江西省2010年柯萨奇病毒A组24型变异株的全基因组序列分析

急性出血性结膜炎(Acute hemorrhagic conjunctivitis,AHC)是目前人类最常见的眼病之一,柯萨奇病毒A组24型变异株(Coxsackievirus A24 variant,CV-A24v)是近年来报道引起该病的主要病原体。本研究选取10株来自江西省2010年AHC暴发疫情的CV-A24v,采用特异性引物扩增并测定其全基因组序列。对该10条CV-A24v的全基因组序列进行系统发育分析以及重组分析,计算本研究测定的江西10条以及GenBank中所有22条CV-A24v的全基因组序列的氨基酸置换熵值,并预测其正向选择位点。结果表明,在江西10条CV-A24v基因组序列中未检测到重组。基于全基因组序列构建的最大似然树表明江西10株CV-A24v属于GIV基因型,且分处于两条传播链。对上述32条CV-A24v序列的氨基酸置换熵值计算,共得到25个易突变位点(熵值>0.6),易突变概率最高的区段为2A区。基于Datamonkey中FUBAR和FEL模型分析,发现位于结构蛋白VP2区的234位氨基酸为两种模型共同获得的CV-A24v的正向选择位点。本研究分析了江西10株CV-A24v的全基因组序列特征,为CV-A24v引起的AHC防控工作提供了基础资料。

柯萨奇病毒A组16型中国分离株(Cox.A16 SHZH00-1)全基因组序列测定及分析

对分离自2000年中国深圳地区手足口病患儿粪便标本的柯萨奇病毒A组16型(CoxsackievirusA16,Cox.A16)病毒SHZH00-1株进行全基因组序列测定及分析后发现,Cox.A16SHZH00-1的基因组(未包括多聚腺苷酸尾)长度为7410bp,其中5′端非编码区(5′UTR)长为745bp,病毒基因组编码区全长6582个核苷酸,编码一个含2193个氨基酸残基的多聚蛋白,3′端非编码区长为83bp。Cox.A16SHZH00-1基因组的结构与Cox.A16亚洲地方株Tainan-5079-98(AF177911)十分相近,整个基因组的核苷酸同源性为97.5%,氨基酸同源性为98.8%;而与Cox.A16国际标准株G10(U05876)差别较大,两者核苷酸同源性仅为79.1%,氨基酸同源性为94.5%。Cox.A16SHZH00-1与两株肠道病毒71型SHZH03(AY465356)和BrCr(U22521)比较,核苷酸同源性均不超过80%。

中国柯萨奇病毒A组16型部分VP1区序列测定及系统进化分析

利用1999～2004年连续6年从中国深圳及北京地区分离的柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,Cox.A16)毒株的部分VP1区基因序列进行分析和研究,试图找出中国Cox.A16的种系进化规律和分型依据.6株Cox.A16病毒部分VP1区核苷酸和氨基酸同源性均较高,相互间核苷酸同源性为94.5%～98.0%,氨基酸同源性为97.8%～100%.6株中国分离株与Cox.A16国际参考株相比,部分VP1区核苷酸同源性高于78.2%,氨基酸同源性高于为93.3%.基因系统进化分析表明,中国大陆分离的6株Cox.A16与中国台湾流行株Tainan-5079-98(AF177911),与4株日本分离株、瑞典株及美国株GA95-2095(AF081613)、PA94-5753(AF081628)的关系均较近,核苷酸同源性大于93.3%.了解我国Cox.A16流行株的遗传学背景和种系进化关系,对有效地预防和控制Cox.A16流行有重要意义.

柯萨奇B组病毒的RACE扩增与序列分析

目的探讨3'RACE(rapidamplificationofcDNAends)技术检测柯萨奇B组病毒(CVB)的可行性,并建立相应的实验检测方法。方法首先自行设计柯萨奇B组病毒6个型别病毒基因组的一条通用引物sp1;然后从柯萨奇病毒(CVB1￣CVB6)感染的Hela细胞,提取总RNA,用引物sp1结合OligodT进行3'RACE扩增,将产物克隆到pGEM-T载体上,挑取阳性菌落进行序列测定,与标准株进行同源性比对。结果获得了柯萨奇B组病毒6个型别的3'末端扩增产物及其核苷酸序列,同源性分析的结果显示扩增毒株与标准株之间的核苷酸同源性在95%￣99%之间,氨基酸同源性在98%￣100%之间。结论设计的引物“sp1”是柯萨奇B组病毒6个型别病毒基因组的一条通用引物;该引物结合OligodT进行的3'RACE扩增可用于柯萨奇B组病毒的检测。

