柯萨奇病毒A组2型分离毒株序列及遗传进化分析

目的研究柯萨奇病毒A组2型(CVA2)分离株基因特征和遗传进化规律。方法利用分子信息学软件对GenBank核苷酸数据库收录CVA2分离株进行全长VP1区基因序列分析,构建系统进化树,测算分离毒株核苷酸和氨基酸同源性,计算核苷酸分子进化速率。采用Datamonkey在线软件预测正向选择位点,用Bioedit软件计算氨基酸置换熵值。结果共纳入CVA2分离株108株,主要为基因型D分离株;与原型株Fleetwood相比,各基因型分离株核苷酸和氨基酸同源性为79.3%～83.0%和94.6%～97.3%;基因型D分离株核苷酸进化速率为4×10^(-3)位点/年;选用SLAC模型发现1个正向选择位点,氨基酸置换熵值分析合计6个熵值大于0.6的位点。结论 CVA2分离株VP1区未出现明显的基因变异,与原型株亲缘性关系较远,需加强对CVA2分离毒株的实验室和分子流行特征监测。

柯萨奇病毒A组2型江苏分离株(JS16-80)全基因组序列分析

柯萨奇病毒A组2型(CV-A2)是引起手足口病和疱疹性咽峡炎暴发流行的重要病原体。本文选取中国大陆流行的D基因型代表毒株JS16-80/JS/CHN/2016(简写JS16-80)进行全基因组序列测定和分析,了解其基因特征,并进行重组和进化分析。结果提示,JS16-80在非结构蛋白P2和P3多区段均有出现重组现象,并且多个A组肠道病毒血清型参与了非结构蛋白的重组。本研究可帮助了解CV-A2的全基因组特征和重组特点,进一步为CV-A2重组对其进化和潜在致病力的影响提供基础数据。

一起聚集性发热疫情中柯萨奇病毒A组2型的鉴定及基因特征分析

肠道病毒(Enterovirus,EV)可以引起包括手足口病的全身各系统的病症,柯萨奇病毒A组2型(Coxsackievirus A2,CV-A2)在世界范围广泛流行。我们对2018年北京市丰台区一起聚集性发热疫情进行病原学鉴定和基因特征分析,为该类疫情的防控提供实验室支持。采集6例病例的咽拭子标本,进行EV实时荧光RTPCR检测,结果显示5份为EV阳性。使用人横纹肌肉瘤细胞进行病毒分离,分离到4株EV,通过EV分支分型方法,确定这4株EV为CV-A2。4株CV-A2分离株的VP1区核苷酸序列和VP4区核苷酸序列相似性高达99.5%~100%,基因进化树图分析显示,4株CV-A2与D基因型代表株处于同一分支,与2017年中国天津分离株MG926808核苷酸同源性最高,为99.1%~99.3%。根据以上结果,确定此次聚集性发热疫情是由CV-A2感染引起,且属于在我国流行的D基因型,提示我们在以后的工作应结合流行病学资料,加强对CV-A2的监测。

中国柯萨奇病毒A组2型的遗传进化分析

目的探讨中国柯萨奇病毒A组2型(coxsackievirus A2,CV-A2)毒株的遗传进化特征。方法收集中国CV-A2毒株的VP1区及全基因序列,采用MEGA 10.2.4软件构建系统进化树并开展氨基酸位点突变分析,采用SimPlot 3.5.1软件进行基因重组分析。结果共收集到118条VP1序列和26条全基因序列。CV-A2毒株主要来源于广东省,毒株数量自2011年开始迅速增多。基于VP1序列构建的进化树有7个分支,原型毒株为独立A组,多数CV-A2毒株聚集于G组。具有全基因组序列的CV-A2代表株的基因重组分析显示毒株间存在基因重组。另外,VP1氨基酸序列共有22个突变位点。结论中国流行的CV-A2毒株已发生较明显的基因重组和VP1区域氨基酸位点突变,监测CV-A2的演化对于手足口病的防控具有重要意义。

柯萨奇病毒A组2型的分离鉴定与遗传进化分析

目的对2017年山东省临沂市手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)患儿粪便标本进行病毒分离与鉴定,并对其基因特征进行分析。方法对HFMD患儿粪便标本进行核酸检测。用人横纹肌肉瘤细胞进行病毒分离。对病毒进行全基因组序列测定,通过与人类肠道病毒比较,对分离株进行系统发育分析和基因重组分析。结果自重症HFMD患儿粪便标本中成功分离到1株柯萨奇病毒A组2型(coxsackievirus A group 2 type,CoV-A2),命名为CoV-A2 SD17-430,系统进化分析进一步确定其基因型属于D2基因型。SD17-430衣壳蛋白编码区与CoV-A2国际原始株同源性高,在非结构蛋白编码区与CoV-A4(MH086949)和CoV-A14(KP036482)同源性高。结论与原始毒株相比,CoV-A2 SD17-430株发生了较大程度的遗传变异,其进化过程中可能与多个A组肠道病毒发生了基因重组。应继续加强对HFMD病原的全面监测,以便进一步了解其病原谱变化,为制定更有效的HFMD防控策略提供数据参考。

