21号染色体特异性柯斯质粒DNA克隆区域定位

为提高检测２１号染色体数目和结构异常的精确性，应用ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－１１－ｄＵＴＰ通过缺口平移法标记Ｄ１３Ｚ１／Ｄ２１Ｚ１和６个柯斯质粒（Ｃｏｓｍｉｄ）ＤＮＡ克隆，将标记后的Ｄ１３Ｚ１／Ｄ２１Ｚ１和６个柯斯质粒ＤＮＡ克隆双探针与正常二倍体细胞系染色体进行荧光原位杂交（ＦＩＳＨ），结合Ｑ显带方法将６个柯斯质粒ＤＮＡ克隆定位于２１ｑ２２；用柯斯质粒ＤＮＡ克隆探针与两个已知的平衡易位细胞系ＧＭ９５４２和８３２７Ｌ的染色体进行荧光原位杂交，检测并分析杂交信号在两个平衡易位细胞系染色体上的分布，结果表明柯斯质粒ＤＮＡ克隆精确定位于２１ｑ２２．２，６个柯斯质粒ＤＮＡ克隆定位结果一致。

堆肥宏基因组柯斯质粒文库的构建和DNA提取技术的改进

堆肥环境中高浓度腐殖酸的存在阻碍了对这个环境中的未培养微生物的宏基因组研究。我们提出了一个确实可行的提取堆肥环境DNA的方法,这个方法通过使用Sephadex G200+酸洗PVPP层析柱与电洗脱两步纯化的方法成功地纯化堆肥环境来源的DNA,用提取的DNA成功构建了一个包含约10万个克隆的柯斯质粒文库。从这个文库中筛选到一个新的β-葡萄糖苷酶基因。针对文库低的阳性筛选率问题,利用分子技术研究了不同的分离速度对提取到的总DNA中真核生物DNA量的影响,以减少文库中真核生物DNA的污染。

一个可在大肠杆菌和链霉菌之间进行属间接合转移的柯斯质粒

利用柯斯质粒载体在大肠杆菌中克隆和分析链霉菌基因簇的方法和技术已有很大发展,已构建了不少链霉菌-大肠杆菌双功能柯斯载体.利用这种载体固然可以把链霉菌的基因文库构建在大肠杆菌中并可方便地进行克隆片段的结构分析,但要通过转化把克隆的大片段DNA 转回到链霉菌中来进行功能分析常常遇到不少障碍,最近发展起来的质粒在大肠杆菌和链霉菌之间进行属间接合转移的方法,则解决了外源DNA导入许多链霉菌菌种的疑难问题。

一个诱动接合性柯斯载体的构建及其应用

用pHZ132在大肠杆菌中构建基因文库,并用特异的探针进行菌落杂交获得了有意义的DNA片段,可将其衍生质粒转化到携带接合性大肠杆菌质粒如RP4的细胞中.通过与萌发后的链霉菌孢子进行两亲本杂交,或将携带pHZ132的大肠杆菌细胞和携带RP4衍生质粒pPK2073的大肠杆菌细胞与萌发后的链霉菌孢子混合起来进行三亲本杂交,在接合性质粒RP4转移功能的诱动下,携带插入片段的PHZ132衍生质粒即可转移到萌发后的链霉菌孢子中去.已尝试用此载体成功地构建了一个重要的抗真菌抗生素产生菌——链霉菌FR-008的基因文库,并通过接合转移的方法将pHZ132衍生质粒转移到FR-008及其限制性缺陷菌株DX600中,并进行了DNA片段的功能分析.

基因克隆中常用的一些载体及其特征

以大肠杆菌菌株为受体的基因克隆载体通常是由质粒、噬菌体DNA及柯斯质粒DNA纯化和构建的,近年来由这三类DNA构建的大量载体已广泛地应用于基因重组、克隆及表达系统中,在理论研究和生产实践上取得了重大突破和可观的效益,本文就近年来的一些进展做一代表性的介绍。1 噬菌体载体1.1 λgt10由λDNA纯化出来, 这种载体在λ抑制基因(CI)内含有一个EcoRI位点。