大豆查尔酮还原酶基因CHR1的功能研究

为了验证查尔酮还原酶基因CHR1在大豆苷元合成中的作用,文章克隆了CHR1基因并构建了RNA干扰表达载体pCPB-CHR1-RNAi,将载体转化受体大豆品种"吉农28"中,以期抑制CHR1基因的转录。通过农杆菌介导的遗传转化和PCR检测得到4株T0代阳性植株,13株T1代阳性植株。Southern blotting结果表明,功能元件以单拷贝的形式整合到大豆的基因组中。利用实时荧光定量PCR法(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)测定CHR1基因在mRNA水平上的表达量,结果表明,转基因大豆植株中CHR1的表达量与未转化的受体大豆相比降低了60%～99%;高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)检测到合成大豆苷元过程中的前体物质异甘草素的含量降低了38.7%。该RNA干扰机制在转录水平上抑制了CHR1基因的表达。

大豆查尔酮还原酶基因(Gmchr4)的克隆与功能鉴定

大豆查尔酮还原酶(chalcone reductase,CHR)是大豆苷元合成途径中必需的关键酶之一。在大豆基因组中分离到新的查尔酮还原酶基因Gmchr4,克隆基因cDNA片段长度为1 410bp(Gen Bank登录号:KF938604),含开发阅读框966bp,分析了Gmchr4在大豆基因组的进化关系。通过实时荧光定量PCR技术(Q-PCR)和高效液相色谱技术(HPLC)分析了基因的表达水平和催化产物异甘草素的含量。实验结果证明得到一种新的大豆查尔酮还原酶蛋白基因,为深入探索大豆苷元等异黄酮类化合物的生物合成途径,尤其是相关基因间的表达调控提供了参考。

大豆查尔酮还原酶1基因的克隆及转化

【目的】克隆大豆查尔酮还原酶1(CHR1)基因,以构建的过表达载体pCAMBIA3301-CHR1转化大豆,获得含有CHR1基因的阳性植株,为研究该基因的功能奠定基础。【方法】以大豆基因组DNA为模板,通过PCR扩增克隆CHR1基因,构建植物过表达载体pCAMBIA3301-CHR1,对其进行PCR及双酶切鉴定。采用农杆菌介导法将该载体转入大豆"吉农28"中,对转基因植株进行PCR、Southern杂交检测,对CHR1基因mRNA相对表达量进行荧光定量PCR检测。【结果】克隆得到的CHR1基因大小为1 100bp。成功构建了植物过表达载体pCAMBIA3301-CHR1,将其转化大豆后,通过PCR检测获得T1代转基因大豆植株12株;Southern杂交检测结果显示,CHR1基因以单拷贝形式整合入大豆基因组中;荧光定量PCR检测结果显示,转基因植株的CHR1mRNA相对表达量高于非转基因大豆植株。【结论】成功构建了过表达载体pCAMBIA3301-CHR1,并获得了CHR1基因表达量高的转基因大豆。

大豆查尔酮还原酶基因GmCHR的克隆与植物表达载体构建

黄酮类化合物在植物中参与过滤紫外线、固氮和花色形成等过程,异黄酮对人体有抗氧化、预防乳腺癌等保健作用。查尔酮还原酶(chalcone reductase,CHR)是植物中参与黄酮类化合物代谢的重要酶。克隆大豆查尔酮还原酶基因并构建植物表达载体,有助于进一步研究其功能和异黄酮的代谢过程。采用RT-PCR方法,从栽培大豆(Gly-cine max)南农1138-2中,克隆得到了第14号染色体上的一个编码大豆查尔酮还原酶(chalcone reductase,CHR)的基因,命名为GmCHR。该基因含有948 bp长的编码区序列(Coding DNA Sequence,CDS),编码315个氨基酸。预测其蛋白质分子量为35.5 kDa,等电点为6.32。与其他豆科植物中的查尔酮还原酶相比,GmCHR蛋白序列与葛藤(Puerari-ae montana)CHR的相似性最高,达94%。组织表达分析表明,在自然生长条件下GmCHR在叶中的表达量最大;其次是种子;在花和茎中相同;在根中的表达量最小。利用Gateway方法获得植物过表达载体pMDC83-GmCHR,经检测表明过表达载体已成功转化农杆菌EHA105,为今后进一步了解GmCHR在大豆异黄酮代谢过程中的功能提供材料基础。

