柯萨奇病毒A组16型病毒株VP1基因序列测定及进化分析研究

目的通过检测分析2015年杭州市柯萨奇病毒A组16型(CA16)病毒株VP1区核苷酸序列,掌握杭州市CA16的流行情况及种系进化关系,为手足口病的预防和治疗提供支持,同时为CA16疫苗株的选择提供依据。方法收集2015年杭州市儿童医院256例临床资料齐全且临床诊断为手足口病患儿的粪便或咽拭子,利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增CA16病毒株VP1区核苷酸序列(约1 020 bp),测序后利用DNASTAR和Primer Premier 5.0进行序列比对分析,并用Mega 3.1软件建立检测样本VP1区序列与Gen Bank上CA16参考毒株VP1核苷酸序列的系统发育树。结果共分离到80株CA16阳性病毒。序列比对分析结果显示,CA16分离株的核苷酸同源性为90.8%~100.0%,氨基酸同源性为99.5%~100.0%。系统发育树分析结果显示,17株CA16全部属于B1基因亚型,并且同时存在B1a和B1b两个进化分支,其中4株属于B1a亚型,13株属于B1b亚型。结论 2015年杭州市CA16病毒株属于B1基因亚型,与国内外某些地区手足口病病原学及分子进化研究结果一致,有望成为疫苗候选株作进一步研究。

2021—2023年安徽省手足口病柯萨奇病毒A组16型分子分型研究

目的了解安徽省手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)发病情况、柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CV-A16)基因型别分布情况和VP1基因进化特征。方法通过中国疾病预防控制信息系统对2021—2023年安徽省HFMD发病情况和病原学检测情况进行统计。收集HFMD患者咽拭子样本,分离得到CVA16毒株,对其VP1区进行PCR扩增和基因序列测定,使用肠道病毒在线分型工具鉴定基因亚型,运用MegAlign比较核苷酸和氨基酸同源性,利用MEGA 6.0构建进化树,并分析VP1区氨基酸变异位点。结果2021—2023年安徽省累计报告HFMD病例155640例,年均报告发病率为84.83/10万。2021—2023年安徽省16个地市共报告HFMD实验室确诊病例12643例,其中CV-A16占18.16%(2296/12643),各年度构成比分别为25.81%(1127/4366)、33.69%(782/2321)和6.50%(387/5956)。2021—2023年安徽省共分离到HFMD CV-A16毒株72株,其中B1a和B1b基因亚型分别为58株(占80.56%)、14株(占19.44%)。两种亚型毒株与CV-A16原型株G-10的核苷酸和氨基酸同源性分别为73.80%~76.20%和90.60%~92.30%。进化树显示B1a基因亚型流行株在遗传进化上分为4个分支簇,B1b基因亚型流行株形成3个分支簇。72条VP1区基因序列与原型株比较发现了26个氨基酸位点发生变异。结论2021—2023年安徽省HFMD CV-A16主要流行的基因亚型为B1a和B1b,B1a为优势基因亚型,应加强对CV-A16流行毒株的分子监测。

一株柯萨奇病毒A组4型云南株的全基因组分析

目的了解中国云南2022年分离到的一株柯萨奇病毒A组4型(Coxsackievirus A4,CVA4)病毒株的全基因组序列特征,探讨CVA4系统发育特征。方法对CVA4分离株194R3/YN/CHN/2022进行全基因组序列扩增测序,并应用Mega 7.0、Geneious 9.1.4及Simplot 3.5.1等软件拼接比对,构建CVA4分离株系统进化树,分析其全基因组序列特征。结果194R3/YN/CHN/2022分离株为CVA4,属于C2基因亚型,与我国近年的优势基因亚型一致。重组分析显示,在P2、P3非结构编码区,CVA4病毒分离株可能与EVA114原型株V13-0285、CVA16原型株G-10、CVA14原型株G-14发生过重组。结论云南分离的194R3/YN/CHN/2022属于CVA4中国流行的C2基因亚型,但发生了一定变异。

