表面偶极离子亲水磁珠固定化异柠檬酸裂解酶及其表征

比较两种亲水磁珠固定化结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶(Mycobacterium tuberculosis isocitrate lyase,Mt ICL)并优化,为天然产物中Mt ICL先导抑制剂的亲和富集筛选提供适用的固定化酶。构建6×His-pET28a-ICL,经E.coli BL21(DE3)重组表达、Ni^(2+)-NTA柱纯化和酶学性质表征获得Mt ICL(重组蛋白质)。用羧基功能化和Ni^(2+)-NTA功能化制备两种表面偶极离子亲水磁珠固定化Mt ICL,比较其固载量、酶活力、稳定性及对已知抑制剂的响应。羧基磁珠固定化酶表观保留比活显著高于Ni^(2+)-NTA固定化酶。当羧基磁珠与重组蛋白质加样质量比为60∶1时,固定化酶表观保留比活可达游离酶的85%,此时羧基磁珠对Mt ICL表观固载量为(7.2±0.2)mg/g(以磁珠质量计,n=3)。羧基磁珠固定化Mt ICL对衣康酸的亲和力与游离酶无显著差异(P>0.05),且稳定性更强。此羧基磁珠固定化Mt ICL可望作为磁分离、亲和富集筛选天然产物中Mt ICL抑制剂类抗结核先导化合物。

基于数据挖掘分析肝细胞癌中ATP柠檬酸裂解酶表达的临床意义

目的多数据库分析ATP柠檬酸裂解酶(ACLY)在肝细胞癌中的表达和临床意义。方法采用UALCAN、GEPIA和HPA数据库分析ACLY mRNA和蛋白在肝癌组织中的表达水平,ACLY异常表达与肝细胞癌患者临床病理指标和生存期的关系;采用STRING数据库分析以ACLY为中心相关蛋白之间的相互作用。结果ACLY在肝癌组织中表达水平高于正常组织,差异有统计学意义(P<0.05);肝癌组织中ACLY高表达与肿瘤临床分期、病理分级、淋巴结转移有关;癌组织高表达ACLY的肝细胞癌患者生存率低于ACLY低表达患者,差异有统计学意义(P<0.05)。ACLY及其相互作用蛋白质主要参与脂肪酸合成代谢、脂质和胆固醇代谢过程的调节。结论ACLY在肝癌组织中高表达,与肝细胞癌肿瘤生物学行为和肝细胞癌患者不良预后有关。

肺炎支原体经信号转导和转录激活因子3上调气道上皮细胞三磷酸腺苷柠檬酸裂解酶表达调控组蛋白乙酰化

目的探讨肺炎支原体(Mp)经信号转导和转录激活因子3三磷酸腺苷柠檬酸裂解酶(STAT3)上调气道上皮细胞ATP柠檬酸裂解酶(ACLY)表达调控组蛋白乙酰化。方法体外培养气道上皮细胞系BEAS-2B细胞,采用感染复数(MOI)为100的Mp感染的BEAS-2B细胞,观察并计算其感染0、0.5、1.0、2.0 h的相对灰度值;收集BEAS-2B细胞感染MOI为0、25、50及100的Mp,计算BEAS-2B细胞感染不同MOI Mp 24 h ACLY蛋白相对灰度值。实验分为溶剂对照组(0.1%二甲基亚砜)、单纯抑制剂对照组(25μmol/L BMS 303141)、Mp感染组(MOI 100Mp感染24 h)和Mp+抑制剂处理组(Mp感染前用25μmol/L BMS 303141预处理细胞1 h)。蛋白免疫印迹(WB)检测Mp感染前后STAT3磷酸化、ACLY表达及H3、H4蛋白乙酰化,荧光发光法测定细胞内乙酰辅酶A(CoA)的浓度,并通过ACLY抑制剂处理,以研究ACLY在调控乙酰CoA的合成以及H3和H4乙酰化中的作用。结果Mp感染BEAS-2B细胞0、0.5、1.0、2.0 h,STAT3磷酸化灰度值比较差异有统计学意义(P<0.05);随着Mp感染BEAS-2B细胞时间延长,STAT3磷酸化灰度值呈升高趋势,差异有统计学意义(P<0.05)。MOI 0、25、50、100 ACLY蛋白相对灰度值、乙酰CoA相对光强度比较差异有统计学意义(P<0.05);随着MOI增加,ACLY蛋白相对灰度值、乙酰CoA相对光强度均呈升高趋势,差异有统计学意义(P<0.05)。4组乙酰CoA相对荧光强度比较差异有统计学意义(P<0.05);Mp感染组、Mp+抑制剂处理组乙酰CoA相对荧光强度均高于溶剂对照组、单纯抑制剂对照组,Mp+抑制剂处理组高于Mp感染组,差异有统计学意义(P<0.05)。4组乙酰化H3和H4相对灰度值比较差异有统计学意义(P<0.05);Mp感染组、Mp+抑制剂乙酰化H3和H4相对灰度值均高于溶剂对照组、单纯抑制剂对照组,Mp+抑制剂处理组高于Mp感染组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论ACLY表达升高在连接代谢和炎症反应中发挥重要作用,是导致组蛋白乙酰化的关键,表明柠檬酸-ACLY途径在调节免疫细胞功能中发挥重要作用,可能是治疗的潜在靶点。

