一株柯萨奇病毒A组4型云南株的全基因组分析

目的了解中国云南2022年分离到的一株柯萨奇病毒A组4型(Coxsackievirus A4,CVA4)病毒株的全基因组序列特征,探讨CVA4系统发育特征。方法对CVA4分离株194R3/YN/CHN/2022进行全基因组序列扩增测序,并应用Mega 7.0、Geneious 9.1.4及Simplot 3.5.1等软件拼接比对,构建CVA4分离株系统进化树,分析其全基因组序列特征。结果194R3/YN/CHN/2022分离株为CVA4,属于C2基因亚型,与我国近年的优势基因亚型一致。重组分析显示,在P2、P3非结构编码区,CVA4病毒分离株可能与EVA114原型株V13-0285、CVA16原型株G-10、CVA14原型株G-14发生过重组。结论云南分离的194R3/YN/CHN/2022属于CVA4中国流行的C2基因亚型,但发生了一定变异。

禽腺病毒血清4型Hexon蛋白的转录组学功能分析

禽腺病毒血清4型(FAdV-4)是引起禽肝炎-心包积液综合征的重要病原,严重危害我国养禽业的发展。研究表明,FAdV-4六邻体(Hexon)蛋白是决定病毒毒力和致病性的重要因素之一。为了进一步探究Hexon蛋白在FAdV-4感染中的重要作用,本试验以鸡肝癌细胞(LMH)为研究模型,利用转录组测序技术对外源表达Hexon所诱导的差异表达基因进行筛选。结果显示,与对照组相比,外源表达Hexon试验组共筛选到445个差异基因表达上调,36个差异基因表达下调。其中,BAG3、JUN、IL8L1、CCL4和THBS1等基因之前已被报道与FAdV-4感染相关,但HSPB9、HSP90AA1、HSPA8、HSPA2、DCN、ELOVL3和SBK2等基因在FAdV-4感染中的作用还未被揭示。GO富集分析结果显示,下调的差异基因主要与早期内体和蛋白酶体附属复合体相关,而上调的差异基因主要与质膜、细胞外表面区域和超分子纤维相关。KEGG通路富集分析结果显示,差异表达基因主要富集在MAPK、Wnt和VEGF等信号通路。此外,通过蛋白质相互作用网络分析发现,HSP90AA1、HSPA8、JUN和DCN等多个关键蛋白位于整个网络中心且已被报道与多种病毒复制密切相关。综上所述,本研究通过转录组测序筛选出一系列由外源表达Hexon诱导的差异表达基因,为控制FAdV-4感染提供了新的靶点和理论依据。

猪圆环病毒Ⅱ型感染3D4/2细胞的转录组学分析

【目的】通过转录组测序筛选猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus typeⅡ,PCV2)感染猪肺泡巨噬细胞系(3D4/2)差异表达基因,为了解PCV2感染宿主免疫细胞机制和抗PCV2感染药物研发奠定基础。【方法】用感染复数(multiplicity of infection, MOI)为1的PCV2 NJ2002株处理3D4/2细胞,利用Illumina NovaSeq 6000测序平台进行转录组测序。使用DeSeq 2.0软件进行差异表达基因分析,并对差异表达基因进行基因本体论(GO)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)功能分析及转录因子靶向分析,选取免疫及凋亡相关基因进行实时荧光定量PCR验证,用Western blotting技术检测细胞内磷脂酰肌醇激酶(PI3K)及磷酸化胞内磷脂酰肌醇激酶(p-PI3K)、蛋白激酶B(Akt)和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白表达水平。【结果】转录组测序结果显示,与对照组相比,PCV2感染组共获得713个差异表达基因,其中313个上调,400个下调。GO功能和KEGG通路富集分析显示,差异表达基因与免疫应答等相关,主要富集在细胞外基质受体互作通路、新陈代谢通路、HIF-1信号通路、病毒致癌作用、PI3K-Akt等信号通路。实时荧光定量PCR结果与转录组测序的基因表达水平保持一致。Western blotting检测结果显示,PCV2感染3D4/2细胞24 h后PI3K和Akt蛋白磷酸化水平显著升高(P<0.05)。转录因子靶向分析表明,差异表达基因与核转录因子Y亚基β(NFYB)和ETS转录因子(ELK4)联系紧密。【结论】PCV2可能通过PI3K-Akt信号通路影响下游炎症信号通路和凋亡信号通路增强自身复制能力。NFYB和ELK4转录因子在PCV2感染过程中可能发挥重要作用,可考虑作为抗PCV2药物靶点。研究结果为深入了解PCV2感染宿主免疫细胞机制和相关药物开发提供了理论基础。

