柯萨奇病毒A组6型中国株的分子进化和时空传播分析

柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6,CV-A6)是手足口病的主要病原体,可引起非典型手足口病和中枢神经系统疾病,对儿童造成严重的疾病负担,尚无上市的疫苗和抗病毒药物.基于3288条CV-A6中国株VP1序列,利用Nextstrain平台的augur病原体生物信息分析包,构建了CV-A6的时间尺度分子进化树,确定了进化分支和分支突变,分析了分支突变与抗原表位之间的联系.进一步分析了CV-A6中国株各分支在中国七大地理区域的时空分布和优势分支,绘制了主要分支的时空传播路线.结果发现,CV-A6中国株主要分为B、C和D三个进化分支以及D2、D3a和D3b三个子分支,抗原表位处的突变形成了新的进化分支,促进了病毒的流行.华南和华东是CV-A6中国株的主要起源地,华南和华东相互输出、华东输出全国是中国株的主要传播模式.对CV-A6中国株的分子进化和时空传播分析,为CV-A6引起的手足口病等疫情的监测、预警和防控提供了重要支持.

2016—2020年安徽省手足口病相关柯萨奇病毒A组16型分子分型研究

目的了解安徽省手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)相关柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CV-A16)基因型别分布情况。方法通过中国疾病预防控制信息系统传染病报告管理信息系统收集安徽省2016—2020年HFMD病例资料,并收集HFMD患儿咽拭子标本。对荧光定量PCR检出的CV-A16核酸阳性病例样本采用RT-PCR扩增VP1区基因片段并测序。运用肠道病毒在线分型工具确定基因型别,再利用MEGA 6.0生物软件构建CV-A16 VP1区基因进化树并分析VP1区氨基酸变异位点。结果2016—2020年安徽省累计报告HFMD实验室确诊病例16650例,其中CV-A16确诊病例3809例(占22.88%),各年中CV-A16确诊病例占比依次为20.72%(219/1057)、22.91%(677/2955)、23.89%(1004/4202)、42.58%(1687/3962)、4.96%(222/4474)。对获取的436份CV-A16阳性标本进行测序,获得290条VP1区基因序列,均属于B基因型,其中B1a基因亚型65条,B1b 225条。290条VP1区基因序列核苷酸同源性为86.80%~100.00%,与CV-A16原型株G-10核苷酸同源性为74.10%~76.80%。65条B1a毒株VP1区基因序列与B1a参考株核苷酸同源性为93.00%~99.90%,225条B1b毒株VP1区基因序列与B1b参考株核苷酸同源性为88.40%~99.60%。B1a基因亚型流行株在遗传进化上分为4个分支簇,B1b基因亚型流行株在遗传进化上分为6个分支簇。与原型株G-10 VP1区编码氨基酸位点变异分析显示,290条VP1区基因存在多个位点变异。结论2016—2020年安徽省HFMD CV-A16流行株B1a与B1b基因亚型二者共同流行,应持续关注安徽省肠道病毒病原监测与分子进化变异情况。

