2012年江苏省柯萨奇病毒A组14型分离株全基因序列分析

目的探讨2012年江苏省手足口病(HFMD)病原体CVA14病毒的全基因序列特点。方法采集江苏省邳州市2012年HFMD患儿的咽拭子或肛拭子样本,分离培养得到2株CVA14病毒,利用RT-PCR扩增CVA14全长基因。利用DNAStar软件包的Meg Align进行核苷酸序列分析,构建系统进化树。结果扩增得到覆盖CVA14全基因组的3个片段,拼接后为CVA14全基因组,分别命名为PZ05Y/JS/2012和PZ15G/JS/2012。同源性分析结果显示,这2株分离株之间同源性为99.4%,原型株(G-14)的核苷酸同源性为84.4%。进化树结果显示,所有的CVA14形成A、B和C共3个分支。结论获得了江苏省CVA14的全基因序列,分析了该毒株的进化特点,补充了中国CVA14病毒的基因信息。

柯萨奇病毒A组16型VP1蛋白的原核表达及纯化

[目的]原核表达并纯化柯萨奇病毒A组16型(CVA16) VP1蛋白。[方法]根据Gen Bank CVA16 VP1基因序列,合成VP1全基因,连接到载体p ET30a,构建原核表达质粒p ET30a-CVA16-VP1。将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,Ni-NTA亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组蛋白。[结果]成功构建重组质粒p ET30a-CVA16-VP1,表达蛋白经SDS-PAGE显示分子量约为38.7 k Da,目的蛋白以包涵体形式存在,蛋白经复性、纯化,纯度达90%以上;经Western Blot检测,证实表达的蛋白为VP1蛋白。[结论]成功获得了高纯度的VP1蛋白,为此抗原用于临床诊断打下了基础。

厦门市11株柯萨奇病毒A4型分离株全基因组序列分析

目的通过分析11株CVA4病毒毒株的全基因序列,揭示其基因进化及变异特征。方法将PCR检测阳性且Ct值<25的样本进行病毒分离培养,获得的毒株提取核酸(RNA)后采用高通量宏基因组测序方法进行序列测定,将质控合格的测序数据进行基因组组装;获得的基因组序列提交至肠道病毒分型网站获得毒株血清型,同时与公共数据库下载的其他国家或地区的CVA4毒株序列通过MegAlign、Mega X、Simplot3.5.1软件分别进行相似性分析、系统进化树分析和重组分析。结果11株毒株全基因组序列长度在7434~7419 bp之间,血清型均为CVA4,核苷酸与氨基酸序列相似性分别为91.7%~99.3%和98%~100%;与原型株序列相比,核苷酸序列何氨基酸序列相似性分别在84.3%~84.7%和97.1%~97.3%之间;与其他参考序列相比,核苷酸与氨基酸序列相似性分别为80.8%~98.8%和96.9%~99.6%;全基因组遗传进化分析表明,其与中国其他地区CVA4毒株序列属同一遗传分枝;根据VP1基因进化树分析,本研究的毒株与中国其他地区毒株属于C基因型中的C2亚型;重组分析结果显示,11株CVA4与其他毒株无明显重组特征,但其中1株的部分区段序列与CVA2毒株序列一致性可达97.2%,剩余毒株与既往重组株相似度可高达98.6%。结论11株CVA4毒株为中国主要流行基因型,虽然与其他毒株无重组现象,但是与其他型别及以往重组株相似性较高,故在工作中需加强毒株重组监测,为手足口病的预防控制工作提供数据支撑。