深圳地区2014年柯萨奇病毒A组4型VP1区基因特征分析

目的对2014年深圳市罗湖区一起疱疹性咽峡炎疫情的病原体进行鉴定,并对鉴定的柯萨奇A4病毒（CVA4）的VP1基因进行序列测定和遗传进化特征分析。方法采集疫情中患儿的咽拭子样本8份,提取病毒核酸,利用荧光RTPCR法检测样本总肠道病毒（EV）、人肠道病毒71型（EV71）、柯萨奇病毒A组16型（CVAl6）、CVA4、CVA6和CVAl0等,对CVA4阳性样本采用RT-PCR方法扩增其VP1区全长序列,并进行核苷酸序列测定和遗传进化分析。结果引起此次疱疹性咽峡炎暴发的病原体为GIB亚型的CVA4病毒。同源性分析显示,深圳2014年CVA4病毒株与云南2004年分离株（AB268278）、以及台湾2008年分离株（AB571570）核苷酸同源性达94.1%~94.8%,而与CVA4原型株HIGHPOINT同源性最低,为84.3%。在氨基酸序列上与台湾2006年分离株（AB571563）、吉林2006年分离株（JQ715709）同源性最高,达99.3%;而与山东省2006年分离株（GQ253375）同源性最低,为97.1%。相比深圳2009年分离株（HQ728260）,共有6个氨基酸突变位点：N22S,T34A,N63S,A165D,T200A和V126A;而进化树分析显示,深圳2014年CVA4病毒株虽属于CVA4的GIB亚型,但在进化走势上,已经不同于GIB亚型中其他地区早期的分离株。结论 2014年深圳地区CVA4病毒属于GIB亚型,但在VP1区变异较大。

2012年江苏省柯萨奇病毒A组14型分离株全基因序列分析

目的探讨2012年江苏省手足口病(HFMD)病原体CVA14病毒的全基因序列特点。方法采集江苏省邳州市2012年HFMD患儿的咽拭子或肛拭子样本,分离培养得到2株CVA14病毒,利用RT-PCR扩增CVA14全长基因。利用DNAStar软件包的Meg Align进行核苷酸序列分析,构建系统进化树。结果扩增得到覆盖CVA14全基因组的3个片段,拼接后为CVA14全基因组,分别命名为PZ05Y/JS/2012和PZ15G/JS/2012。同源性分析结果显示,这2株分离株之间同源性为99.4%,原型株(G-14)的核苷酸同源性为84.4%。进化树结果显示,所有的CVA14形成A、B和C共3个分支。结论获得了江苏省CVA14的全基因序列,分析了该毒株的进化特点,补充了中国CVA14病毒的基因信息。

中国大陆地区柯萨奇病毒A组4型VP1区基因特征分析

目的分析中国大陆地区柯萨奇病毒A组4型(Coxsackievirus A4,CV-A4)流行毒株基因特征和进化规律。方法利用Mega6.0软件对GenBank核苷酸数据库收录的分离于中国大陆地区CV-A4毒株VP1区基因序列进行分析,构建系统进化树,并计算分离毒株核苷酸和氨基酸同源性。结果纳入中国大陆地区CV-A4毒株合计116株,中国大陆地区16个省份CV-A4流行毒株潜在的优势基因型为F。与原型株High Point相比,中国大陆地区CV-A4毒株核苷酸和氨基酸同源性分别为79.9%～84.1%和92.5%～98.7%,收录中国大陆地区CV-A4毒株间核苷酸和氨基酸同源性分别为82.6%～100.0%和91.5%～100.0%。结论针对中国大陆地区CV-A4毒株流行特征和进化规律,采取有效措施防控手足口病。