柯萨奇病毒A组16型中国分离株(Cox.A16 SHZH00-1)全基因组序列测定及分析

对分离自2000年中国深圳地区手足口病患儿粪便标本的柯萨奇病毒A组16型(CoxsackievirusA16,Cox.A16)病毒SHZH00-1株进行全基因组序列测定及分析后发现,Cox.A16SHZH00-1的基因组(未包括多聚腺苷酸尾)长度为7410bp,其中5′端非编码区(5′UTR)长为745bp,病毒基因组编码区全长6582个核苷酸,编码一个含2193个氨基酸残基的多聚蛋白,3′端非编码区长为83bp。Cox.A16SHZH00-1基因组的结构与Cox.A16亚洲地方株Tainan-5079-98(AF177911)十分相近,整个基因组的核苷酸同源性为97.5%,氨基酸同源性为98.8%;而与Cox.A16国际标准株G10(U05876)差别较大,两者核苷酸同源性仅为79.1%,氨基酸同源性为94.5%。Cox.A16SHZH00-1与两株肠道病毒71型SHZH03(AY465356)和BrCr(U22521)比较,核苷酸同源性均不超过80%。

云南省昆明地区2022年柯萨奇病毒A16型的VP1区分子特征

目的对昆明市某医院2022年从手足口病患儿分离的柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CVA16)的全VP1基因区分子特征分析。方法对昆明市某医院2022年从手足口病(hand foot mouth disease,HFMD)患儿200份临床样品粪便标本进行处理,分别通过RD细胞和Vero细胞分离,对经3次培养后仍产生细胞效应(cytopathogenic effect,CPE)的细胞培养液提取病毒核酸,然后用通用引物222/224经RT-PCR扩增并测序,序列经BLAST比对确定其血清型,对鉴定为柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CVA16)的再用特异引物CA16VP1F/CA16VP1R扩增其全VP1区并测序和拼接。下载CVA16病毒标准序列,采用Geneious 5.4.1和MEGA 6.05等软件对本研究CVA16的全VP1区的核苷酸和氨基酸序列分析。结果经鉴定后共检出22株从Vero细胞分离CVA16和6株RD细胞分离的CVA16毒株,进一步通过特异引物扩增获得21株可用的CVA16VP1全长序列,基于全VP1基因系统进化分析,这21株CVA16全属于B1a基因型。21株CVA16全长VP1基因之间的核苷酸和氨基酸序列同源性均较高,分别为91.9%~99.6%和89.2%~99.3%;与中国CVA16 B1a基因型的其他株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为89.7%~96.3%和89.2%~97.0%。与CVA16 B1b其他参考株对比,其核苷酸和氨基酸序列同源性分别在84.3%~87.2%和89.2%~97.0%。与其它CVA16的B1a基因亚型相比较发现21个氨基酸位点出现变异。结论2022年中国云南省昆明某医院引起HFMD的CVA16毒株属于B1a基因型,应继续监测以明确其流行特征。

银川市2016-2022年手足口病柯萨奇病毒A6型分离株VP1基因特征分析

目的 分析银川市2016-2022年引起手足口病的柯萨奇病毒A6型(CV-A6)VP1的基因特征,为手足口病的防治工作提供有效的参考依据。方法 收集2016-2022年银川市手足口病所有CV-A6核酸呈阳性的标本进行病毒分离培养,应用一步法聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增其VP1区完整基因核酸片段进行核苷酸序列测定,利用测序结果进行系统发育树构建、同源性分析及氨基酸突变位点分析。结果 2016-2022年银川市共分离到手足口病CV-A6型毒株90株,测序后成功获得CV-A6 VP1区全长序列的毒株83株。完整VP1区基因均由915个核苷酸组成,编码305个氨基酸。系统发育分析显示,2016-2022年银川市83株CV-A6分离株均属于D3基因亚型的D3a分支;同源性分析表明,银川市83株CV-A6分离株与原型株Gdula株(AY421764-USA-1949)之间核苷酸相似性为82.1%~84.1%,氨基酸相似性为76.2%~80.5%,遗传距离较远;银川市83株CV-A6分离株与原型株Gdula株的VP1区氨基酸序列比较发现32个氨基酸位点出现变异。结论 2016-2022年银川市手足口病83株CV-A6分离株均属于D3基因亚型的D3a分支。加强对CV-A6的持续监测及基因特征分析,对科学防控CV-A6引起的手足口病及其疫苗研发具有重要意义。