2009-2019年中国大陆柯萨奇病毒A14型基因特征分析

柯萨奇病毒A14型属于肠道病毒A组,可引起手足口病和无菌性脑膜炎等疾病,但目前全球对CVA14的分子流行病学研究较少,尚无对CVA14基于全长VP1区进行明确分型的相关研究。因得到中国手足口病监测网络的技术支持,本研究获得2009-2019年在中国大陆分离到的15株CVA14,应用RT-PCR对其全长VP1区进行扩增、测序和分析,并与GenBank中下载的22条CVA14全长VP1序列共同构建系统发育树。结果显示,2009-2019年中国大陆分离的15株CVA14与原型株G-14的核苷酸与氨基酸相似性分别为81.8%~82.9%与95.6%~96.9%,15株CVA14之间的核苷酸与氨基酸相似性分别为91.7%~99.7%与98.3%~100%。中国大陆所有的22条CVA14序列之间的核苷酸与氨基酸相似性分别为91.7%~100.0%与98.3%~100.0%。中国大陆所有的CVA14与国外8条CVA14序列之间的核苷酸与氨基酸相似性分别为80.7%~86.0%与94.9%~97.9%。基于全长VP1系统发育树,全球CVA14可划分为A-G七个基因型,目前全球范围内流行的CVA14的基因型主要为G基因型,中国大陆流行的基因型全部为G基因型。本研究建立了全球CVA14基于全长VP1的基因分型方法,揭示了CVA14在中国大陆及全球范围内的分子流行特征,为CVA14的致病机制研究提供了分子流行病学方面的基础。

柯萨奇病毒A组9型的基因分型方法的建立

血清型别鉴定及基因分型分析是开展肠道病毒(Enterovirus,EV)分子进化特征研究的重要内容。目前为止,国内外对柯萨奇病毒A组9型(Coxsackievirus A9,CVA9)的研究主要集中在衣壳蛋白区的细胞受体结合位点及其基因特性分析,而基于全长VP1序列的基因型划分结果尚未明确。本研究依托国家手足口病监测网络,对2010-2019年全国31个省级行政区(省、自治区、直辖市)上送的18 238份手足口病样本中分离出的24株CVA9进行全长VP1区序列测定,并与GenBank中所有全长VP1区序列一起进行基因型划分研究。测序结果显示24株CVA9分离株VP1全长为906bp,编码302个氨基酸,与CVA9原型株(Griggs)核苷酸和氨基酸相似性分别为80.5%~97.6%和92.3%~99.6%。结合系统进化树和同一血清型内不同基因型的核苷酸差异界值为15%~25%,将全球CVA9划分为A-H八个基因型。进化树显示B、C和D基因型在病毒进化过程中已消失,而E、F和G基因型呈现共循环的趋势,其中G基因型包含了亚洲、北美洲、大洋洲和欧洲等9个国家的毒株,是CVA9的优势基因型。大部分中国株属于G基因型,与世界流行趋势一致。但在2018年新疆一例手足口病患儿体内分离到的CVA9毒株却与俄罗斯有很近的亲缘关系,被划分为F基因型,推测该毒株为俄罗斯输入株。CVA9虽具有明显的地理聚性,但G基因型中包含的多国家和多时间段的毒株也提示CVA9病毒可能存在远距离的传播和流行。