2013-2022年江苏省柯萨奇病毒A6型全基因组序列特征分析

目的 研究江苏省2013-2022年分离到的柯萨奇病毒A6型(CV-A6)全基因组序列特征及对全基因组各编码区进行遗传进化分析,以期从分子流行病学特征的角度解释CV-A6取代肠道病毒A71和柯萨奇病毒A16成为江苏省引起手足口病(HFMD)主要病原的原因。方法 选取2013-2022年间江苏省地区流行的35株CV-A6毒株进行全基因组测序,采用DNASTAR、MEGA7.0和Similarity plots3.5.1等软件对获取的全基因组序列进行比对、相似性分析、系统进化分析和基因重组分析,对P1编码区和3D区主要氨基酸变异位点进行分析。结果 35株CV-A6江苏毒株的全基因组核苷酸和氨基酸序列相似性分别为87.5%~99.6%和97.0%~99.8%,与CV-A6原型株Gdula/USA/1949的全基因组核苷酸序列相似性仅为80.3%~81.0%,氨基酸序列相似性为94.7%~95.3%。基于VP1序列的系统进化树结果显示,2013-2022年江苏省有34株CV-A6分离毒株分属于D3a基因亚型,1株分属于D2基因亚型;基于3D区进化树划分不同重组模式,2013-2022年江苏省流行的CV-A6出现过4个重组进化分支:RF-A、RF-L、RF-K和RF-C型。重组分析结果显示:江苏省流行的CV-A6毒株与CV-A6原型株Gdula/USA/1949在结构蛋白序列上具有较高的相似性。而在非结构蛋白和非编码区则与其他EV-A原型株序列相似性更高。而氨基酸突变位点分析结果显示,与原型株Gdula/USA/1949相比,P1区和3D区多个氨基酸位点变异频繁,可能会使得衣壳蛋白的结构、潜在的受体结合位点产生变化。结论 通过对2013-2022年江苏省CV-A6的全基因组序列分析,有助于了解江苏省CV-A6基因重组及遗传进化关系,解释了近年来CV-A6成为手足口病的主要病原体的可能原因,对CV-A6的防控工作提供了基础资料。

柯萨奇病毒A组16型抗原ELISA定量检测方法的建立与初步应用

为建立柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CA16)抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法,用于CA16灭活疫苗的研发和生产。本文以纯化的CA16病毒颗粒免疫新西兰兔,分离含有CA16-IgG的血清,经纯化得到纯度较好的CA16-IgG作为包被抗体;将辣根过氧化物酶标记到CA16-IgG上作为酶标抗体。用CA16抗原国家标准品对建立方法的特异性、稳定性、精密度、准确度及线性和最低检测下限进行验证。用建立的方法检测疫苗生产中各工艺段关键中间品(包括CA16收获液、超滤浓缩液、纯化液、原液)的抗原含量。结果显示建立了CA16抗原的ELISA定量检测方法。该方法的线性范围为0.71~45.45 ng/mL,决定系数>0.99,最低检测下限为2.84 ng/mL;精密度良好,变异系数<15%;不同浓度的样本相对偏倚(RB)均≤±12%,准确度良好;将检测板密封后置于37℃5 d,决定系数>0.99且变异系数<15%,稳定性良好;与CA16以外的其他样品无交叉反应,特异性良好。随着CA16疫苗制备过程的不断推进,中间品的比活呈上升趋势。构建的CA16抗原ELISA定量检测方法符合定量检测需要,可用于CA16疫苗研发及生产。

柯萨奇病毒A组16型中国分离株(Cox.A16 SHZH00-1)全基因组序列测定及分析

对分离自2000年中国深圳地区手足口病患儿粪便标本的柯萨奇病毒A组16型(CoxsackievirusA16,Cox.A16)病毒SHZH00-1株进行全基因组序列测定及分析后发现,Cox.A16SHZH00-1的基因组(未包括多聚腺苷酸尾)长度为7410bp,其中5′端非编码区(5′UTR)长为745bp,病毒基因组编码区全长6582个核苷酸,编码一个含2193个氨基酸残基的多聚蛋白,3′端非编码区长为83bp。Cox.A16SHZH00-1基因组的结构与Cox.A16亚洲地方株Tainan-5079-98(AF177911)十分相近,整个基因组的核苷酸同源性为97.5%,氨基酸同源性为98.8%;而与Cox.A16国际标准株G10(U05876)差别较大,两者核苷酸同源性仅为79.1%,氨基酸同源性为94.5%。Cox.A16SHZH00-1与两株肠道病毒71型SHZH03(AY465356)和BrCr(U22521)比较,核苷酸同源性均不超过80%。