柯萨奇病毒A16型VP1-VP4基因克隆及其表达产物的抗原相关性分析

目的克隆并表达柯萨奇病毒A16型VP1-VP4蛋白基因,初步分析其抗原相关性。方法抽提病毒RNA,经RT-PCR方法分别扩增出VP1-VP4蛋白基因片段,经克隆后,在QIA表达系统中表达,表达产物经8 mol/L尿素洗涤及镍柱亲和层析纯化后,用柯萨奇病毒A16型病毒免疫兔血清及肠道病毒71型病毒免疫兔血清对重组蛋白进行Western blotting及ELISA分析其抗原相关性及交叉反应性。结果成功构建的重组质粒pQE30a/VP1-VP4并经IPTG诱导,重组蛋白VP1-VP4高效表达并纯化成功,经Western blotting及ELISA证实重组蛋白VP1-VP4可以被CVA16免疫兔血清特异识别,部分与肠道病毒71型免疫血清存在交叉反应。结论在大肠杆菌M15中高效表达出柯萨奇病毒A16型VP1-VP4蛋白,经纯化产物具有较强的抗原反应性。

柯萨奇B4病毒非结构蛋白P_2C重组质粒的构建

目的:构建柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C重组质粒。方法:用RT-PCR技术,从柯萨奇B4病毒中钓取非结构蛋白P2CcDNA片段,克隆入PUCm-T载体,转化大肠杆菌DH5α,构建重组质粒。结果:以柯萨奇B4病毒的总RNA为模板,扩增出987bp大小的片段,克隆入PUCm-T载体,用BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定,与非结构蛋白P2C的PCR扩增产物片段大小一致。结论:成功地构建了柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C重组质粒。

厦门市11株柯萨奇病毒A4型分离株全基因组序列分析

目的通过分析11株CVA4病毒毒株的全基因序列,揭示其基因进化及变异特征。方法将PCR检测阳性且Ct值<25的样本进行病毒分离培养,获得的毒株提取核酸(RNA)后采用高通量宏基因组测序方法进行序列测定,将质控合格的测序数据进行基因组组装;获得的基因组序列提交至肠道病毒分型网站获得毒株血清型,同时与公共数据库下载的其他国家或地区的CVA4毒株序列通过MegAlign、Mega X、Simplot3.5.1软件分别进行相似性分析、系统进化树分析和重组分析。结果11株毒株全基因组序列长度在7434~7419 bp之间,血清型均为CVA4,核苷酸与氨基酸序列相似性分别为91.7%~99.3%和98%~100%;与原型株序列相比,核苷酸序列何氨基酸序列相似性分别在84.3%~84.7%和97.1%~97.3%之间;与其他参考序列相比,核苷酸与氨基酸序列相似性分别为80.8%~98.8%和96.9%~99.6%;全基因组遗传进化分析表明,其与中国其他地区CVA4毒株序列属同一遗传分枝;根据VP1基因进化树分析,本研究的毒株与中国其他地区毒株属于C基因型中的C2亚型;重组分析结果显示,11株CVA4与其他毒株无明显重组特征,但其中1株的部分区段序列与CVA2毒株序列一致性可达97.2%,剩余毒株与既往重组株相似度可高达98.6%。结论11株CVA4毒株为中国主要流行基因型,虽然与其他毒株无重组现象,但是与其他型别及以往重组株相似性较高,故在工作中需加强毒株重组监测,为手足口病的预防控制工作提供数据支撑。