昆明市2018—2021年手足口病病例中柯萨奇病毒A组4型流行情况及VP1编码序列基因特征分析

目的 分析昆明市2018—2021年手足口病病原构成,研究柯萨奇病毒A组4型(coxsackievirus A4,CVA4)的流行特点及VP1编码序列系统进化与氨基酸变异情况。方法 采用实时荧光逆转录聚合酶链反应(real-time reverse transcript-polymerase chain reaction, real time RT-PCR)对2018—2021年昆明市疾病预防控制中心监测到的昆明市手足口病病例标本3 553份进行肠道病毒核酸检测,描述CVA4的流行情况,并进行VP1编码序列全长测序、氨基酸位点变异及系统进化分析。结果 共检出肠道病毒阳性标本2 531份,阳性率71.24%,其中CVA16、EV-A71及其他肠道病毒(非EV-A71、非CVA16)占阳性样本的构成比分别为38.05%(963/2 531)、4.11%(104/2 531)和57.84%(1 464/2 531)。CVA4阳性52份,其高发区域为昆明市区及东南部,涉及5个县区,阳性数占CVA4病例总数的73.08%(38/52),高发时间为8—12月,占CVA4病例总数的71.15%(37/52),高危人群为1~3岁儿童,占86.54%(45/52),男性多于女性,多引起轻症。CVA4共测序成功51份,核苷酸相似性为90.90%~100.00%,氨基酸相似性为97.30%~100.00%,均为C基因型C2亚型,分为3个传播链(cluster),clusterⅠ以2019年昆明市毒株为主,clusterⅡ以2020和2021年昆明市毒株为主,clusterⅠ、Ⅱ包含了98.04%(50/51)昆明市毒株。与原型株High Point(AF081295)VP1区氨基酸序列相比,有R18K、T23V、A34T、S102A、A200T、I262V、R274K和Y285H共8个高频氨基酸变异位点。结论 2018—2021年昆明市手足口病病原谱中其他肠道病毒(非EV-A71、非CVA16)占主导地位,CVA4作为其中的一个重要类型,属于C2亚型。应针对昆明市主城区及东南部区县、8—12月和1~3岁儿童等因素合理配置防控资源,做好CVA4防控工作。

微生物学

0501994 福建省新分离3株乙型脑炎病毒的分子特征鉴定；0501995 乙型脑炎病毒活疫苗生产株SA14-14-2的感染性克隆构建；0501996 HIV核心抗原p24原核系统的高效表达、纯化及活性鉴定；0501997 柯萨奇B组病毒VP1胞质表达系统的建立；0501998 丙肝病毒NS5B-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及稳定转染HepG2细胞系的建立。

CVA16感染对m^6A甲基化相关蛋白表达和定位的影响

目的本研究旨在探究柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A 16,CVA16)感染后是否会影响N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)甲基化相关蛋白在人呼吸道上皮细胞(16HBE)、ICR乳鼠和SCARB2人源化小鼠中的表达,以及在细胞中的定位。方法病毒分别以感染复数(MOI)=0.1感染16HBE和107 CCID50/ml感染小鼠,Western blot分析甲基转移酶、去甲基化酶和甲基化阅读蛋白的表达变化,免疫荧光观察这些蛋白质在细胞中的定位。结果研究结果发现,随着CVA16病毒感染时间的增加,m6A甲基化相关蛋白在细胞中表达水平逐渐下调,在ICR乳鼠和SCARB2小鼠中无明显变化;病毒感染后,m6A甲基化相关蛋白在细胞核与细胞质中重新分布,甚至发生降解。结论CVA16在宿主细胞中复制时可以改变m6A甲基化修饰相关蛋白的表达和细胞定位。本研究结果提示m6A修饰可能是肠道病毒治疗的潜在新靶点。

手足口病常规检测方法改进分析

目的为提高RT-PCR的检出水平,进一步改进手足口病的检测方法提供参考依据。方法同时采用RT-PCR和real-time RT-PCR方法检测2011年2—5月河南省新乡市各级医院临床诊断为手足口病患者的100份粪便标本及50份非肠道病人粪便标本中肠道病毒通用型(PE)、柯萨奇病毒A组16型(CVA16)和肠道病毒71型(EV71)核酸;改进引物,RT-PCR检测CVA16;在NCBI中对RT-PCR使用的各组引物进行BLAST比对,并使用Primer Premier 6.0及Oligo 6.62软件分析各引物。结果 Real-time RT-PCR法检出CVA16、EV71和PE阳性率分别为36%、33%和71%,常规RT-PCR法分别检出20%、27%和64%,2者的PE、EV71检出率无统计学差异,而CVA16的检出率差异有统计学意义(χ2=6.349,P<0.05);改进引物后,RT-PCR法CVA16阳性检出率提高到35%(χ2=5.643,P<0.05),与临床诊断的符合率增加10%,接近real-time RT-PCR检测水平;2种方法的特异性、漏诊率及误诊率无明显差异。结论常规RT-PCR法对CVA16的检出率较低,采用改进后的引物,其检出率达到real-time RT-PCR水平。