大豆查尔酮还原酶3基因(chr3)的克隆及体外催化活性分析

【目的】克隆大豆查尔酮还原酶3基因(chr3),并分析其编码蛋白体外催化活性,为研究大豆苷元的合成与调控研究提供参考。【方法】以大豆品种"吉农17"为材料,采用RACE技术扩增大豆chr3基因,对其编码蛋白的结构和功能位点进行分析。将目的基因chr3连接到大肠杆菌载体pET28a上,然后转化到大肠杆菌BL21中,构建重组大肠杆菌原核表达载体BL21-pET28a-chr3,并通过高效液相色谱技术(HPLC)验证重组蛋白的催化性质及效率。【结果】成功克隆chr3基因,其全长序列长1 416bp(GenBank登录号:KF927169),成功构建了大肠杆菌原核表达载体BL21-pET28a-chr3。HPLC检测结果表明,重组蛋白CHR3催化合成了异甘草素,使大豆异甘草素含量提高到了33.673μmol/g。【结论】分离鉴定了大豆chr3,其编码蛋白CHR3催化活性明显提高。

膜荚黄芪查尔酮还原酶基因的克隆与表达分析

从膜荚黄芪中克隆了CHR基因,GenBank登陆号为KY086286(AmCHR),AmCHR全长cDNA为1 173 bp,开放阅读框为957 bp,编码318个氨基酸,其分子量为35.58 kDa,等电点为6.26。生物信息学分析表明AmCHR蛋白与豆科植物CHR同源,无信号肽,定位于细胞质。实时荧光定量PCR和高效液相色谱分析结果显示AmCHR在根、茎、叶中的表达水平与毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量变化一致。该研究从膜荚黄芪中克隆了1个新的AmCHR基因,推测AmCHR的表达与膜荚黄芪毛蕊异黄酮葡萄糖苷的积累密切相关。

大豆查尔酮还原酶GmCHR基因的克隆及其在烟草中的表达

以大豆品种"吉农28"为材料,利用RT-PCR技术获得GmCHR基因序列,并选择其中918 bp的开放阅读框,以pBI121为基础载体,构建了由35S启动子驱动的GmCHR植物表达载体,转入烟草中并对17株抗卡那霉素的转基因烟草进行PCR、GUS染色、Southern杂交检测,对植株中GmCHR基因mRNA表达量进行荧光定量PCR检测,采用高效液相色谱技术测定转基因植株中查尔酮还原酶催化产物异甘草素的含量。结果表明:GmCHR基因成功整合到烟草基因组中并能够成功表达;在转基因植株中目的基因的mRNA均有表达,且不同植株间表达量存在差异;转化烟草叶部组织中异甘草素的平均含量为(7.528±0.018)μmol/g,而转空载体烟草中未检测出异甘草素。

大豆CHR2-1基因生物信息学分析与大豆遗传转化

大豆异黄酮是有助于人类身体健康的一类次级代谢产物,大豆查尔酮还原酶(chalcone reductase, CHR)基因是控制大豆异黄酮主要组分大豆苷元生物合成的关键酶之一。为拓宽大豆CHR研究范围,促进异黄酮代谢机理研究,进而推进大豆品种改良,本研究利用基因工程技术对大豆CHR2-1基因进行克隆及生物信息学分析,并且构建植物表达载体pCAMBIA3301-CHR2-1,通过农杆菌介导法将目的基因整合到东农50受体大豆基因组中,PCR筛选鉴定获得大豆转化植株。结果表明:GmCHR2-1基因编码的蛋白属于非分泌型蛋白,可能在细胞质中发挥主要功能,属于非跨膜类蛋白并不在细胞中发生迁移;该蛋白存在22个潜在磷酸化位点,其中苏氨酸(Thr)4个、丝氨酸(Ser)18个;该蛋白由α-螺旋(40.63%)、延伸链(14.29%)、β-转角(4.13%)和无规则卷曲(40.95%)4个部分组成。PCR鉴定表明,转化植株基因组包含草丁膦抗性基因Bar、终止子NOS和启动子35S位点,初步确定已将GmCHR2-1转入到东农50大豆品种基因组中,并获得T;阳性植株转化苗12株。