小麦ent-柯巴基焦磷酸合酶基因TaCPS1的克隆与荧光定量分析

ent-柯巴基焦磷酸合酶(ent-copalyl diphosphate synthase,CPS)是植保素合成途径中的关键酶。本研究利用mRNA差异显示技术,从小偃麦异附加系种质SN6306中得到一个与抗白粉病相关的Ta CPS1基因。该基因ORF长2 394 bp,编码797个氨基酸。对其进行生物信息学分析表明,该序列推导的蛋白无信号肽,主要由亲水性氨基酸组成,可能存在于细胞质中;其具有类异戊二烯合成酶超家族的保守结构域。荧光定量分析结果表明,SN6306中的Ta CPS1基因在白粉病菌E09诱导处理72 h时,表达量上调了大约45倍,但感病亲本烟农15(YN15)基本不受诱导。在茉莉酸甲酯诱导下,Ta CPS1基因表达量升高将近15倍;在水杨酸诱导下,Ta CPS1基因表达量升高将近2.4倍。推测Ta CPS1基因可能参与小麦抗白粉病机制中的水杨酸和茉莉酸激素调节途径。

丹参柯巴基焦磷酸合酶基因的优化表达、纯化及抗体制备

用含丹参柯巴基焦磷酸合酶(Salvia miltiorrhizacopalyl diphosphate synthase,SmCPS)基因的重组质粒pET32CPS转化大肠杆菌BL21trxB(DE3)进行诱导表达,SDS-PAGE结果表明SmCPS基因在大肠杆菌中获得了表达;对影响可溶性表达的4个因素,即诱导温度、IPTG诱导浓度、诱导时宿主菌的密度(A600)和诱导时间进行了优化。结果发现在宿主菌A600达到1.0时加入0.4 mmol.L-1IPTG,在20℃诱导培养8 h表达的可溶性蛋白量最高,约占细胞总蛋白的35.6%。用Ni2+亲和色谱法纯化表达产物,纯化蛋白产率达到12.3 mg.L-1。将纯化蛋白免疫制备兔源SmCPS抗血清,ELISA测定效价为1∶24 300,且经Western blotting鉴定该抗体可特异性识别SmCPS抗原,获得了效价高、免疫反应性好的SmCPS多克隆抗体,为进一步从蛋白水平研究SmCPS表达与丹参酮类有效成分生物合成相关性提供了物质基础。

赤霉素生物合成酶基因GhCPS和GhKS参与甲哌鎓对棉花幼苗叶片生长的控制

室内盆栽欣抗4,在棉花幼苗第3片真叶完全展平时（第4叶未展开）鎓叶面喷施甲哌（DPC）,研究DPC对棉花幼苗叶片生长的控制与赤霉素（GA）合成早期关键酶柯巴基焦磷酸合酶（CPS）和内根-贝壳杉烯合酶（KS）基因表达的关系。结果表明, DPC处理显著减小棉花幼苗第3和第4叶的叶面积,第4叶叶面积受控制程度较第3叶大；80 mg L＾-1 DPC处理的棉花幼苗第3和第4叶中GA4含量分别于处理后4 d和4～6 d显著低于对照；与对照相比,80 mg L＾-1 DPC处理的棉花幼苗第3叶中GhCPS和GhKS表达在处理后1～4 d显著降低,而第4叶中GhCPS和GhKS的表达在处理后1～6 d显著降低。由此可见, DPC通过影响GhCPS和GhKS的表达,降低内源活性GA4的含量,控制棉花幼苗叶片生长,且较幼嫩叶片对DPC较敏感。

