达glt A可显著提高α-KG产量并降低L-谷氨酸生成量。

运动对骨骼肌酶活性调节的研究进展

通过查阅文献，分析并讨论运动对骨骼肌中无氧代谢酶已糖激酶（HK）、乳酸脱氢酶（LDH）和有氧代谢酶柠檬酸合酶（CS）、琥珀酸脱氢酶（SDH）活性的影响。

周期性高张应变通过下调PGC1α表达抑制血管平滑肌细胞线粒体生物发生

目的 探讨高血压背景下病理性高张应变对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)线粒体生物发生的影响,以及PGC1α蛋白在这一过程中的作用。方法 采用Flexcell-5000T体外细胞张应变加载系统对VSMCs施加频率为1.25 Hz、幅度分别为5%和15%的周期性张应变,模拟正常生理情况和高血压病理情况下的力学环境;通过蛋白免疫印迹(Western blotting)和荧光定量PCR(qPCR)方法检测正常生理和高血压病理力学条件下VSMCs的PGC1α蛋白表达,以及柠檬酸合酶和线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)拷贝数变化情况;应用PGC1α特异性激活剂ZLN005和有效干扰片段siRNA检测PGC1α表达上调或下调对柠檬酸合酶和mtDNA拷贝数的影响。结果 与5%生理性周期性张应变相比,15%病理性高张应变显著抑制VSMCs的PGC1α和柠檬酸合酶的表达,mtDNA拷贝数显著降低。与对照组相比,对VSMCs转染PGC1α干扰片段siRNA或孵育PGC1α特异性激活剂ZLN005,分别下调和上调PGC1α蛋白表达,VSMCs的柠檬酸合酶表达和mtDNA拷贝数也相应地降低和增加。在加载生理性周期性张应变条件下,对VSMCs转染PGC1α干扰片段siRNA显著下调其蛋白表达;对VSMCs施加PGC1α特异性激活剂ZLN005显著上调PGC1α蛋白表达,柠檬酸合酶表达和mtDNA拷贝数也被增加。结论 高血压背景下病理性周期性高张应变通过抑制VSMCs的PGC1α蛋白显著下调VSMCs的柠檬酸合酶表达和mtDNA拷贝数,进而导致VSMCs线粒体功能障碍。PGC1α可能是缓解高血压病理进程的潜在治疗靶向分子。

中间球海胆CS基因克隆及其响应急性高温胁迫的表达模式

【目的】明确中间球海胆(Strongylocentrotus intermedius)柠檬酸合酶(CS)基因(SiCS)的序列特征、组织表达情况及其应对急性高温胁迫的响应规律,为研究SiCS基因功能及揭示其参与中间球海胆高温应答的分子机制提供理论依据。【方法】利用RACE克隆SiCS基因cDNA序列,通过BLASTx、EXPASY Proteomics Server、HMMER、PSIRED v3.3及SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析;然后采用分光光度法检测中间球海胆管足和性腺线粒体肿胀度,运用实时荧光定量PCR检测SiCS基因的组织表达规律,并以Epoch酶标仪测定中间球海胆管足和性腺总SiCS活性变化情况。【结果】SiCS基因cDNA序列全长2971 bp,5'端非编码区(5'-UTR)和3'端非编码区(3'-UTR)分别为96和1480 bp,开放阅读框(ORF)为1395 bp,共编码464个氨基酸残基。SiCS蛋白分子量约51.48 kD,理论等电点(pI)为6.09,总平均亲水性(GRAVY)为-0.178,为稳定的温和疏水性蛋白;SiCS蛋白不存在信号肽和跨膜结构域,其二级结构中α-螺旋占43.86%、β-折叠占7.02%、无规则卷曲占49.12%,三维结构模型与野猪CS蛋白晶体结构的一致性为73.97%。SiCS氨基酸序列与紫球海胆(S.purpuratus)的CS氨基酸序列相似性最高,为92.90%。SiCS基因在中间球海胆的5种组织中均有表达,其相对表达量排序为体腔细胞>围口膜>性腺>管足>肠道;总SiCS活性排序则为管足>肠道>围口膜>性腺>体腔细胞;与对照组(20℃)相比,经23和26℃急性高温胁迫后中间球海胆管足和性腺的SiCS基因相对表达量及总SiCS活性均呈波动变化规律,但在不同高湿胁迫下和不同组织中有所差异。【结论】中间球海胆可能通过调整组织中的SiCS基因相对表达及SiCS活性来响应急性高温胁迫,且这种响应策略存在一定的组织和温度特异性,具体表现为性腺对急性高温胁迫较管足更敏感。