中国柯萨奇病毒A组16型部分VP1区序列测定及系统进化分析

利用1999～2004年连续6年从中国深圳及北京地区分离的柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,Cox.A16)毒株的部分VP1区基因序列进行分析和研究,试图找出中国Cox.A16的种系进化规律和分型依据.6株Cox.A16病毒部分VP1区核苷酸和氨基酸同源性均较高,相互间核苷酸同源性为94.5%～98.0%,氨基酸同源性为97.8%～100%.6株中国分离株与Cox.A16国际参考株相比,部分VP1区核苷酸同源性高于78.2%,氨基酸同源性高于为93.3%.基因系统进化分析表明,中国大陆分离的6株Cox.A16与中国台湾流行株Tainan-5079-98(AF177911),与4株日本分离株、瑞典株及美国株GA95-2095(AF081613)、PA94-5753(AF081628)的关系均较近,核苷酸同源性大于93.3%.了解我国Cox.A16流行株的遗传学背景和种系进化关系,对有效地预防和控制Cox.A16流行有重要意义.

柯萨奇病毒B组5型TaqMan一步法RT-qPCR检测方法的建立

目的建立柯萨奇病毒B组5型(coxsackievirusB5,CV-B5)特异的TaqMan一步法实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测方法。方法根据CV-B5的VP1序列,设计特异性引物和TaqMan探针。将目的基因插入pMD18^(TM)载体,在DH5α感受态细胞中扩增,大肠杆菌体外转录后获得RNA标准品并建立标准曲线,最后对检测方法的重复性、敏感度和特异性进行评价。结果该方法在10^(3)~10^(11)拷贝/微升的模板范围内具有良好的线性关系(r^(2)>0.99),扩增效率E=100.9%,敏感度达1×10^(3)拷贝/微升,只对CV-B5有特异性扩增曲线,且重复性较好。结论本实验建立的TaqMan一步法RT-qPCR检测方法有较高的敏感度、特异性和重复性,有良好的抗干扰性,可用于CV-B5的临床样本检测和绝对定量分析。

肠道病毒71型与柯萨奇A组16型混合感染致手足口病并发中枢神经系统感染临床分析

目的分析6例肠道病毒71型(EV71)与柯萨奇A组16型(CoxA16)混合感染所致手足口病并发中枢神经系统感染患者的流行病学及临床特征。方法回顾性分析6例EV71与CoxA16混合感染(混合感染组)所致手足口病并发中枢神经系统感染的临床特征、实验室检查、预后等,并与单纯EV71(EV71组)、CoxA16(CoxA16组)感染所致手足口病并发中枢神经系统感染患者进行比较。结果 6例EV71与CoxA16混合感染中5例为院外原发混合感染,1例不除外院内交叉感染。EV71与CoxA16混合感染致手足口病并发中枢神经系统感染的临床表现包括发热,手、足、口腔、臀部皮疹,肢体易惊、抖动,颈项强直,呕吐等。EV71组、CoxA16组、混合感染组患者的病情稳定时间分别为(59.0±38.1)h、(58.3±47.9)h、(86.4±44.4)h,体温稳定时间分别为(39.7±26.3)h、(28.3±17.9)h、(54.0±12.0)h,转危重型率分别为7.1%、0、1/6。结论混合感染所致手足口病并发中枢神经系统感染的临床表现与EV71与CoxA16感染所致的手足口病无明显差别,但病情更重、病程较长,危重型的发生率较高。