中国柯萨奇病毒A组16型部分VP1区序列测定及系统进化分析

利用1999～2004年连续6年从中国深圳及北京地区分离的柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,Cox.A16)毒株的部分VP1区基因序列进行分析和研究,试图找出中国Cox.A16的种系进化规律和分型依据.6株Cox.A16病毒部分VP1区核苷酸和氨基酸同源性均较高,相互间核苷酸同源性为94.5%～98.0%,氨基酸同源性为97.8%～100%.6株中国分离株与Cox.A16国际参考株相比,部分VP1区核苷酸同源性高于78.2%,氨基酸同源性高于为93.3%.基因系统进化分析表明,中国大陆分离的6株Cox.A16与中国台湾流行株Tainan-5079-98(AF177911),与4株日本分离株、瑞典株及美国株GA95-2095(AF081613)、PA94-5753(AF081628)的关系均较近,核苷酸同源性大于93.3%.了解我国Cox.A16流行株的遗传学背景和种系进化关系,对有效地预防和控制Cox.A16流行有重要意义.

肠道病毒71型、柯萨奇病毒A组16型相关手足口病临床特征分析

目的分析肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CA16)相关手足口病(HFMD)的临床特征。方法回顾性分析209例EV71及CA16相关HFMD患儿临床资料,并进行比较。结果普通型HFMD患儿中,EV71感染患儿平均月龄偏大,体温高,呕吐及臀部出疹率高(P<0.05);CA16感染患儿男性偏多,发热天数长,心率快,AST、CRP显著升高(P<0.05)。重症HFMD患儿中,EV71所致病例多于CA16所致者(P<0.05),且嗜睡、肌震颤、易惊等临床表现的发生率高,易并发脑膜脑炎、脑干脑炎(P<0.05),实验室指标WBC、血糖(GLU)水平升高(P<0.05);CA16感染患儿男性较多,流涎、腹泻、口腔溃疡发生率高(P<0.05),实验室指标AST、CK、CRP水平显著升高(P<0.05)。结论 EV71及CA16相关HFMD临床特征有所不同,根据临床表现结合实验室指标WBC、GLU、AST及CRP等,有助于区分EV71或CA16感染。

2011-2016年上海地区手足口病病原谱及柯萨奇病毒A组6型不同基因型感染细胞的差异研究

本文旨在分析2011—2016年上海地区手足口病病原谱的构成和主要病原体流行规律,为手足口病的疫情防控和重症预警提供参考。采集2011—2016年哨点医院临床诊断为手足口病的患儿标本,首先进行肠道病毒通用型核酸和分型检测,其次对2012—2016年核酸检测为柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus A6,CA6)阳性样本进行基因型重组检测,分离重组型和非重组型CA6株,比较两者生物学特性。结果显示,2011—2012年秋季上海地区手足口病主要致病原为肠道病毒71型(enterovirus type 71,EV71)和CA16;2012年秋季起CA6成为主要病原体;2013—2014年重组型CA6(recombinant CA6,R CA6)占一定比例;2015—2016年非重组型CA6(non-recombinant CA6,NR CA6)成为优势流行株。R CA6和NR CA6代表株在RD细胞中增殖良好,在KB、MRC-5和HEp-2细胞中未见明显增殖。比较R CA6与NR CA6代表株接种于RD细胞后细胞活性下降的动态变化,未见显著差异。本研究证实,CA6为近年来上海地区手足口病的主要病原体,R CA6和NR CA6的构成比逐年变化,提示持续监测手足口病主要病原体并了解其生物学特性,对上海地区手足口病的防控预警及疫苗研发具有重要意义。