柯萨奇病毒A组6型分子进化与其相关手足口病流行的研究

手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD)是一种可由多种肠道病毒引起的以儿童急性感染为主的全球性传染病。近期,柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus A6,CVA6)引起的典型及非典型HFMD在多个国家及地区发病率明显上升且临床表现多样。而CVA6的分子进化、人群群体免疫屏障的建立等均可影响HFMD的暴发流行及病原谱的变迁。现就CVA6的流行、分子进化与重组、氨基酸变异、结构解析及血清流行病学研究作一概述,旨在为HFMD的防控提供思路。

柯萨奇病毒B组3型天津分离株的全基因组特征分析

目的对天津市柯萨奇病毒B组3型(Coxsackievirus B3,CVB3)分离株进行基因分型及全基因组特征分析,完善天津市CVB3病毒进化信息,为相关疾病的监测预警提供依据。方法对在天津分离到的5株CVB3毒株提取病毒RNA,通过反转录酶-聚合酶链锁反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)扩增病毒全基因组序列,使用二代测序方法进行全基因组序列测定,对病毒全基因组序列进行系统进化与重组分析。结果本研究中5株CVB3毒株开放阅读框1(open reading frame,ORF)均含有6555个核苷酸,编码2185个氨基酸,ORF2均由编码68个氨基酸大小的序列构成。核苷酸序列相似性为78.3%~100%,氨基酸序列相似性为95.7%~100%。而5株病毒与病毒原型株相比,核苷酸序列相似性为78.2%~79.1%,氨基酸序列相似性为94.9%~95.3%。5株病毒均在VP2蛋白上出现T151A位点突变,此外脑炎分离株还存在VP2蛋白K158E位点突变,1株生活污水分离株在5'非编码区存在C234T突变。5株病毒分属2个不同基因型,其中2016年的脑炎分离株属于D基因型,而2021年的外环境生活污水分离株属于E基因型,这也是我国北方地区首次报道E基因型CVB3。本研究的CVB3毒株在非结构蛋白区可能存在重组事件,其中脑炎分离株可能与1株柯萨奇病毒B组5型(Coxsackievirus B5,CVB5)毒株发生重组,而生活污水分离株与1株埃可病毒18型(ECHO virus 18,E18)毒株存在重组事件。结论天津市CVB3分离株分属D与E基因型,病毒基因组在非结构蛋白区可能存在重组事件。外环境生活污水中CVB3病毒基因组分析结果提示天津市人群有CVB3感染存在,同时其流行优势基因型可能发生了转变。

柯萨奇病毒A24型变异株VP1基因变异分析

目的:从分子水平探讨2002年-2008年柯萨奇病毒A24型变异株(Coxsackie virus type A24 vari-ant,CoxA 24v)VP1基因变异情况。方法:在GenBank基因库上下载26株2002年-2008年引起AHC的CoxA 24v病毒株VP1基因核苷酸和氨基酸全序列,分析各株之间核苷酸和氨基酸序列差异;并与CoxA24原型株Joseph株核苷酸和氨基酸序列进行比较。结果:各株之间VP1基因核苷酸全序列的同源性为94.3%～100%,氨基酸全序列的同源性为97.7%～100%;与Joseph株比较,核苷酸全序列的同源性为76.4%～77.9%,氨基酸全序列的同源性为90.5%～91.8%。结论:2002年-2008年CoxA 24v病毒株VP1基因在核苷酸水平上存在着一定的变异,在氨基酸层面上也存在变异,但变异幅度相对较小。

吉林省2018—2021年柯萨奇病毒A组16型病毒基因特征分析

目的探讨2018年、2019年和2021年流行于吉林省的柯萨奇病毒A组16型肠道病毒流行特征、种系进化及基因变异特征。方法收集2018年、2019年和2021年吉林省手足口病例临床标本,通过病毒分离筛选出60株CVA16的阳性毒株,并对其VP1编码区全基因组核苷酸序列进行测定和分析。结果60株CVA16分离株中有15株为B1a基因亚型,45株为B1b基因亚型;CVA16分离株氨基酸序列的14、23、164、235、251及266位点发生了氨基酸突变。结论CVA16为吉林省手足口病的主要病原体之一,15株CVA16分离株为B1a基因亚型,45株CVA16分离株为B1b基因亚型,与2008年青海株相比共发生了6处氨基酸位点突变。