柯萨奇病毒A组2型VP1和VP3蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

目的制备柯萨奇病毒A组2型(Coxsackievirus A2,CV-A2)兔抗病毒蛋白质1(viral protein 1,VP1)和病毒蛋白质3(viral protein 3,VP3)多克隆抗体,为CV-A2相关研究制备定性、定量试剂。方法用逆转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)分别扩增CV-A2 VP1、VP3基因片段(612、420个碱基),并将其克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,获得pGEX-6P-1-VP1-ΔN43、pGEX-6P-1-VP3-ΔN8。将其转化大肠杆菌BL21,经异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达N端带有谷胱甘肽S移换酶(glutathione S-transferase,GST)标签的重组蛋白,并对其进行纯化。将纯化的GST-CV-A2-VP1-ΔN43、GST-CV-A2-VP3-ΔN8融合蛋白经背部皮下免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗血清,并通过ELISA、Western blot和间接免疫荧光法(indirect immunofluorescent assay,IFA)进行鉴定。结果重组表达载体构建成功,目的蛋白是以不可溶的包涵体存在。ELISA结果显示,CV-A2-VP1-ΔN43所制备的免疫血清最大稀释倍数为106时,免疫血清的A450 nm值为免疫前血清的2.0倍;CV-A2-VP3-ΔN8制备的免疫血清最大稀释倍数为107时,免疫血清的A450值为免疫前血清的6.0倍。Western blot结果显示,所制备的多克隆抗体可特异性识别CV-A2-VP1、VP3。IFA结果显示,抗GST-VP1-ΔN43、GST-VP3-ΔN8多克隆抗体可特异性识别CV-A2 VP1、VP3蛋白。结论成功制备了特异性识别原核表达的CV-A2重组蛋白及天然CV-A2病毒颗粒中的VP1、VP3蛋白的多克隆抗体。该抗体的成功制备为结构蛋白VP1、VP3的功能研究及病毒定性定量分析奠定了基础。

2021年云南省手足口病病例中柯萨奇病毒A2型的测序定型和基因特征分析

目的对2021年云南省昆明市及曲靖市手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)病例中非肠道病毒A组71型(enterovirus A71,EVA71)和非柯萨奇病毒A组16型(coxsackie-virus A16,CVA16)的其他肠道病毒进行VP4/VP2区及VP1区基因测序检测,并对检测到的CVA2 VP1区基因进行基因进化分析,为CVA2的预防及控制提供实验室证据。方法按《手足口病实验室手册(2018年版)》,对2021年昆明市和曲靖市送到云南省疾病预防控制中心HFMD实验室的标本进行前处理,提取病毒RNA后,先用MD91/OL68-1引物扩增肠道病毒VP4/VP2结合区基因并测序,编辑后的序列在GenBank上搜索确定病毒型别,再用肠道病毒A组引物分两段扩增CVA2 VP1区基因完整序列并测序,通过肠道病毒在线定型工具(Enterovirus Genotyping tool Version 0.1)进行病毒型别确认。按文献下载CVA2 VP1区基因型/亚型代表株序列,Mega5.2软件构建基因进化树,分析病毒基因特征。结果共检测749份非EVA71和非CVA16的肠道病毒标本,两地皆以A组肠道病毒为主,B组肠道病毒有少量报告,CVA16居病原谱第一位。其中CVA25份,检出率为0.67%(5/749),为HFMD的稀有病原。VP4/VP2和VP1两个基因片段的测序检测、定型结果一致。基因特征分析表明,昆明市3株为基因型A,曲靖市2株为基因型D。结论2021年云南省HFMD监测网络中昆明市和曲靖市CVA2的检出率为0.67%,CVA2在这两个市是HFMD的稀有病原。基因进化分析表明,两个基因型分别在昆明市和曲靖市传播但尚未引起流行。昆明市CVA2基因型A为国内首次报道。加强云南省CVA2的实验室监测特别是分子流行病学监测,对追踪和分析病毒传染来源具有重要意义。