合肥市0-14岁人群柯萨奇病毒A组16型和肠道病毒71型的感染状况调查

采用ELISA法检测0-14岁人群柯萨奇病毒A组16型（CoxA16）及肠道病毒71型（EV71）抗体水平。在入选的1000例儿童中,EV71 IgM总阳性率19．9%,EV71 IgG总阳性率47.7%,CoxA16 IgM总阳性率22．8%,CoxA16 IgG总阳性率51．3%；EV71 IgM总阳性率与CoxA16 IgM总阳性率比较,差异无统计学意义（χ^2=2．794,P〉0．05）；EV71 IgG总阳性率与CoxA16 IgG总阳性率比较,差异无统计学意义（χ^2=2．793,P〉0．05）。各年龄组比较,新生儿组IgG抗体阳性率较高,其EV71 IgG抗体阳性率41．5%,CoxA16 IgG抗体阳性率49．5%；婴儿组IgG抗体阳性率最低,EV71 IgG、CoxA16 IgG抗体阳性率分别为38．0%,43．5%；除新生儿组外,随年龄增加,人群EV71、CoxA16 IgG逐渐增高,组间差异有统计学意义（χ^2=27．04、19．98, P 〈0．01）；在 IgM 方面,人群EV71、CoxA16 IgM 随年龄逐渐升高,组间差异有统计学意义（χ^2=41．12、37．13,P〈0．01）。两种HFMD病原体的IgM、IgG抗体性别间差异无统计学意义（χ^2=0．51、1．77、0．36、2．12,P〉0．05）。

江苏省2012年柯萨奇病毒A组16型基因特征分析

目的：了解江苏省2012年柯萨奇病毒A组16型（CA16）分离株VP1区基因特征。方法：选取江苏省2012年14株CA16病毒分离株,用1对特异性引物进行VP1区核苷酸序列扩增,对扩增产物进行测序,利用生物信息学软件对序列进行分析,结果与CA16参考株序列进行同源性比较并构建基因进化树。结果：14株CA16分离株VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为90.5%~100.0%和98.7%~100.0%,与CA16国际标准株G10的核苷酸和氨基酸同源性分别为75.5%~76.7%和91.6%~92.3%。江苏省2012年的CA16分离株全部属于B1基因亚型,同时包含B1a 和B1b 两条进化分支。结论：江苏省2012年有CA16病毒的B1a与B1b两种进化分支共同存在与循环,且呈现以B1b基因亚型为优势型别。B1a基因亚型为辅助型别的传播模式;无论是优势型别还是辅助型别,均各自呈现密切的亲缘关系。

柯萨奇病毒A组16型与肠道病毒71型致手足口病临床特点比较

手足口病是由多种肠道病毒引起的常见感染性疾病,其中肠道病毒71型(EV-A71)和萨奇病毒A组16型(CV-A16)是最常报道的病毒类型[1]。手足口病易发生在5岁以下儿童,大多数患儿表现出自限性疾病症状,典型症状包括发热、手脚皮疹、口腔内水疱。研究显示,一小部分手足口病可迅速发展,导致致命的神经系统和全身并发症,特别是在EV-A71相关的患儿中[2]。EV-A71型、CV-A16型手足口病患儿临床表现不同,疾病预后也不尽相同[3]。为了比较EV-A71型、CV-A16型手足口病患儿临床特征,本研究选取30例CV-A16型手足口病患儿和45例EV-A71型手足口病患儿,以观察2组不同病毒导致手足口病临床特征和血清学特征。