安徽省2020年柯萨奇病毒A组4型分离株全基因组序列分析

目的了解安徽省柯萨奇病毒A组4型(coxsackievirus A4,CV-A4)毒株全基因组序列变异及分子进化情况,为今后手足口病的病原学监测和科学防治提供理论依据。方法采用一代测序法对2020年5株CV-A4分离株进行全基因组测序。运用MEGA11.0对5株CV-A4分离株,32株CV-A4代表株和肠道病毒A71型(Enterovirus A71,EV-A71)原型株BrCr基于VP1区构建系统进化树,对分离株以及肠道病毒A组(enterovirus A,EV-A)原型代表株基于P1、P2、P3区分别构建系统进化树;选用DNAStar进行毒株VP1区氨基酸序列比对,使用BioEdit7.2进行氨基酸置换熵分析并作氨基酸位点熵值图,使用SimPlot3.5和RDP4对CV-A4分离株和EV-A原型代表株进行重组分析,使用DnaSP6软件进行分离株和参考代表株的选择压力分析。结果系统进化树显示:分离株属于C2亚型,与中国内地地区流行的CV-A4毒株属于同一分支,C2亚型分支的毒株氨基酸序列同源性为97.30%~100%,分离株同原型相比,均有6个氨基酸变异位点。选择压力分析表明C2亚型的CV-A4毒株受负选择压力的影响,置换熵分析编码区氨基酸序列有25个易突变位点,占比1.14%,毒株进化主要依赖重组。重组分析表明分离株在P2、P3区域与多种EV-A原型株发生不同区段的重组,与CV-A5原型株重组区段较长,尤其在3A-3C区段,P1是相对保守的区段。结论安徽省CV-A4在P2、P3区与其他EV-A原型株发生频繁重组事件,应对安徽省CV-A4的分子进化研究继续保持密切关注。

柯萨奇病毒B4型VP1蛋白的生物信息学分析

目的:分析柯萨奇病毒B4型(coxsackievirus B4,CVB4)的结构蛋白VP1的分子结构,预测其生物学信息。方法:应用Bioedit、DNAstar、ABCpred软件,以及免疫表位数据库网站IEDB和生物信息学门户ExPASy提供的多种在线工具,对CVB4 VP1蛋白的氨基酸序列进行分析。结果:CVB4 VP1蛋白的等电点8.31,相对分子量32.1 kD,为亲水性、不稳定蛋白质;有36个可能的磷酸化位点,无信号肽和跨膜螺旋结构,二级结构以无规则卷曲为主;预测有5条优势线性B细胞表位。结论:通过对CVB4 VP1蛋白的生物信息学分析,得到了VP1蛋白的理化性质,相关结构的功能特征及线性B细胞表位等生物信息资料。

柯萨奇病毒A组16型VP1蛋白的原核表达及纯化

[目的]原核表达并纯化柯萨奇病毒A组16型(CVA16) VP1蛋白。[方法]根据Gen Bank CVA16 VP1基因序列,合成VP1全基因,连接到载体p ET30a,构建原核表达质粒p ET30a-CVA16-VP1。将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,Ni-NTA亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组蛋白。[结果]成功构建重组质粒p ET30a-CVA16-VP1,表达蛋白经SDS-PAGE显示分子量约为38.7 k Da,目的蛋白以包涵体形式存在,蛋白经复性、纯化,纯度达90%以上;经Western Blot检测,证实表达的蛋白为VP1蛋白。[结论]成功获得了高纯度的VP1蛋白,为此抗原用于临床诊断打下了基础。

