金花茶查尔酮异构酶基因全长克隆与表达的初步研究

利用RT-PCR和RACE技术,从我国珍稀濒危植物金花茶花瓣中获得了查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)基因的cDNA全长,命名为Cn-CHI,GenBank登录号HQ269805.1。碱基序列分析表明,Cn-CHI基因全长953bp,包含56 bp的5’非翻译区、204 bp的3’非翻译区和一个长为693 bp编码230个氨基酸的开放阅读框。氨基酸序列比对分析表明,Cn-CHI基因编码蛋白与蔷薇科、杜鹃花科、茄科等植物的CHI蛋白同源性都在75%以上,与山茶科山茶属茶树CHI蛋白同源性高达99%。相对荧光定量PCR分析表明,Cn-CHI基因在金花茶花蕾发育过程中呈现先急剧上升后平缓下降的趋势;在花器官的不同部位中,Cn-CHI基因表达量最高的是雌蕊,其次是雄蕊,在萼片和花瓣中的表达量较低且相差不大。

大花美人蕉查尔酮异构酶基因的cDNA克隆和序列分析

以高等植物查尔酮异构酶(CHI)基因的保守区域GKFVKFT、KFTAIGV、AVKWKGK及GPFEKFT、IIGKHGV设计简并引物和采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)以及温度非对称交互PCR(TAIL-PCR)方法,从大花美人蕉花瓣组织中扩增查尔酮异构酶基因(CHI)的全长cDNA(678bp),编码226个氨基酸,其氨基酸组成与其它已知的高等植物CHI基因具有很高的同源性,与葡萄、草莓、丁香、柑桔、矮牵牛、洋葱及玉米的同源性分别为82%、79%、80%、80%、79%、81%和76%。

大豆查尔酮异构酶基因的克隆及乳酸菌表达载体的构建(英文)

[目的]将特异存在于豆科植物的II型查尔酮异构酶基因CHI1A构建到目前最有效的食品级乳酸乳球菌NICE诱导表达系统中。[方法]利用RT-PCR技术从大豆总RNA中克隆CHI1A基因,连入pMD18-T克隆载体中并进行测序,然后重组到乳酸乳球菌表达载体PNZ8149-CHI1A,利用电穿孔方法转入乳酸乳球菌NZ3900中。[结果]克隆得到CHI1A完整开放阅读框670bp,与已报逍的大豆查尔酮异构酶基因的核苷酸序列(GenBank AY595413)的同源性达到99%;通过PCR和酶切鉴定,成功地将CHI1A导入到NICE表达系统中。[结论]含有CHI1A基因的乳酸乳球菌高效诱导表达载体的构建为利用微生物发酵产生类黄酮奠定基础。

大豆查尔酮异构酶基因的克隆及粟酒裂殖酵母表达载体的构建

利用RT-PCR克隆Ⅱ型大豆查尔酮异构酶基因(CHI1A),然后将目的片段与克隆载体pMD18-T质粒相连接,检测后将目的基因重组于粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2的MCS序列之中,使用电击法将重组质粒转化进入粟酒裂殖酵母中,用PCR和双酶切的方法来检测试验结果,表明获得了CHI1A完整开放阅读框(670bp),与已报道序列(NO:AY595413)的同源性达到99%。PCR和酶切鉴定表明,CHI1A已导入到酵母表达载体中。查尔酮异构酶基因的克隆、粟酒裂殖酵母表达载体的构建,为该基因的应用提供了依据。有望利用基因工程技术将该基因重组于酵母基因组中并表达目的蛋白,以此来催化合成黄酮和异黄酮类化合物。

大豆查尔酮异构酶基因的克隆及乳酸菌表达载体的构建

[目的]将特异存在于豆科植物的II型查尔酮异构酶基因CHI1A构建到目前最有效的食品级乳酸乳球菌NICE诱导表达系统中。[方法]利用RT-PCR技术从大豆总RNA中克隆CHI1A基因,连入pMD18-T克隆载体中并进行测序,然后重组到乳酸乳球菌表达载体PNZ8149-CHI1A,利用电穿孔方法转入乳酸乳球菌NZ3900中。[结果]克隆得到CHI1A完整开放阅读框670bp,与已报导序列(GenBankAY595413)的同源性达到99%;通过PCR和酶切鉴定,成功地将CHI1A导入到NICE表达系统中。[结论]含有CHI1A基因的乳酸乳球菌高效诱导表达载体的构建为利用微生物发酵产生类黄酮奠定基础。

芍药查尔酮异构酶基因CHI的表达特性分析

为了揭示查尔酮异构酶基因(chalcone isomerase gene,CHI)在芍药花瓣中的表达规律与特点,以不同芍药托桂型品种(‘金辉’‘彤云金焰’‘红楼锦菊’)4个不同发育时期(花蕾期、初开期、盛开期、衰败期)中的内、外花瓣为对象,用qPCR分别检测CHI基因的表达水平,分析其在不同芍药品种、不同发育时期以及内外花瓣之间的表达差异。结果显示:不同发育时期同一品种芍药花瓣组织CHI基因的表达量存在一定差异,从花蕾期到衰败期整体表现为上升趋势;不同品种同一发育时期‘彤云金焰’花瓣组织(内瓣和外瓣)CHI基因的表达水平明显高于‘金辉’和‘红楼锦菊’的;同一芍药品种在相同发育时期内瓣组织的CHI基因表达量均明显高于外瓣组织的。鉴于不同芍药品种、不同发育时期内外花瓣间颜色存在差异,推测CHI基因表达量可能与芍药花瓣颜色的形成有关。该结果可为深入研究芍药CHI功能并开展芍药花色遗传改良分子育种研究提供技术支撑。