异柠檬酸裂解酶的制备及其抑制剂筛选模型的建立

目的制备结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶(isocitrate lyase,ICL)并建立ICL抑制剂筛选模型。方法通过四步层析法或金属螯合层析法纯化大肠埃希菌BL21(DE3)表达的ICL,并以异柠檬酸为底物,用纯化的ICL裂解异柠檬酸,生成乙醛酸可与苯肼反应生成苯腙,苯腙在324nm波长下产生光吸收峰,测定酶促反应体系在324nm波长下光吸收检测异柠檬酸裂解酶的活性,根据待测样品对酶活性的抑制程度,筛选异柠檬酸裂解酶抑制剂。结果用金属螯和层析法得到纯度为90%、比活力为2.8U/mg的ICL,建立并优化ICL抑制剂筛选模型,模型的信噪比(S/N)远大于3,变异系数(CV)远小于10%。结论通过金属螯合层析法获得了特异性高、稳定性好的ICL抑制剂筛选模型,该模型可有效的应用于异柠檬酸裂解酶抑制剂的高通量筛选。

巨噬细胞内马尔尼菲青霉异柠檬酸裂解酶的表达

目的比较巨噬细胞内马尔尼菲青霉(Pm)的异柠檬酸裂解酶(ICL1)基因转录及蛋白表达水平,初步探讨乙醛酸循环在Pm致病中的意义。方法将Pm分生孢子与Raw264.7细胞共培养16份,随机分为4组:处理组(T)采用脂多糖及小鼠γ干扰素处理,处理抑制组(TI)在处理组的基础上加入一氧化氮合酶抑制剂(LNMMA),对照组(C)加入同体积的培养基,对照抑制组(CI)在对照组基础上加入LNMMA;采用实时RT-PCR法比较各组细胞内Pm的ICL1基因转录水平;采用酶催化反应检测ICL1蛋白表达及活性;采用菌落计数比较各组细胞内Pm的数量;采用化学法检测一氧化氮含量。结果C组、CI组、T组、TI组的ICL1相对转录水平分别为1.00、1.42、33.09、74.88,蛋白表达及活性分别为0.06、0.07、0.18、0.93,组间差异有统计学意义(P<0.05);处理组一氧化氮含量较其他组增高(P<0.01),菌落计数减少(P<0.01)。结论ICL1对Pm在功能抑制的巨噬细胞内的生长起着重要的作用,正常巨噬细胞产生的活性氮成分能抑制ICL1基因转录及蛋白表达,从而抑制巨噬细胞内Pm的生长。

甘蔗ATP柠檬酸裂解酶基因的克隆与表达分析

ATP柠檬酸裂解酶(ACL)为细胞质中乙酰辅酶A合成途径的关键调控酶,在生物体正常生长发育中有重要作用。本研究通过Race和电子克隆技术获得编码甘蔗ACL蛋白2个亚基的基因SoACLA-1和SoACLB-1,其编码框长度分别为1272bp和1827bp,编码423个和608个氨基酸,推测的氨基酸序列与其他物种具有高度相似性,都优先与禾本科植物聚于同一进化分支。2个基因在ATP-grasp功能域、柠檬酸结合位点、组氨酸磷酸化位点和ATP结合、CoA结合、磷酸化区域等,序列高度保守。实时荧光定量PCR结果表明,2个基因均受外源ABA、水分胁迫、水分胁迫加ABA处理诱导表达,且叶中表达量显著高于根系,其中又以水分胁迫处理下的表达量最高,2个基因表现出协同表达模式。SoACLA-1和SoACLB-1的表达与ABA、ROS含量具有相关性,说明它们可能参与了ABA调控的植物对逆境胁迫反应的代谢过程。

异柠檬酸裂解酶肽类抑制剂的优化筛选

利用噬菌体肽库筛选与计算机模拟分子对接技术,优化异柠檬酸裂解酶肽类抑制剂的筛选.先通过噬菌体肽库筛选出与异柠檬酸裂解酶(ICL)具有高亲和力的结合肽,再利用Discovery Studio 2.1模拟多肽与ICL蛋白晶体(1F8I)的分子对接,最后用Fmoc固相合成法合成多肽,并对其生物活性进行检测.实验结果表明,通过噬菌体肽库筛选得到了29条七肽序列,其中12条可与ICL蛋白晶体成功对接.体外生物活性检测结果显示,得到的12条七肽均对ICL的活性有明显抑制作用(抑制率均超过50%).