肠道病毒71型、柯萨奇病毒A组16型相关手足口病临床特征分析

目的分析肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CA16)相关手足口病(HFMD)的临床特征。方法回顾性分析209例EV71及CA16相关HFMD患儿临床资料,并进行比较。结果普通型HFMD患儿中,EV71感染患儿平均月龄偏大,体温高,呕吐及臀部出疹率高(P<0.05);CA16感染患儿男性偏多,发热天数长,心率快,AST、CRP显著升高(P<0.05)。重症HFMD患儿中,EV71所致病例多于CA16所致者(P<0.05),且嗜睡、肌震颤、易惊等临床表现的发生率高,易并发脑膜脑炎、脑干脑炎(P<0.05),实验室指标WBC、血糖(GLU)水平升高(P<0.05);CA16感染患儿男性较多,流涎、腹泻、口腔溃疡发生率高(P<0.05),实验室指标AST、CK、CRP水平显著升高(P<0.05)。结论 EV71及CA16相关HFMD临床特征有所不同,根据临床表现结合实验室指标WBC、GLU、AST及CRP等,有助于区分EV71或CA16感染。

柯萨奇病毒A组16型病毒样颗粒的制备及其免疫原性

目的应用Bac-to-Bac杆状病毒系统表达柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CVA16)病毒样颗粒(virus-like particle,VLP),通过条件优化,提高VLP的表达量,纯化后检测其免疫原性。方法对CVA16结构蛋白基因P1及蛋白酶基因3CD进行密码子优化,插入启动子P10改造为CMV的重组杆状病毒表达载体p Fast Bac Dual-CMV中,获得重组穿梭质粒p Fast Bac Dual-CMV-P1-3CD,转化DH10 Bac TM Competent Cells,提取重组杆粒Bacmid-CMVP1-3CD,转染Sf9细胞,组装成重组杆状病毒Ac MNPV-CMV-P1-3CD,并进行扩增,采用间接免疫荧光法、Western blot法及透射电镜观察对表达产物进行初步鉴定。对重组CVA16 VLP的表达条件(病毒接种MOI值、感染时间及细胞培养方式)进行优化后,通过20%蔗糖垫层及氯化铯连续密度梯度离心法纯化CVA16VLP,并通过腹部皮下注射免疫ICR小鼠3次,采用间接ELISA法检测小鼠血清特异性Ig G抗体滴度,微量中和试验法检测血清中和抗体滴度。结果重组杆状病毒Ac MNPV-CMV-P1-3CD经PCR及测序鉴定证实组装成功;重组CVA16 VLP在Sf9细胞中成功表达,优化的表达条件为:重组杆状病毒Ac MNPV-CMV-P1-3CD按MOI=5接种,Sf9细胞采用悬浮培养方式悬浮培养96 h,收集细胞及培养上清;纯化的CVA16 VLP纯度可达90%以上,针对VP2的单克隆抗体能与VP0及VP2发生特异性反应,电镜下可见大量形态规则的类球形VLP,直径约为27 nm;纯化的CVA16 VLP免疫ICR小鼠后,诱导机体产生的特异性血清Ig G滴度可达1∶105,中和抗体滴度达1∶358。结论应用杆状病毒表达系统成功表达了CVA16的P1和3CD蛋白,并组装形成完整的VLP;通过质粒启动子的改造及表达条件的优化,有效提高了CVA16 VLP的表达量;纯化的CVA16 VLP可诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,为CVA16亚单位疫苗的研究提供了参考。

利用减毒沙门菌递送的柯萨奇病毒A16型VP1基因重组质粒的构建和鉴定

目的:构建能够稳定携带柯萨奇病毒A16型(CoxA16)VP1基因的重组减毒伤寒沙门菌并鉴定目的抗原的表达,研发利用减毒沙门菌递送的口服疫苗。方法:利用DNA重组技术,构建表达CoxA16 VP1蛋白的真核表达质粒,体外转染Vero细胞后检测VP1蛋白表达情况及抗原活性,并将该质粒通过电转化构建重组减毒伤寒沙门菌。结果:构建了表达CoxA16 VP1蛋白的重组质粒,转染vero细胞后检测到CoxA16 VP1蛋白的表达并具有抗原活性;获得能稳定携带该质粒的重组减毒伤寒沙门菌。结论:成功构建稳定携带柯萨奇病毒A16型(CoxA16)VP1基因的重组减毒伤寒沙门菌,为口服CoxA16疫苗的研究打下了基础。