病毒性心肌炎差异表达蛋白MYL4的筛选鉴定及表达研究

目的:调查心肌肌球蛋白轻链4(myosin light polypeptide 4,MYL4)在病毒性心肌炎损伤中的作用。方法 :随机将Balb/c小鼠分为实验组(n=30)和对照组(n=10),实验组用于建立柯萨奇病毒B3病毒性心肌炎小鼠模型,分别在病毒感染后第3、7、14天留取心脏及血清标本。利用差异蛋白质组学的方法鉴定了部分的病毒性心肌炎差异表达蛋白,并对其中一个分子MYL4在病毒性心肌炎发病中的作用进行研究。结果:质谱鉴定6个差异表达分子分别为:MYL4、热休克蛋白B1、异柠檬酸脱氢酶a亚单位、电压依赖的阴离子通道蛋白、蛋白酶体a亚单位1型和巨噬细胞封端蛋白。Western blot及ELISA验证发现MYL4在病毒性心肌炎小鼠心脏组织及血清中表达明显升高(P<0.01),且ELISA结果显示MYL4的表达与疾病严重程度呈正相关(r=0.97,P<0.00)。结论:MYL4在病毒性心肌炎组织及血清中表达升高,参与了病毒性心肌炎的发生发展。

2023年自贡市一起柯萨奇病毒A4引起的幼儿园疱疹性咽峡炎暴发疫情

目的 了解柯萨奇病毒A4(coxsackievirus A4,CV-A4)引起的疱疹性咽峡炎暴发疫情的流行病学特征及排毒时长,为疱疹性咽峡炎暴发疫情防控提供数据支撑。方法 2023年5月对自贡市金苹果幼儿园1起疱疹性咽峡炎暴发疫情进行调查处置,采集幼儿园小2班教师2份、全体儿童咽拭子9份和环境样本10份,经RT-PCR肠道病毒核酸检测,对阳性儿童再次连续采样(间隔1周)至核酸检测阴性时终止。结果 本次疫情共发现病例14名,罹患率为53.9%(14/26)。患儿临床症状以发热(100.0%)、咽痛(78.6%)及咽峡部疱疹(71.4%)为主,咽拭子和环境样本中均检出肠道病毒核酸阳性,分型为CV-A4。排毒时长中位数为21(95%CI:14.0~28.0)d,生存分析检验显示病例与隐性感染者、男性与女性排毒时长差异无统计学意义。结论 本次疫情为一起CV-A4型引起的幼儿园疱疹性咽峡炎暴发疫情,排毒时间较长,建议幼儿园、学校在节假日后强化晨午检工作,持续对儿童进行追踪随访,卫生与教育部门协同做好流行季节肠道病原学监测。

苏州市一起聚集性人感染柯萨奇病毒A组4型基因特征

目的 对苏州市一起人呼吸道感染不明病原的聚集性疫情病例咽拭子样本进行初步病原分子鉴定,为疫情处置提供技术支撑。方法 采集该起疫情病例咽拭子标本,实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Real-time reverse transcription polymerase chain reaction, Real-time RT-PCR)方法检测可引起聚集性呼吸道感染疫情的常见病原(甲/乙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒、鼻病毒、偏肺病毒和腺病毒)核酸,同时采用FilmArray全自动医用PCR分析系统进行多病原筛查。对病例咽拭子标本进行高通量测序,并用特异性引物探针检测柯萨奇病毒A组4型(coxsackievirus A4, CV-A4)进行验证。结果 该起疫情采样送检的18份咽拭子样本经Real-time RT-PCR方法检测,其中14份样本柯萨奇A4型病毒检测阳性。Real-time RT-PCR和高通量基因测序方法在病例咽拭子标本中均检出柯萨奇A4型病毒特异性基因片段。序列分析表明苏州该起疫情病毒株全基因组序列与NCBI数据库的MN964082病毒核酸一致性最高,为98.11%;VP1蛋白氨基酸序列与原型株AY421762一致性为98.03%,发现6个位点突变(T23V、A34T、S102A、A200T、I262V和Y285H)。结论 CV-A4可引起聚集性呼吸道感染疫情,对学龄儿童等免疫力较弱的人群应加强健康监测以便疫情早期处置。