BAY11-7082通过抑制三磷酸腺苷柠檬酸裂解酶磷酸化抑制乳腺癌细胞增殖并促进其凋亡

目的探讨核因子κB信号通路抑制剂BAY11-7082通过调控三磷酸腺苷柠檬酸裂解酶(ACL)对MCF-7乳腺癌细胞增殖及凋亡的影响。方法选取对数生长期的MCF-7细胞,随机分为对照组和5μmol/L BAY11-7082处理组、10μmol/L LY294002处理组。采用Western blot法检测BAY11-7082和LY294002处理后MCF-7细胞中ACL、磷酸化的ACL(p-ACL)、磷酸化的Akt(p-Akt)、磷酸化的核因子κB(p-NF-κB)的蛋白水平。采用BAY11-7082和小干扰RNA敲低ACL(si ACL),CCK-8法检测MCF-7细胞的增殖、异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-FITC/PI)双标记结合流式细胞术检测MCF-7细胞的凋亡。结果 BAY11-7082能抑制MCF-7细胞增殖,且呈剂量依赖性。Werstern blot结果显示BAY11-7082处理MCF-7细胞48 h后,p-NF-κB和p-ACL明显下降;LY294002处理组中,p-Akt和p-ACL明显下降。CCK-8实验和流式细胞术检测结果显示,BAY11-7082和si ACL分别处理MCF-7细胞48 h后,细胞增殖减少,细胞凋亡明显增加。结论 BAY11-7082能通过抑制ACL的磷酸化从而抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖并促进其凋亡。

ATP柠檬酸裂解酶表达下调对前列腺癌细胞生长及凋亡影响的研究

目的肿瘤细胞可通过改变代谢模式来支持自身的恶性增殖,前列腺细胞更多地依赖于脂质代谢,而ATP柠檬酸裂解酶(ACLY)在脂质代谢中占有非常重要的位置。文中探讨ACLY表达下调对激素非依赖型人前列腺癌DU145细胞增殖能力及周期分布、凋亡的影响。方法将DU145细胞分为实验组和对照组,实验组使用小干扰RNA片段选择性敲低ACLY的表达,对照组加入无意义小干扰RNA片段,采用细胞增殖与活性检测技术CCK-8观察ACLY分子表达下调对DU145细胞增殖能力的影响,流式细胞仪分析不同处理组间细胞周期分布及凋亡细胞比例之间的的差异,Western blot法检测胞内Caspase-3蛋白含量的变化。结果 Western blot结果显示ACLY干扰效果良好,与对照组相比,实验组细胞内ACLY蛋白含量下降明显(P<0.05)。与对照组相比,实验组细胞内乙酰辅酶A含量、早期凋亡及晚期凋亡细胞所占的比例明显升高[(0.42±1.99)vs(0.79±2.38),(37.10±3.28)vs(6.20±2.88),P<0.05]。在DU145细胞内选择性敲低ACLY的表达含量,实验组较对照组细胞增殖能力减弱,并且随着时间的推移表现更加明显。在48 h及72 h这两个时间点,2组细胞同一时间点吸光度差异均具有统计学意义(P<0.05)。在DU145细胞内干扰ACLY的表达,实验组与对照组相比,G1期细胞所占比例增高,但差异无统计学意义(P>0.05)。G2期细胞占比降低,S期比例增高,细胞周期阻滞在G0/G1期,两组之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。同时实验组细胞内凋亡蛋白Caspase-3的表达明显上调。结论 ACLY对维持前列腺癌细胞恶性增殖具有重要的意义,其表达下调能抑制DU145细胞的分裂增殖并促进细胞的凋亡。