合肥市0-14岁人群柯萨奇病毒A组16型和肠道病毒71型的感染状况调查

采用ELISA法检测0-14岁人群柯萨奇病毒A组16型（CoxA16）及肠道病毒71型（EV71）抗体水平。在入选的1000例儿童中,EV71 IgM总阳性率19．9%,EV71 IgG总阳性率47.7%,CoxA16 IgM总阳性率22．8%,CoxA16 IgG总阳性率51．3%；EV71 IgM总阳性率与CoxA16 IgM总阳性率比较,差异无统计学意义（χ^2=2．794,P〉0．05）；EV71 IgG总阳性率与CoxA16 IgG总阳性率比较,差异无统计学意义（χ^2=2．793,P〉0．05）。各年龄组比较,新生儿组IgG抗体阳性率较高,其EV71 IgG抗体阳性率41．5%,CoxA16 IgG抗体阳性率49．5%；婴儿组IgG抗体阳性率最低,EV71 IgG、CoxA16 IgG抗体阳性率分别为38．0%,43．5%；除新生儿组外,随年龄增加,人群EV71、CoxA16 IgG逐渐增高,组间差异有统计学意义（χ^2=27．04、19．98, P 〈0．01）；在 IgM 方面,人群EV71、CoxA16 IgM 随年龄逐渐升高,组间差异有统计学意义（χ^2=41．12、37．13,P〈0．01）。两种HFMD病原体的IgM、IgG抗体性别间差异无统计学意义（χ^2=0．51、1．77、0．36、2．12,P〉0．05）。

2011-2016年上海地区手足口病病原谱及柯萨奇病毒A组6型不同基因型感染细胞的差异研究

本文旨在分析2011—2016年上海地区手足口病病原谱的构成和主要病原体流行规律,为手足口病的疫情防控和重症预警提供参考。采集2011—2016年哨点医院临床诊断为手足口病的患儿标本,首先进行肠道病毒通用型核酸和分型检测,其次对2012—2016年核酸检测为柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus A6,CA6)阳性样本进行基因型重组检测,分离重组型和非重组型CA6株,比较两者生物学特性。结果显示,2011—2012年秋季上海地区手足口病主要致病原为肠道病毒71型(enterovirus type 71,EV71)和CA16;2012年秋季起CA6成为主要病原体;2013—2014年重组型CA6(recombinant CA6,R CA6)占一定比例;2015—2016年非重组型CA6(non-recombinant CA6,NR CA6)成为优势流行株。R CA6和NR CA6代表株在RD细胞中增殖良好,在KB、MRC-5和HEp-2细胞中未见明显增殖。比较R CA6与NR CA6代表株接种于RD细胞后细胞活性下降的动态变化,未见显著差异。本研究证实,CA6为近年来上海地区手足口病的主要病原体,R CA6和NR CA6的构成比逐年变化,提示持续监测手足口病主要病原体并了解其生物学特性,对上海地区手足口病的防控预警及疫苗研发具有重要意义。

江苏省2012年柯萨奇病毒A组16型基因特征分析

目的：了解江苏省2012年柯萨奇病毒A组16型（CA16）分离株VP1区基因特征。方法：选取江苏省2012年14株CA16病毒分离株,用1对特异性引物进行VP1区核苷酸序列扩增,对扩增产物进行测序,利用生物信息学软件对序列进行分析,结果与CA16参考株序列进行同源性比较并构建基因进化树。结果：14株CA16分离株VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为90.5%~100.0%和98.7%~100.0%,与CA16国际标准株G10的核苷酸和氨基酸同源性分别为75.5%~76.7%和91.6%~92.3%。江苏省2012年的CA16分离株全部属于B1基因亚型,同时包含B1a 和B1b 两条进化分支。结论：江苏省2012年有CA16病毒的B1a与B1b两种进化分支共同存在与循环,且呈现以B1b基因亚型为优势型别。B1a基因亚型为辅助型别的传播模式;无论是优势型别还是辅助型别,均各自呈现密切的亲缘关系。