2018—2019年北京市柯萨奇病毒A组16型分子流行病学研究

目的 对2018—2019年北京市柯萨奇病毒A组16型(coxasckievirus A16, CVA16)结构蛋白VP1序列进行变异分析,了解其与手足口病(hand-foot-mouth disease, HFMD)流行的关系。方法 对2018—2019年首都医科大学附属北京佑安医院HFMD患儿标本进行逆转录聚合酶链反应(reverse triscription polymerase chain reaction, RT-PCR),测序扩增产物,获得CVA16的VP1全长序列,结合GenBank中北京及国内外CVA16代表性毒株构建系统进化树,分析VP1的氨基酸置换熵值和氨基酸的年替换比例。结果 分子进化分析表明,2018—2019年首都医科大学附属北京佑安医院26株CVA16全部为B1基因型。其中,有16株B1b型,占61.54%;10株B1a型,占38.46%。北京B1a型毒株明显分属早期和近期2个进化分支。B1a型近期分支与国内近期流行B1a型毒株、越南和泰国流行株的亲缘关系较近。通过分析VP1氨基酸置换熵值,发现2007—2019年北京CVA16 B1b型和B1a型毒株的易突变位点不同,分别为VP1-23;VP1-164和VP1-251。2012年起B1b型毒株VP1-23位点的蛋氨酸逐渐替代亮氨酸成为优势氨基酸;而近年北京B1a型毒株呈VP1-164K251I模式,与近年国内其他地区B1a型流行株及越南,泰国毒株一致。结论 2018—2019年北京市CVA16主要流行基因型为B1b型,新出现的B1a型毒株的易突变氨基酸模式与B1b型及早期B1a流行株不同,近期B1a型毒株可能由越南和泰国等国输入并在国内传播、流行。今后应加强对CVA16不同基因型及不同进化分支的动态监测和精细分析,为疫苗设计等疾病防控策略的制定和调整提供科学依据。

南宁市婴幼儿散发性腹泻中诺如病毒基因Ⅱ组4型变异株的流行特征

目的了解南宁市婴幼儿散发性腹泻病例中诺如病毒（Norovirus,NV）基因Ⅱ组（GenogroupⅡ,GⅡ）4型变异株的组成和流行特点。方法采集2010年1月-2011年12月南宁市某医院门诊354例婴幼儿腹泻病例的粪便标本,应用实时荧光逆转录-聚合酶链反应检测NV核酸及其基因组,阳性标本进行核苷酸序列测定和遗传进化分析。结果 354份标本中,NV核酸检测阳性101份,阳性率28.5%,全部属于GⅡ。对测序成功的84株NV的核苷酸序列进行分析,77.4%属于GⅡ.4型（65株）,其余为GⅡ.2型（7株）、GⅡ.14型（4株）、GⅡ.7型（3株）、GⅡ.3型（2株）、GⅡ.6型（2株）和GⅡ.12型（1株）。65株GⅡ.4型中,60株（92.3%）为2006b变异株,5株（7.7%）为2010变异株。结论 GⅡ.4型是南宁市婴幼儿中NV所致散发性腹泻的最主要基因型,其中2006b变异株占优势。首次在本地区检测到2010变异株,且该毒株的流行呈上升趋势。有必要加强监测,以及时掌握GⅡ.4型变异株的流行变迁。

柯萨奇病毒A组16型连续四年分离株基因差异研究

目的了解同一地区不同年份CA16基因变异状况。方法在同一地区用同一方法分离CA16；随机抽取第一代细胞分离到的病毒株，测定VPl区基因序列，应用DNAstar和DNAman分子生物学软件对VPl基因进行分析比较。结果在2008年一2011年从104份标本中分离到47株CA16，病毒分离阳性率为45．2％；4年来，8株CA16核苷酸同源性为90．3％-100．0％，其中2010年分离的二株病毒核苷酸同源性为90．3％；8株CA16氨基酸同源性为97．9％-100．0％。结论由于在同一地区不同时间分离的CA16基因存在较大差异，因此选择CA16疫苗株时，应进行各种基因型及同一基因亚型中氨基酸变异较大毒株的交叉保护试验。