ATP-柠檬酸裂解酶研究进展

文章从亚细胞定位、结构、酶学活性、作用机制、功能等方面介绍了近年来ATP-柠檬酸裂解酶(ACL)的研究进展。ACL酶的结构复杂,不同的生物体中其结构不同;研究发现,随着进化的发生,该酶的两个异源结构有向同源结构方向发展的趋势。ATP-柠檬酸裂解酶在生物体中发挥重要的作用,如:生成胞间乙酰-CoA、作为脂肪酸合成的调控酶、提高植物抗逆性、参与有性生殖的调节等。近年来,对ACL的研究主要集中在酶学活性上,发现其能提高油菜的产油量和抗旱性。今后可对各种作物的ACL功能及开发利用进行深入研究,尤其在提高作物产油量和抗旱性方面应加大研究力度,提高产油作物的产油量、增强作物对干旱环境的抵抗力;此外,利用不断发展的基因组学、蛋白质组学和宏基因组学等现代分子生物学技术和先进、有效的手段,深入发掘ACL的潜在功能,扩大ACL在各个领域的应用。

马尔尼菲青霉菌丝相和酵母相的异柠檬酸裂解酶表达差异的研究

目的比较不同培养条件下马尔尼菲青霉(Pm)菌丝相及酵母相的异柠檬酸裂解酶(ICL)基因转录水平,初步探讨乙醛酸循环在Pm致病中的意义。方法将Pm分为高糖培养的菌丝相(MH)、低糖培养的菌丝相(ML)及高糖培养的酵母相(YH)、低糖培养的酵母相(YL)4组,采用实时定量RT-PCR法比较各组ICL基因转录水平。结果MH、ML、YH、YL组ICL相对表达量分别为1.000、3.000、3.654、69.530,组间差异有统计学意义(P<0.05);温度增高和葡萄糖浓度降低两因素之间具有协同效应。结论Pm酵母相的ICL转录水平较菌丝相增高,而且低糖培养时增高更为显著,提示乙醛酸循环可能在Pm致病过程中起着重要的作用。

肝癌代谢重编程相关基因富集分析及ATP柠檬酸裂解酶表达的临床意义

目的筛选参与肝细胞癌(HCC,简称肝癌)肿瘤进展的代谢重编程相关基因,明确HCC组织标本中ATP柠檬酸裂解酶(ACLY)表达情况,并纳入GEO数据,分析其与HCC临床病理指标的相关性及其在HCC生存预后中的作用。方法下载TCGA数据库中的HCC表达数据,将50对癌组织与癌旁配对组织样本纳入差异表达基因分析,获得全基因表达谱列表;设置差异表达基因纳入标准,获得差异表达基因列表;通过GSEA、GO及KEGG三种富集方法筛选获得共同的HCC代谢重编程相关基因。采用qRT-PCR检测ACLY在临床组织标本中的表达情况。下载GSE14520数据集并将隶属GPL3921平台的221例生存数据完整的基因芯片表达数据和临床数据纳入研究,通过生存分析、Cox回归分析和临床相关性研究明确ACLY与HCC预后的关系。结果通过基因富集分析筛选获得26个HCC代谢重编程相关基因。临床标本检测显示ACLY在癌组织中的表达显著高于癌旁组织(P<0.05)。相关性分析表明ACLY表达与TNM分期、CLIP分期和AFP相关(P<0.05);生存分析显示ACLY的表达与HCC总体生存率相关(P<0.05),并与HCC无复发生存有相关性趋势(P=0.05)。Cox回归分析表明ACLY的表达水平与HCC总体生存和术后无复发生存率相关(P<0.05)。结论本研究获得了26个HCC代谢重编程相关基因,其中ACLY的异常表达与HCC分期显著相关;ACLY的表达水平与HCC预后显著相关,是HCC总体生存的独立风险因素。

结核杆菌H_(37)Rv异柠檬酸裂解酶基因的克隆及表达

目的 构建在大肠杆菌中高效表达结核杆菌H37Rv异柠檬酸裂解酶(ICL)的重组质粒,实现ICL在原核表达系统的高效稳定表达。方法 采用PCR和克隆技术构建含有结核杆菌H37TRy ICL基因的表达质粒pET30(a)-Rv0467,转化至E.coli BL21(DE3)中诱导表达。目的蛋白经金属螯合层析纯化后,对其活性进行初步研究。结果 构建了高效表达结核杆菌H37Rv ICL的质粒;在E.coli BL21(DE3)中得到高效表达,目的蛋白占总蛋白含量的30％;表达产物以可溶性形式存在,通过金属螯合层析纯化,所得酶的纯度为90％;目的蛋白具有ICL的活性。结论 利用原核表达系统成功克隆表达了结核杆菌H37Rv的ICL,为以ICL为靶点建立新型抗结核药物奠定了基础。