高温对大鼠组织CS、OGDH含量和下丘脑线粒体数量的影响

为了解高温环境对正常大鼠和中枢麻醉大鼠腓肠肌、肝组织柠檬酸合酶(CS)、酮戊二酸脱氢酶(OGDH)含量和下丘脑线粒体数量等能量代谢指标的影响。将40只SPF级SD大鼠,随机分为常温正常对照组(常对组)、高温正常对照组(高对组)、常温中枢麻醉组(常麻组)、高温中枢麻醉组(高麻组),连续饲养30d后测定大鼠葡萄糖(GLU)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和腓肠肌、肝组织CS、OGDH含量,并观察下丘脑线粒体数量。结果显示,高对组和高麻组的体重和肝组织OGDH的含量、常麻组和高麻组血清TC、高对组和常麻组肝组织CS的含量均显著下降(P<0.01,P<0.05),而高对组和高麻组血清TG和腓肠肌OGDH的含量、常麻组和高麻组腓肠肌CS的含量和下丘脑线粒体数量均显著升高(P<0.01,P<0.05);与常麻组比较,高对组和高麻组的体重和肝组织OGDH的含量、高对组腓肠肌CS的含量和下丘脑线粒体数量均显著下降(P<0.05,P<0.01),但高对组和高麻组血清TG的含量、高麻组肝组织CS的含量显著升高(P<0.05,P<0.01)。由此认为,高温可降低大鼠体重、血清TC、肝组织OGDH含量,增高血清TG、腓肠肌OGDH、CS含量,中枢神经麻醉对以上结果均有一定的协同作用;中枢神经麻醉可显著增加大鼠下丘脑线粒体数量,高温环境对其增加有一定协同作用。

酸柚根系CS和PEPC基因的克隆及序列分析

以酸柚(Citrus grandis)根系为材料,利用热硼酸法提取了根系总RNA,并逆转录成cDNA,利用PCR和RACE技术相继得到柠檬酸合酶基因(CS)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)的保守区、3'端和5'端.酸柚根系CS基因全长1760bp,开放读码框有1413 bp,编码472个氨基酸,氨基酸序列相对分子质量为52.487 ku,等电点为6.9,亲水指数为-0.199;5'端非编码区为67 bp,3'端非编码区为277 bp;推导的氨基酸经序列比对,发现与其他物种具有很高的同源性(85.4%-99.6%).酸柚根系PEPC基因全长3307 bp,开放读码框有2604 bp,编码868个氨基酸,氨基酸序列相对分子质量为99.569ku,等电点为6.68,亲水指数为-0.398;5'端非编码区为431 bp,3'端非编码区为269 bp,推导的氨基酸经序列比对,发现与其他物种具有很高的同源性(85.8%-95.7%).初步确定克隆到的为酸柚根系CS和PEPC基因,登陆Genbank,登陆号分别为HQ537481和HQ537482.

南方鲇不同组织间线粒体代谢的比较研究

采用人工繁殖的同批南方鲇(Silurus meridionalis Chen)幼鱼为研究对象,分别在7.5、10、12.5、17.5、22.5、27.5、32.5、35和37.5℃条件下测定其心脏、肾脏、肝脏、脑和白肌的线粒体呼吸率、细胞色素c氧化酶(CCO)的活性,以检测不同组织线粒体的含量及代谢特征的差异性。在27.5℃下,南方鲇心脏、肾脏、肝脏、脑和白肌线粒体状态3呼吸率分别为69.94、30.98、32.36、18.89和7.34 nmol O2/min.mg;CCO活性分别为676.54、327.46、294.34、153.23和65.73 nmol O2/min.mg。统计检验表明,状态3呼吸率和CCO活性均表现为:心脏显著高于其他4种组织(P<0.05),白肌则要显著低于其他4种组织(P<0.05),肾脏和肝脏之间差异不显著,但均显著高于脑(P<0.05)。试验测定了以上5种组织的柠檬酸合酶(CS)活性来表征组织中线粒体含量。在27.5℃条件下CS的活性则分别是17.93、7.20、8.42、6.12和1.35 U/mg,心脏显著高于其他4种组织(P<0.05),肝脏、肾脏和脑之间差异不显著,但都显著高于白肌(P<0.05)。在7.5℃—32.5℃范围内,南方鲇的心脏、肝脏、肾脏、脑和白肌5种组织的线粒体状态3呼吸率和CCO活性均随着温度的升高而增加,但在高温端,心脏中这两种代谢指标开始出现随温度上升而下降的趋势。在低温端(7.5℃—10℃)和高温端(35℃—37.5℃),各组织线粒体呼吸率RCR值多数小于4,在37.5℃下的心脏和7.5℃下的白肌的RCR值分别低至1.76和1.85。研究结果提示,南方鲇不同组织间线粒体含量可以由CS活性作为间接指标进行比较,而各组织间线粒体含量及其代谢能力存在较大的差异。心脏表现出高含量、高代谢能力和低的耐受高温能力;白肌为低含量、低代谢能力和低的耐受低温能力;肝脏、肾脏和脑表现为中等含量、中等活性和较高的耐受极端温度能力。