花生查尔酮异构酶基因的克隆及其序列分析

利用RT-PCR及RACE技术从花生种子中克隆得到查尔酮异构酶基因(chi)的cDNA全长序列,命名为Ahchi,NCBI登录号:JN412735,该序列全长共1 061 bp,编码209个氨基酸,其氨基酸组成与其它已知的高等植物具有很高的同源性,与大豆、倒捻子、蓖麻、毛果杨的同源性分别为81%、71%、70%和69%,且含有高度保守的活性位点。

黄芩查尔酮异构酶基因的全长cDNA克隆及生物信息学分析

目的:从黄芩叶片克隆全长查尔酮异构酶基因chi并进行功能鉴定。方法:从黄芩叶片mRNA中RT-PCR获得全长chi基因并进行生物信息学分析。结果:克隆的chi基因全长648 bp,含有完整chi基因的开放阅读框,拟编码215个氨基酸,具有查尔酮异构酶催化特有的结构域PLN02559,属于查尔酮_3超家族。构建表达载体pET-32a(+)-chi,在IPTG诱导下在大肠杆菌中表达出一个30.0 kDa的融合蛋白。结论:分析表明,黄芩叶片chi与从黄芩组培毛状根、愈伤组织的chi基因序列几乎完全相同,预示黄芩叶片可替代野生黄芩根用药,为野生黄芩资源的可持续利用提供理论依据。

紫丁香查尔酮异构酶基因SoCHI的克隆及表达分析

采用RACE技术从紫丁香(Syringa oblata Lindl.)花中克隆获得查尔酮异构酶基因(CHI)的cDNA全长序列,命名为SoCHI,其编码的蛋白质为SoCHI蛋白。序列分析结果表明:SoCHI基因的开放阅读框(ORF)长度为684bp,编码227个氨基酸残基,并且,该基因全部由外显子构成,无内含子。SoCHI蛋白理论相对分子质量24 988,理论等电点p I 5.53,不稳定系数为47.58,平均亲水指数为-0.096,并包含2个氢键结合位点、2个活性催化位点和7个底物结合位点;在该蛋白质的二级结构中,α-螺旋、延伸链和无规则卷曲分别占该蛋白质氨基酸残基总数的31.7%、20.3%和48.0%。同源性比对结果表明:紫丁香与其他9种植物CHI蛋白的同源性很高(均在76%以上),与同科[木犀科(Oleaceae)]植物桂花(Osmanthus fragrans Lour.)和油橄榄(Olea europaea Linn.)CHI蛋白的同源性更高(达88%)。实时荧光定量PCR扩增结果表明:SoCHI基因的相对表达量在紫丁香的嫩叶中最高,在成熟叶中次之;该基因的相对表达量在紫丁香花发育过程中先上升后下降,并在花蕾期达到最高。研究结果显示:SoCHI基因编码的氨基酸序列相对保守,且其表达与紫丁香花呈色关系密切。

红花查尔酮异构酶基因的克隆及表达分析

实验通过下载已报道查尔酮异构酶基因序列,设计简并引物,利用RACE克隆红花查尔酮异构酶基因全长,克隆了两个红花查尔酮异构酶基因,分别命名为CtCHI1和CtCHI2,NCBI登录号分别为MF996507和MF996508。用在线软件对序列进行分析,并用MEGA进行进化树分析,CtCHI1全长967 bp,CtCHI2全长997bp,属查尔酮异构酶家族基因。定量PCR分析红花查尔酮异构酶基因表达得出,CtCHI1在花中且在时期2表达量较高,而在叶、茎及根中不表达,CtCHI2仅在茎中有少量表达。实验还发现,MeJA显著促进CtCHI1基因的表达,而对CtCHI2无调控作用,推测CtCHI1参与红花花中类黄酮的生物合成。实验成功克隆了两个查尔酮异构酶基因并对其进行表达分析,为红花类黄酮的生物合成及调控机理研究奠定基础。

烟草查尔酮异构酶基因2(NtCHI2)功能分析

烟草查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)是黄酮类代谢的一个关键酶,烟草中有两个基因拷贝(NtCHI1、NtCHI2),相关研究多集中在NtCHI1基因,对NtCHI2的研究较少。为研究烟草NtCHI2的功能,主要以NtCHI2的过表达和干扰植株叶片为材料,进行了实时定量PCR和CHI活性分析以及芸香苷含量检测,同时进行了NtCHI2体外表达蛋白的酶活分析。结果表明:NtCHI2体外表达蛋白具有查尔酮异构酶活性;过表达株系中NtCHI2的表达量升高5~75倍,但CHI酶活性和芸香苷含量基本没有变化;干扰株系中NtCHI2的表达量降至70%,CHI酶活性和芸香苷含量分别降低50%和90%。烟草NtCHI2参与芸香苷的合成代谢调控,在一定程度上NtCHI2基因的表达量和芸香苷的含量正相关。

OjCHI真核表达载体的构建及农杆菌的遗传转化

查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)是类黄酮生物合成途径中的第二个关键酶,在类黄酮合成与积累过程中发挥着至关重要的作用。笔者以日本蛇根草为材料,在克隆获得其CHI基因(OjCHI)的基础上,将该基因插入由35S启动子控制的真核表达载体pBI121,完成重组表达质粒pBI121-OjCHI的构建,同时利用冻融法将重组质粒成功转入农杆菌GV3101。该实验的完成可为下一步通过转基因技术研究该基因的功能奠定基础。