病毒诱导基因沉默鉴定穿心莲内酯生物合成关键酶ApCPS功能

该研究采用病毒诱导基因沉默技术(VIGS),以生长到第8片真叶期的穿心莲植株为实验材料,沉默参与穿心莲内酯生物合成的ent-柯巴基焦磷酸合酶基因(ApCPS),用半定量和荧光定量PCR检测病毒诱导沉默后ApCPS及其上游基因的表达,用HPLC法检测ApCPS沉默后穿心莲内酯的积累变化,同时检测茉莉酸甲酯(MeJA)处理后ApCPS及上游基因的表达,以全面分析穿心莲内酯代谢以及ApCPS在穿心莲内酯生物合成中的作用机制,验证其在植物体内的功能。结果显示:(1)ApCPS基因被成功沉默,基因表达显著下调,进而引起上游牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因(GGPS)的表达下调,而3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(HMGR)和1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因(DXS)的表达未受影响。(2)ApCPS基因沉默15d后穿心莲内酯积累量显著下降,表明ApCPS是穿心莲内酯生物合成关键酶基因,且能够负反馈影响上游基因表达。(3)茉莉酸甲酯(MeJA)显著诱导ApCPS及上游基因HMGR、DXS和GGPS的表达,表明穿心莲内酯生物合成基因受到MeJA的广泛调控。该研究首次使用VIGS证明ApCPS参与到穿心莲内酯生物合成,为利用该技术鉴定穿心莲内酯生物合成途径中其他基因功能奠定了基础。

苹果MdCPS基因的克隆、定位及其在柱型/普通型间的表达差异分析

为研究赤霉素合成途径关键酶基因,了解果树的矮化机理。以苹果品种富士当年生新梢的茎尖为试材,以苹果基因组数据库为依据,克隆了编码苹果CPS的基因Md CPS（Gen Ban K登录号：KC433942.1）。该基因g DNA序列含有15个外显子和14个内含子,其编码序列（Coding sequence,CDS）长度为2 400 bp,共编码799个氨基酸。在已发表的金冠苹果基因组中,与该基因相对应的转录本是MDP0000147908,它的定位区间为chr11：32433834-32439214。同源性分析表明,Md CPS与其他植物的CPS间有较高的相似性（49%-67%）。以杂交组合富士（普通型）×舞姿（柱型）的亲本品种及F1后代当年生新梢的茎尖组织为试材,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析表明,尽管该基因在柱型亲本中的表达水平显著低于普通型亲本,但在其后代的柱型与普通型群体间差异并不明显。同时,在柱型杂种及其普通型突变体间的分析结果也表明,Md CPS的表达水平与柱型性状没有明显的相关性。可见,柱型苹果茎尖组织中活性赤霉素含量偏低受其合成早期步骤关键酶基因Md CPS的影响不大。

棉花基因组数据库中CPS&KS基因的查找与分析

为了探究赤霉素合成关键酶CPS&KS类基因在棉花中的分布情况,分析了已发表的拟南芥CPS&KS基因编码的蛋白质氨基酸序列,发现该类基因存在2个保守结构域,Terpene_synth和Terpene_synth_C,其在Pfam数据库中的种子文件分别为PF01397和PF03936。利用软件HMMER中的Hmmsearch程序在雷蒙德氏棉蛋白质数据库中调取72条序列,通过与拟南芥中的CPS&KS基因序列进行比对,最终在雷蒙德氏棉基因组中筛选到5个CPS&KS候选基因,这5个基因与四倍体棉花TM-1基因组At和Dt亚组的10个基因具有同源关系。通过对赤霉素敏感的棉花超矮杆突变体赤霉素处理前后转录组数据库分析比对,最终确定2个KS候选基因在转录组中表现为上调作用。