柯萨奇病毒A组16型与小鼠病毒性心肌炎的关联性及其药物干预研究

目的研究柯萨奇病毒A组16型(CVA16)与小鼠病毒性心肌炎的关联性,以及利巴韦林药物干预后的结果。方法将获取的临床标本分离后在非洲绿猴肾细胞中进行大量培养,选用致病性强的一株进行纯化、鉴定,培养出有一定毒力的致病株,以腹腔注射的方式感染刚出生的小鼠,小鼠共分为5组,每组10只,其中A组为正常对照组,B组为模型对照组,C组为低剂量的利巴韦林干预组,D组为中剂量的利巴韦林干预组,E组为高剂量的利巴韦林干预组,记录小鼠每日体质量、四肢活动情况、死亡情况,分别于感染后第3、7、11、15天获取小鼠的血清及心脏组织,采用酶联免疫吸附法(ELASA)试剂盒检测血清中的白细胞介素-6(IL-6),将心脏组织一部分用于病理切片,一部分用于提取RNA,进行反转录PCR(RT-PCR)实验。结果 B组小鼠的血清IL-6值明显升高,与A组比较,差异有统计学意义,并且RT-PCR的结果表明病毒在感染后的小鼠心肌细胞中存在,同时病理切片中可见明显的心肌炎性病变,利巴韦林药物干预之后,D组小鼠的体质量、病理切片炎性病变好转。结论 CVA16与病毒性心肌炎的发生有一定关联性,一方面病原本身对心肌有损伤,另一方面免疫内环境也参与其中,利巴韦林在治疗CVA16有关的心肌炎中有一定的临床意义。

柯萨奇病毒A组16型研究进展

A组16型柯萨奇病毒(Coxsackievirus A16,CVA16)是引起手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)的主要病原体之一。近年来,HFMD在亚太地区暴发流行,已经成为重大的公共卫生问题之一。加强对CVA16生物学特征、流行病学特征、临床表现、实验室诊断、防治手段的认识,有助于防控HFMD的蔓延。

柯萨奇病毒A组16型衣壳蛋白VP1的原核表达及初步活性测定

目的:原核表达柯萨奇病毒A组16型(CVA16)衣壳蛋白VP1,以便于研制血清学检测试剂。方法:在基因库中钓取CVA16-VP1的全长序列,采用PCR逐步合成法合成其全长基因,测序正确后克隆到表达载体pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET28a(+)/VP1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化;建立捕获免疫酶联法检测IgM抗体,检测20份手足口病阳性血清和30份阴性血清,评价重组抗原的灵敏度和特异性;采用CVA16全病毒免疫的抗小鼠血清进行Western印迹。结果:重组CVA16-VP1蛋白在大肠杆菌中获得高效表达;用重组蛋白抗原检测,20份手足口病患儿阳性血清中有4份阳性,其中1份同时为肠道病毒71型(EV71)VP1阳性,30份阴性血清无反应。结论:实现了CVA16-VP1的高效表达,初步结果显示重组蛋白具有较好的抗原性,为柯萨奇病毒A组16型诊断试剂的研究奠定了基础。

柯萨奇病毒A组16型的3C蛋白抑制RIG-Ⅰ介导的IFN-β的诱导

目的探讨柯萨奇病毒A组16型对RIG-Ⅰ介导的信号通路的影响。方法将带有IFN-β启动子的萤火虫荧光素酶报告质粒pIFN-β-luc及内对照报告载体pRL-CMV转染细胞,之后用CA16感染细胞,24 h后检测报告基因活性。将CA16感染细胞,在感染6 h、12 h、24 h以及48 h后用Real-time PCR方法测定细胞中IFN-β的mRNA的表达水平。将pIFN-β-luc和pRL-CMV以及表达RIG-I的质粒和表达CA16的3C蛋白质粒共转染细胞,24 h后检测报告基因活性。将带有绿色荧光蛋白GFP的IRF3质粒和表达RIG-I基因N端质粒以及表达CA16的3C蛋白共转染细胞,24 h后用荧光显微镜观察。将表达RIG-I的质粒和表达CA16的3C蛋白质粒共转染细胞,24 h后用免疫共沉淀方法验证蛋白质间相互作用。结果 CA16感染细胞不能引起IFN-β表达的上调,CA16的3C蛋白抑制了RIG-I诱导的IFN-β的启动子活性以及IRF3的核迁移,CA16的3C蛋白与RIG-Ⅰ存在相互作用。结论 CA16的3C蛋白通过与RIG-Ⅰ相互作用从而抑制RIG-Ⅰ介导的IFN-β的诱导。