2021年南京市手足口病流行特征及柯萨奇A组4型VP1区基因特征分析

目的了解南京市手足口病(HFMD)流行特征,分析柯萨奇病毒A组(CVA)4型基因特征。方法收集2021年来自南京市12个区的监测样本,使用实时荧光定量PCR方法检测肠道病毒并分型,对排除CVA6、16、10型和肠道病毒(EV)71型阳性的其他未分型肠道病毒,用反转录·聚合酶链反应(RT-PCR)的方法扩增VP4-VP2区,双向测序确定基因型,最后巢式扩增CVA4型的VP1区,确定其基因亚型。结果2021年南京市手足口病呈季节性流行,不同月份之间的肠道病毒阳性率差异有统计学意义(χ^(2)=80.06,P<0.05)。易感人群为3~<6岁儿童,该年龄段阳性数占总阳性数的57.05%(178/312)。不同年龄段之间的肠道病毒阳性率差异有统计学意义(χ^(2)=73.70,P<0.05)。地区分布中,肠道病毒阳性率占前三位的依次是玄武区94.74%(18/19)、浦口区94.00%(47/50)和江北新区83.33%(65/78),不同地区肠道病毒阳性率差异有统计学意义(χ^(2)=177.42,P<0.05)。550份标本中,荧光定量PCR法检测肠道病毒阳性312份,主要型别为CVA6型,占总阳性数的83.01%(259/312),其次依次为CVA16型(21份)和CVA10型(5份),未分型肠道病毒27份。经VP4-VP2区测序得到CVA4型6份,对其VP1区扩增测序后获得目的片段。结论南京市2021年手足口病主要型别以CVA6型为主,与其他毒株(CVA16型、CVA4型、CVA10型等)共同循环流行;其中CVA4型毒株均属于C2亚型,未发现新的亚型,需持续监测。

陕西省急性弛缓性麻痹病例中柯萨奇病毒A组4型的基因特征

阐明从陕西省2006~2010年急性弛缓性麻痹（Acute Flaccid Paralysis,AFP）病例中分离的柯萨奇病毒A组4型（Coxsackievirus A4,CV-A4）VP1编码区的基因特征,探索其在我国流行的优势基因型及其与AFP病例之间的关系。本研究通过逆转录-聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）对连续5年从AFP病例中分离的68株非脊灰肠道病毒（non-polio enteroviruses,NPEVs）进行分子定型,其中7株鉴定为CV-A4（7/68,10.3%）;使用特异性引物扩增CV-A4VP1编码区并进行核苷酸序列测定分析和基因进化分析,将CV-A4划分为A（基因组1）、B（基因组2）和C三个基因型,其中C基因型又划分为C1（基因组3）和C2（基因组4）两个基因亚型。中国分离的CV-A4均位于第4基因组,属于C2基因亚型,提示其可能为中国大陆CV-A4的优势基因亚型;7株陕西CV-A4毒株依据分离年代的不同位于不同的三个小进化分支里,且和来自山东和吉林两省的邻近年份的CV-A4毒株位于同一小分支,提示7株陕西CV-A4分离株和它们存在共同进化和共循环。在无脊髓灰质炎时代应进一步加强监测CV-A4在AFP病例NPEV所占的比例和动态变化。

从手足口病病例分离的两株柯萨奇病毒A组4型毒株的VP_4～VP_2区基因特征分析

目的研究2008年甘肃省从手足口病(Hand,Foot and Mouth Disease,HFMD)患儿分离的柯萨奇病毒A组4型(Coxsackievirus A4,CVA4)的VP4～VP2区特征。方法采集门诊就诊的两例HFMD患儿的临床标本,接种人横纹肌肉瘤细胞(Human Rhabdomyosarcoma,RD细胞)分离病毒,然后对阳性病毒分离物使用逆转录-聚合酶链反应法扩增病毒VP4～VP2区,并进行核苷酸序列测定和分析,通过生物信息学的方法进行分子定型,最后与其它16株基因数据库中登录的CVA4株构建亲缘进化树图。结果使用RD细胞成功地从两例HFMD患儿的临床标本中分离到病毒,分子定型鉴定为CVA4。2株CVA4在VP4～VP2区核苷酸同源性为94.6%,氨基酸同源性为100%;与CVA4原型株High Point/USA/1948株的核苷酸和氨基酸同源性分别为85.5%～85.8%和99.3%。在亲缘进化树图中显示,2株CVA4分离株位于独立的进化支中。结论与基因数据库中登录的在日本、蒙古分离的CVA4株相比,从甘肃省2008年HFMD病例分离的两株CVA4,在VP4～VP2区核苷酸序列上差异很大。同源进化分析结果表明,甘肃省CVA4属于独立的进化支。