丹参柯巴基焦磷酸合酶的生物信息学分析

目的分析丹参柯巴基焦磷酸合酶(CPS)的氨基酸序列特征,并与其他植物进行比较,为丹参CPS蛋白的后续研究提供有利参考。方法利用生物信息学方法,以丹参为主,对13科16种植物的18条CPS蛋白序列进行了序列组成、生化特性、导肽、信号肽、跨膜结构域、疏水性/亲水性、蛋白质二级、三级结构及功能域等预测分析,并进行了丹参CPS蛋白序列与其他植物的同源比对以及系统进化树构建。结果 CPS蛋白氨基酸残基数集中在730以上;相对分子质量91 610左右;平均理论等电点5.87,提示CPS为酸性蛋白。序列结构预测结果显示,CPS蛋白具有明显的疏水区和亲水区,不存在信号肽,不具有跨膜结构域,可能有叶绿体转运肽。蛋白质二级结构中最主要的结构元件是α-螺旋和无规则卷曲。蛋白同源性比对结果显示,丹参CPS与同科植物迷迭香和玄参科植物野甘草的同源性最高。结论对丹参等植物的CPS蛋白进行了详细的生物信息学分析,可为今后深入研究该酶的结构特征和功能提供参考。

毛萼香茶菜二萜合酶IeCPS的立体特异性研究

对映-贝壳杉烷型二萜是药用植物香茶菜抗菌抗肿瘤的核心组分,其生物合成的酶分子机制尚未完全明了。前期我们克隆并鉴定了毛萼香茶菜二萜合酶柯巴基焦磷酸合酶基因Ie CPS1和Ie CPS2。本文通过与拟南芥对映-贝壳杉烯二萜合酶At KS配对进行偶联反应,以及GC-MS鉴定酶联反应产物,证实毛萼香茶菜二萜合酶Ie CPS1和Ie CPS2的立体特异性为对映型(ent-CPS)。

丹参SmCPS1基因启动子区甲基化特征分析及其与SmCPS1组织差异性表达的关系

目的：分析不同组织中丹参（Salvia miltiorrhiza）柯巴基焦磷酸合酶1基因（SmCPS1）启动子区甲基化分布特征及其与SmCPS1组织差异性表达的关系。方法：采用重亚硫酸盐转化法检测不同组织中SmCPS1启动子区-1 021 bp（转录起始位点＋1）内的甲基化率;实时荧光定量聚合酶链式反应Real-time PCR检测不同组织中SmCPS1表达量。结果：SmCPS1启动子区甲基化主要集中在转录起始位点上游-750～-500 bp,-450 bp以内的启动子区几乎无甲基化。300个甲基化检测位点中,组织差异性甲基化位点共72个,占总检测甲基化位点数的24%;发生甲基化的转录因子结合区域共18个,其中有10个区域的甲基化存在组织差异。与SmCPS1表达量显著相关（P〈0.01）者21个,其中7个负相关者集中在-632～-450 bp,14个正相关者分布在-632 bp之外及-450 bp以内的启动子区。结论：SmCPS1启动子区甲基化差异可能是影响其组织差异性表达的原因。

不同生长期穿心莲活性成分及关键酶基因差异表达研究

目的对主产地广东遂溪、福建漳浦及引种栽培地区江苏南京、淮安的不同生长期穿心莲Andrographis paniculata活性成分及关键酶基因表达情况进行分析,研究穿心莲活性成分积累动态,探讨其最佳采收期及分子机制。方法用HPLC法测定穿心莲内酯及脱水穿心莲内酯量,并用实时荧光定量PCR技术从m RNA水平比较研究不同生长期穿心莲关键酶ent-柯巴基焦磷酸合酶(CPS)基因的表达情况。结果不同产地穿心莲生长过程基本一致,在营养生长时期生长迅速,进入生殖生长后生长趋于平缓。4个产地穿心莲样品中活性成分变化趋势相近,穿心莲内酯量均在始花期达到最高,脱水穿心莲内酯量变化较平缓;穿心莲CPS基因的相对表达量在蕾期至始花期相对较高,与穿心莲内酯量呈显著正相关。4个产地穿心莲的穿心莲内酯与脱水穿心莲内酯之和均达到《中国药典》2010年版标准。结论穿心莲最佳采收期应以物候期为评判依据,其最佳采收期为始花期。