从ATP-柠檬酸裂解酶调节糖脂代谢看中药异病同治物质基础

目的:异病同治是中医临床用药特色之一。本研究从调节糖脂代谢的关键酶———ATP-柠檬酸裂解酶(ACL)入手,探讨糖脂代谢紊乱的共同病理环节及中药作用机理,阐释中医学防治代谢性疾病时异病同治、同药的学术精粹,丰富中药治疗理论。方法:分组测定高甘油三酯血症模型动物血清甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)、血清柠檬酸含量及活性变化,发现高血糖高甘油三酯代谢紊乱异病同治的药理学基础。结果:高血糖高甘油三酯血症代谢紊乱动物模型血清及肝脏ACL活性显著升高,中药菊苣可显著降低ACL活性,从而达到调节血糖、甘油三酯的作用。结论:不同的代谢性疾病彼此可相互影响,有着共同的病理环节。同一种中药可通过干预这些共同的病理过程而治疗不同的疾病。通过研究确立糖脂代谢紊乱的病理基础及异病同治的物质基础,寻找中药防治代谢紊乱的共同性与特异性规律,阐述中药对多种代谢紊乱的综合调节优势。

马尔尼菲青霉异柠檬酸裂解酶的表达与其酵母相生长的关系

目的通过研究马尔尼菲青霉(PM)异柠檬酸裂解酶(ICL)基因转录水平与其酵母相生长的关系,初步探讨乙醛酸循环在PM致病中的意义。方法将PM分生孢子分别接种于中性培养基以及产生不同浓度一氧化氮的酸性培养基中,37℃培养72 h,采用实时定量RT-PCR法检测各组PM的ICL基因转录水平,检测340 nm吸光度评估PM的生长情况。结果不产一氧化氮的酸性培养基中PM较中性培养基中PM的ICL转录水平高(P<0.01),含菌量多(P<0.01);产一氧化氮的酸性培养基中PM的ICL转录水平降低(P<0.01),含菌量减少(P<0.01),且随一氧化氮浓度升高,下降趋势更明显,组间差异有显著性(P<0.01);ICL转录水平与生长之间呈正相关(相关系数r=0.99,P<0.01)。结论适当的酸性环境促进PM的ICL转录,利于PM的生长;一氧化氮明显抑制ICL转录,抑制PM的生长;乙醛酸循环可能在PM致病过程中起着重要的作用。

结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶基因的克隆表达及鉴定

最近,Okada M等人报道,全世界每年因结核病死亡人数超过200万,新发病例超过880万。据WHO统计,全球80%的肺结核病例发生在中国、菲律宾等22个西太平洋国家。中国是世界第二大结核最近，OkadaM等人111报道，全世界每年因结核病死亡人数超过200万，新发病例超过880万。

异柠檬酸裂解酶抑制剂对L-谷氨酸合成的影响

[目的]研究琥珀酸和苹果酸对L-谷氨酸合成的影响。[方法]以谷氨酸棒杆菌的典型菌株Corynebacterium glutamicumATCC13032为供试菌株,研究琥珀酸和苹果酸对细胞生长、L-谷氨酸的合成、发酵液中的残糖量以及细胞中异柠檬酸裂解酶活性的影响。[结果]琥珀酸对异柠檬酸裂解酶的活性具有部分抑制作用。在0～5.0 g/L范围内,琥珀酸的添加提高了L-谷氨酸发酵的糖酸转化率,细胞生长和L-谷氨酸分泌受到抑制,残糖量增大。苹果酸的添加降低了异柠檬酸裂解酶的活性和L-谷氨酸的产量,残糖量和细胞生长没有明显的规律性变化。同时添加琥珀酸和苹果酸各2.0 g/L时,异柠檬酸裂解酶的活性和细胞生长都有所下降,L-谷氨酸的产量和残糖量没有明显变化。[结论]添加琥珀酸增加了L-谷氨酸的产量,添加苹果酸则降低了L-谷氨酸的产量。

重组结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶表达特性的研究

目的通过对所构建的重组结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶表达特性的研究,获取最佳可溶性表达。方法以IPTG诱导重组质粒pET28a(+)-icl和pET28a(+)-aceA在大肠杆菌BL21(DE3)和BL21(DE3)plysS细胞表达,筛选最佳诱导浓度、时间和温度。结果以0.25mmol/L和0.1mmol/L的IPTG在25℃诱导8h和6h后可溶性重组ICL蛋白和AceA蛋白的最高含量。结论本研究构建的结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶重组表达质粒,可获得可溶性表达蛋白,为抗结核药物的筛选奠定了基础。