柯萨奇病毒A组16型研究进展

柯萨奇病毒A组16型(CA16)是引起手足口病(HFMD)的主要病原体,与肠道病毒71型(EV71)交替或共同流行;特别是近年在西太平洋地区呈现流行强度高、重症和死亡人数多的特点,已成为该地区的重大公共卫生问题。研发安全有效的疫苗是控制HFMD流行的有效手段。由于EV71所致疾病在重症和死亡病例中所占比例高,对其疫苗研发得到了广泛关注,全病毒灭活疫苗已进入III期临床,有望即将应用于婴幼儿HFMD的防控。EV71疫苗的顺利研发随之也增加了对CA16疫苗研发的迫切性。近年来日本、新加坡以及中国台湾地区逐渐开始关注CA16相关的研究,我国也有多家企业开展CA16疫苗的研发。本文就CA16的病原学,流行病学,实验室诊断,治疗和预防等方面进行了综述。

柯萨奇病毒A组16型的研究进展

柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A group 16 strain,CA16)感染在中国很常见,CA16在流行过程中不断发生变异,其致病性与肠道病毒71型有明显差异。CA16可诱导产生多种微小核糖核酸,影响炎性信号通路的传导,导致病理损害的发生。目前已成功建立了小鼠、树鼩、猕猴CA16感染模型,可用于评估抗CA16药物和疫苗效果。检测方面,多重实时逆转录聚合酶链反应可针对手足口病进行高灵敏度检测和快速分型,胶体金免疫层析法可用于现场的快速诊断。多种单价、多价的CA16疫苗在动物实验中诱导出有效的免疫。

柯萨奇病毒A组16型抗原的ELISA定量检测方法建立

目的:建立柯萨奇病毒A组16型(CA16)抗原的双抗体夹心ELISA定量检测方法,用于CA16灭活疫苗的研发和生产过程的抗原定量检测。方法:以CA16中和单抗T26H12为包被抗体、NA14B9为标酶抗体,构建定量检测CA16抗原的双抗体夹心ELISA方法,并对方法的特异性、灵敏度、精密度、准确性、线性和稳定性进行分析。结果:建立了双抗体夹心定量检测CA16抗原的ELISA方法。方法的线性相关系数R2=0.998,线性范围为8～128 ng/ml,定量限度为8 ng/ml;变异系数CV<15%;回收率介于87.0%～113.8%之间;37℃6天的回收率>80%;与CA16以外的其他样本没有交叉反应。结论:构建的CA16抗原ELISA定量检测方法的各项性能符合定量检测需要,可用于CA16疫苗的研发和生产过程的抗原活性的定量检测。

检测柯萨奇病毒A组6、10、16型的多重荧光RT-PCR建立及应用

目的建立检测手足口病(HFMD)肠道病毒的多重荧光RT-PCR方法。方法用多重荧光RT-PCR技术对引起HFMD的3种常见人肠道病毒[柯萨奇病毒A组(CVA)6、10、16型]进行检测,用基因测序法进行验证,并以灭活的CVA6、CVA10、CVA16病毒标准株以及引起临床相似症状的病原体样本进行特异性和灵敏度分析。结果 322例临床疑似HFMD标本,经本多重荧光RT-PCR法检测出CVA16、CVA10和CVA6型阳性样本分别为81、16和9份(总阳性率32.9%),且与基因测序法结果完全符合。将多重PCR体系中c-MMLV逆转录酶的量增至5 U,Hot-Taq酶的量增至8.5 U,可使其扩增效率提升至单重PCR扩增水平。优化后的体系可扩增出CVA6、CVA10和CVA16型阳性病毒标准RNA的检测下限分别是10,5和1 TCID50/mL。结论建立了一种灵敏、特异、高效和高通量的检测HFMD肠道病毒的多重荧光RT-PCR法,为其快速诊断提供了新的实验方法。