柯萨奇病毒A组10型VP1蛋白线性中和表位的筛选和鉴定

柯萨奇病毒A组10型(CV-A10)是引起手足口病(HFMD)的常见病原体之一。应用重叠肽法筛选出覆盖CV-A10全长VP1区氨基酸序列的39条候选表位肽段,以间接酶联免疫吸附试验(ELISA)及微量中和抑制试验验证。结果发现,候选表位P6(CV-A10 VP1区第39~53位氨基酸)与CV-A10全病毒抗血清具有高反应性,且在3.91μg/mL的稀释质量浓度时仍具有中和抑制作用,为潜在中和表位。用P6肽免疫小鼠制备相应的抗血清,并以微量中和试验验证其保护能力,结果显示,P6抗血清的几何平均中和效价为1:8.97,可确定P6为CV-A10的中和表位。为了解P6序列在CV-A10型内的保守性,将P6的氨基酸序列与CV-A10各基因型代表株进行比对分析,结果显示,P6在CV-A10型内高度保守,表明P6为CV-A10的广谱性中和表位,可应用于CV-A10表位疫苗的研发。本研究旨在筛选鉴定CV-A10 VP1蛋白上的线性中和表位,为CV-A10表位疫苗的研发和HFMD的防控奠定基础。

柯萨奇病毒A组6型中国株的分子进化和时空传播分析

柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6,CV-A6)是手足口病的主要病原体,可引起非典型手足口病和中枢神经系统疾病,对儿童造成严重的疾病负担,尚无上市的疫苗和抗病毒药物.基于3288条CV-A6中国株VP1序列,利用Nextstrain平台的augur病原体生物信息分析包,构建了CV-A6的时间尺度分子进化树,确定了进化分支和分支突变,分析了分支突变与抗原表位之间的联系.进一步分析了CV-A6中国株各分支在中国七大地理区域的时空分布和优势分支,绘制了主要分支的时空传播路线.结果发现,CV-A6中国株主要分为B、C和D三个进化分支以及D2、D3a和D3b三个子分支,抗原表位处的突变形成了新的进化分支,促进了病毒的流行.华南和华东是CV-A6中国株的主要起源地,华南和华东相互输出、华东输出全国是中国株的主要传播模式.对CV-A6中国株的分子进化和时空传播分析,为CV-A6引起的手足口病等疫情的监测、预警和防控提供了重要支持.

柯萨奇病毒A组16型与肠道病毒71型致手足口病临床特点比较

手足口病是由多种肠道病毒引起的常见感染性疾病,其中肠道病毒71型(EV-A71)和萨奇病毒A组16型(CV-A16)是最常报道的病毒类型[1]。手足口病易发生在5岁以下儿童,大多数患儿表现出自限性疾病症状,典型症状包括发热、手脚皮疹、口腔内水疱。研究显示,一小部分手足口病可迅速发展,导致致命的神经系统和全身并发症,特别是在EV-A71相关的患儿中[2]。EV-A71型、CV-A16型手足口病患儿临床表现不同,疾病预后也不尽相同[3]。为了比较EV-A71型、CV-A16型手足口病患儿临床特征,本研究选取30例CV-A16型手足口病患儿和45例EV-A71型手足口病患儿,以观察2组不同病毒导致手足口病临床特征和血清学特征。

柯萨奇病毒B组1型感染动物模型研究进展

柯萨奇病毒B组1型(coxsakievirus B1,CVB1)能引起人类心肌炎、无菌性脑膜炎、新生儿全身感染等多种疾病,幼儿感染后病情较重甚至引发死亡,而目前尚无针对该病毒的疫苗及特效治疗药物。因此,建立并开展相关动物模型研究对CVB1感染后的机体免疫反应、病毒毒力机制、药物疫苗研发等问题的解决具有重要意义,同时也能为临床治疗提供部分依据。本文通过对CVB1病毒感染构建的不同动物模型进行总结,以期望为建立合适的动物模型以及开展相关研究提供参考。