一株Vero细胞适应的柯萨奇病毒A组10型毒株遗传稳定性研究

目的探讨一株手足口病相关柯萨奇病毒A组10型(coxsackievirus A10,CV-A10)毒株R6-19/XY/CHN/2017在Vero细胞中的适应性,及其连续传代的遗传稳定性。方法对R6-19/XY/CHN/2017毒株在Vero细胞上进行连续适应传代培养后,对适应前病毒及适应后的第1、5、10、15代次毒株的致细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)、病毒感染性滴度、全基因组核苷酸序列及氨基酸序列等进行比较分析。结果该毒株能较好地在Vero细胞上适应,不同代次的感染性滴度在7.85 lgCCID50/ml^8.17 lgCCID50/ml。与适应前毒株比较,其5′UTR及编码区共有7个碱基发生改变,VP4和VP1编码区分别有1、3个氨基酸发生改变;而适应后病毒各代次在CPE、病毒感染力特点等无明显区别,且各代次全基因核酸序列中,只有第15代的VP1蛋白编码区发生一个碱基突变。结论 CV-A10株R6-19/XY/CHN/2017能在Vero细胞较好地适应,并具有良好的遗传稳定性,这将为后续CV-A10疫苗的研发和相关机制研究提供参考。

柯萨奇B组3型病毒中国分离株VP4、3D基因序列及系统发生树分析

目的研究柯萨奇B组3型病毒(CVB3)中国分离株结构蛋白VP4、非结构蛋白3D基因序列及变异性。方法在HeLa细胞中增殖病毒,用RT-PCR扩增目的基因片段,与pMD18-T载体连接,PCR初步鉴定后测序,进行序列同源性及系统发生分析。结果CVB3中国分离株VP4基因含207个碱基,编码69个氨基酸,与Nancy株氨基酸同源性为97.10%;3D基因含1386个碱基,编码462个氨基酸,与Nancy株氨基酸同源性为97.62%。在系统发生中,CVB3中国株VP4基因、3D基因均与Nancy株聚簇。结论CVB3中国分离株VP4和3D基因长度与Nancy株一致,进化上属同一分支。

2015~2017年吉林省柯萨奇病毒A组16型基因特征分析

目的分析2015~2017年吉林省流行的柯萨奇病毒A组16型(coxasckievirus A16,CVA16)的流行特征、种系进化及基因特征。方法收集2015~2017年吉林省手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)患儿的咽拭子或粪便标本,通过病毒分离筛选出CVA16阳性毒株,并对其VP1编码区基因组核苷酸序列进行测定和分析。结果24株CVA16流行株均为B1b基因亚型,与甘肃株核苷酸和氨基酸序列同源性分别为94.6%~96.1%和99.6%~100%;24株CVA16流行株氨基酸序列的第11、14、23、221及266位点发生了氨基酸突变。结论CVA16为吉林省HFMD的主要病原体之一,24株CVA16流行株与2007年甘肃株亲缘关系最近,与2008年青海株相比,共发生了5处氨基酸位点突变。

吉林省2013年柯萨奇病毒A组16型基因特征分析

目的了解吉林省2013年柯萨奇病毒A组16型（CVA16）流行特征、种系进化及基因分型。方法对吉林省2013年分离获得的9株CVA16阳性毒株的VP1编码区核苷酸进行扩增及序列测定,使用Mega 4.0和Bioedit软件进行序列分析。结果 9株CVA16流行株中,1株为B1a基因亚型,与3株B1a代表株相比,其核苷酸和氨基酸的同源性分别为95.6%~96.8%和99.6%;8株为B1b基因亚型,与3株B1b代表株相比较,其核苷酸和氨基酸的同源性分别为94.1%~96.1%和98.3%~100%。2013年流行株与代表株相比共发生了9处氨基酸位点变异,其中8株B1b亚型中有6株在第23位氨基酸位点发生了亮氨酸→蛋氨酸的变异。结论 B1b是引起吉林省2013年CVA16流行的主要基因亚型,并且有大部分CVA16流行株在第23氨基酸位点发生了共同变异。