柯萨奇病毒A组4型云南分离株的基因特征分析

目的对中国云南省6株和其他10个省(含中国台湾省)不同时间、不同来源分离的柯萨奇病毒A组4型(coxsackievirus A4,CV-A4)VP1区基因特征进行分析。方法对云南省2014年手足口病实验室监测系统、2012年健康人群和2004年急性迟缓性麻痹(acute flaccid paralysis,AFP)监测系统中分离到的6株CV-A4病毒VP1区基因进行基因扩增和测序;按参考文献下载基因库中CV-A4病毒VP1区基因参考序列和其他省CV-A4基因序列,用MEGA 5.0软件计算不同毒株的核苷酸和氨基酸差异率,并构建系统进化树,进行基因特征和分子流行病学分析。结果云南6株CV-A4均为基因1型的B亚型(genotype1,subtype B)。与国内其他省毒株比较,除1998年2株山东省和2006年1株吉林省AFP分离株为基因1型的A亚型(genotype 1,subtype A),台湾省4株(AB571583、AB571584、AB571586、AB571587)为基因2型的B亚型(genotype 2,subtype B)外,其他中国分离株均为基因1型的B亚型。结论除CVA4病毒的原型株High Point(AY421762)外,国内外CV-A4病毒存在两个基因型,两个基因型又分为两个亚型,即A和B亚型;中国分离株大都为基因1型,其中又以B亚型为主。不同于EV-A71和CV-A16,CV-A4的基因型分布不是很广。

吉林省急性弛缓性麻痹病例和健康人群中柯萨奇病毒A组4型的基因特征分析

目的了解吉林省2006年和2008年急性弛缓性麻痹(Acute Flaccid Paralysis,AFP)病例和健康人群中分离到的柯萨奇病毒A组4型(Coxsackievirus Group A Type4,CVA4)的基因特征,探索特定血清型肠道病毒(Enterovirus,EV)与AFP病例之间的关系。方法 从75例AFP病例和60例边境地区健康人群中采集原始粪便标本,使用人横纹肌肉瘤(Human Rhabdom yosarcom a,RD)细胞和人喉癌(Human Laryngeal Carcinoma,Hep-2)上皮细胞进行病毒分离,阳性标本用EV组合血清进行中和试验鉴定血清型,未能定型的标本用EVVP4-VP2蛋白编码区引物通过逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)进行扩增,扩增阳性标本通过基因序列分析鉴定血清型。从中挑选CVA4扩增全长VP1编码区片段并进行核苷酸序列测定和分析,测序结果利用Bioedit软件进行核苷酸和氨基酸同源性分析,用Mega软件建立基因进化树,进行基因亲缘关系分析。结果使用RD细胞从AFP病例粪便标本中分离到5株CVA4,从健康人群粪便标本中分离到4株CVA4。这9株病毒用EV组合血清均无法定型,经过VP4-VP2测序的方法 鉴定为CVA4。9株病毒VP1编码区的核苷酸和氨基酸同源性分别为88.3%～100%和98%～100%,与CVA4原型株CVA4/HighPoint(海波因特)/USA(美国)/1950的核苷酸和氨基酸同源性分别为83.3%～85.6%和97.7%～98.6%。其中4株来自AFP病例的病毒具有高度的基因同源性(99.6%～100%),这4株病毒与来自健康人群的病毒比较,核苷酸和氨基酸同源性分别为88.3%～88.9%和98.0%～98.6%。在基因进化树上显示,这4株来自AFP病例的CVA4构成一个独立的分支。结论基因进化分析表明,4株来自AFP病例的毒株VP1编码区的基因特征,与来自健康人群的毒株的基因特征显著不同。