三株柯萨奇A10型候选疫苗株生物学特性及免疫原性研究

近年来CV-A10已成为手足口病的最主要的病原体之一。本研究对3株不同CV-A10毒株进行生物学特性及体液免疫原性比较分析,筛选最适的CV-A10灭活疫苗候选株。将2014年荆州(JZ)分离株CV-A10-L12、2019江苏沛县(PX)分离株CV-A10-195和CV-A10-300,作为候选疫苗株经10层Vero细胞工厂培养,蔗糖垫底离心、蔗糖梯度离心、氯化铯等密度梯度离心后收获病毒颗粒。对不同候选毒株的滴度、病毒实心颗粒(FP)和空心颗粒(EP)的产量和比例、氯化铯密度、形态及结构蛋白等生物学特性进行比较分析。将纯化后病毒颗粒经甲醛灭活后,免疫Balb/C小鼠评价免疫原性。三株CV-A10候选疫苗株细胞工厂培养、纯化后,收获了高纯度、含病毒结构蛋白、形态完整的EP、FP颗粒。按照细胞培养自然EP和FP比例混合后,免疫6周龄Balb/C小鼠。以同源和非同源的四株CV-A10毒株作为中和毒种,测血清中和抗体滴度,评价3个疫苗候选株的体液免疫原性。CV-A10-195/PX/2019株病毒颗粒产量及免疫原性高于CV-A10-300/PX/2019株,高于CV-A10-L12/JZ/2014株。CV-A10-195/PX/2019株作为三株CV-A10毒株中最适疫苗候选株,可用于单价CV-A10或含CV-A10的多价疫苗的研发。

一株引起手足口病重症感染的柯萨奇B3病毒变异株的生物学分析

目的分析1株柯萨奇病毒B3型（CoxB3）新分离株FY-19的基因特性和生物性状，为进一步探讨其引起手足口病（HFMD）重症表现的机理提供线索。方法采用Lim Benyesh-Melnick组合血清方案对1株分离自2008年中国阜阳地区重症HFMD男性患儿的FY-19病毒株进行血清学鉴定，以全基因序列测定分析该病毒株的遗传特征，结合病毒增殖动力学和噬斑形成实验分析FY-19病毒的生物学特性，通过乳鼠脑内病毒接种研究该毒株的致病性特征。结果血清学鉴别确定FY-19毒株为CoxB3病毒；与标准株相比，FY-19株在3’、5’非编码区和编码区的差异分别为达到23．0％、16．5％和32．1％，与我国分离于非HFMD患者的毒株相比也存在较大差异（非编码区和编码区的差异分别为13．5％和25．0％）；FY-19株能在14h内达到增殖高峰，且其在小鼠体内引起心肌病变的致病性显示出明显的致死能力。结论FY-19株的生物学特性与标准毒株之间存在较大的差异，对该变异株的进一步分析将为了解其在HFMD的特殊的致病机理提供帮助。

2002年福建省急性出血性结膜炎病原分离和鉴定

[目的 ]查明 2 0 0 2年我省急性出血性结膜炎 (AHC)流行的病原。[方法 ]采集福州和漳州市临床诊断为AHC的患者眼拭子 5 7份、双份血清 7份。分别用Hep 2和Vero细胞对标本进行病原分离 ;用免疫血清微量中和试验对分离出的毒株进行鉴定 ;用诊断血清鉴定的 4株病毒 ,对 7例患者的双份血清进行中和抗体效价测定。[结果 ]从 5 7份眼拭子标本中分离出 47株 (阳性率 82 5 %) ;经诊断血清微量中和试验鉴定 ,均为柯萨奇病毒A2 4变异株 (CA2 4v) ;7例患者双份血清经微量中和试验测定 ,中和抗体均呈≥ 4倍增长。[结论 ]CA2 4v是引起 2 0 0

杭州市急性出血性结膜炎的柯萨奇病毒分离鉴定及其VP1序列分析

目的:2010年杭州市发生了两起急性出血性结膜炎(Acute Hemorrhagic Conjunctivitis,AHC)疫情,为鉴定引起疫情的致病病原体。方法:采集了9份眼结膜拭子标本,使用实时荧光PCR或RT-PCR法分别检测临床标本中腺病毒、人肠道病毒70型(Human Enterovirus 70,HEV70)和柯萨奇病毒A组24型变种(CoxsackievirusA24 variant,CVA24v)的基因。使用Hep-2细胞和RD细胞分离病毒。对分离到的CVA24v毒株进行全长VP1区扩增和核苷酸序列测定和分析。结果:实时荧光PCR或RT-PCR法检测临床标本,其中有6份检测结果为CVA24v阳性,阳性率为66.7%,而腺病毒和HEV70检测结果均为阴性。使用Hep-2细胞共分离到5株病毒,通过分子定型均鉴定为CVA24v。进化树图显示,两起疫情是由两个病毒传播链引起的。结论:本研究成功地分离到5株CVA24v毒株,为今后杭州市AHC的防治及研究奠定了一定的基础。