柯萨奇病毒A组10型VP1蛋白线性中和表位的筛选和鉴定

柯萨奇病毒A组10型(CV-A10)是引起手足口病(HFMD)的常见病原体之一。应用重叠肽法筛选出覆盖CV-A10全长VP1区氨基酸序列的39条候选表位肽段,以间接酶联免疫吸附试验(ELISA)及微量中和抑制试验验证。结果发现,候选表位P6(CV-A10 VP1区第39~53位氨基酸)与CV-A10全病毒抗血清具有高反应性,且在3.91μg/mL的稀释质量浓度时仍具有中和抑制作用,为潜在中和表位。用P6肽免疫小鼠制备相应的抗血清,并以微量中和试验验证其保护能力,结果显示,P6抗血清的几何平均中和效价为1:8.97,可确定P6为CV-A10的中和表位。为了解P6序列在CV-A10型内的保守性,将P6的氨基酸序列与CV-A10各基因型代表株进行比对分析,结果显示,P6在CV-A10型内高度保守,表明P6为CV-A10的广谱性中和表位,可应用于CV-A10表位疫苗的研发。本研究旨在筛选鉴定CV-A10 VP1蛋白上的线性中和表位,为CV-A10表位疫苗的研发和HFMD的防控奠定基础。

2013～2014年杭州地区手足口病柯萨奇病毒A6型和A10型VP1基因特征分析

目的了解2013-2014年杭州地区手足口病病原谱的分布,并对其病原基因特征进行分析。方法采集2013年3月至2014年4月手足口病患儿标本1 340例,提取病毒核酸,通过逆转录和PCR扩增肠道病毒VP1序列并测序,经Blast比对确定病毒基因型。对柯萨奇病毒A6型（CA-A6）和A10型（CA-A10）VP1全长序列进行同源性比对分析,并构建系统进化树。结果1 340例手足口病患儿标本中,肠道病毒检出阳性率为81.43%（1 090/1 340）。其中,CV-A6阳性率为41.04%,取代EV-71（14.48%）成为杭州地区检出阳性率最高的肠道病毒;CV-A10检出率（8.51%）也高于CV-A16（3.81%）,列于第三位。同源性比对及系统进化分析显示,2013-2014年的25株CV-A6病毒核苷酸同源性为89.0%-99.7%,主要分布于G、H基因亚型;15株CV-A10病毒核苷酸同源性为95.3%-99.9%,分布于F、G基因亚型。结论 2013-2014年杭州地区儿童手足口病的主要病原体发生重大变化,CV-A6病毒成为最主要病原,CV-A10病毒也存在潜在威胁,需加强对其他肠道病毒的持续监测和分子特征分析。

2013年至2018年辽宁省柯萨奇病毒A10型分离株VP1区基因特征分析

为了解辽宁省地区手足口病患者中分离到的柯萨奇病毒(Coxsackievirus)A10型VP1区基因特征,收集了2013年至2018年辽宁省14个市送检的手足口病患者非EV-A71和非CV-A16肠道病毒的阳性标本,通过细胞培养法分离肠道病毒,提取病毒RNA;通过RT-PCR法进行肠道病毒VP1区基因扩增和序列测定;利用BLAST对测序结果比对后确定病毒基因型;对鉴定为CV A10的分离株进行VP1区同源性分析,并构建系统进化树。2013年至2018年辽宁省共收到非EV-A71和非CV-A16其他肠道病毒的阳性标本9 431份,用人横纹肌瘤细胞(rhabdomyosarcoma cells,RD)分离出CV-A10 165株。CV-A10分离株间的VP1区基因核苷酸同源性为91.3%~100%,氨基酸同源性为93.9%~100%,和A、B、C、D各基因型之间的VP1区同源性比较,与C基因型代表株的同源性最高,核苷酸同源性为92%~100%,氨基酸同源性为93.9%~100%。系统进化树分析表明,辽宁省CV-A10分离株为C基因型。 CV-A10是引起辽宁省手足口病的重要病原体,CV-A10分离株与C基因型代表株处于同一分支上均属C基因型,有C1和C2两个进化分支共同流行,其中C2分支是优势流行株。

检测柯萨奇病毒A组6、10、16型的多重荧光RT-PCR建立及应用

目的建立检测手足口病(HFMD)肠道病毒的多重荧光RT-PCR方法。方法用多重荧光RT-PCR技术对引起HFMD的3种常见人肠道病毒[柯萨奇病毒A组(CVA)6、10、16型]进行检测,用基因测序法进行验证,并以灭活的CVA6、CVA10、CVA16病毒标准株以及引起临床相似症状的病原体样本进行特异性和灵敏度分析。结果 322例临床疑似HFMD标本,经本多重荧光RT-PCR法检测出CVA16、CVA10和CVA6型阳性样本分别为81、16和9份(总阳性率32.9%),且与基因测序法结果完全符合。将多重PCR体系中c-MMLV逆转录酶的量增至5 U,Hot-Taq酶的量增至8.5 U,可使其扩增效率提升至单重PCR扩增水平。优化后的体系可扩增出CVA6、CVA10和CVA16型阳性病毒标准RNA的检测下限分别是10,5和1 TCID50/mL。结论建立了一种灵敏、特异、高效和高通量的检测HFMD肠道病毒的多重荧光RT-PCR法,为其快速诊断提供了新的实验方法。

柯萨奇病毒A组10型研究进展

自2008年以来,由多种肠道病毒引起的手足口病已成为严重威胁中国婴幼儿健康的重大公共卫生问题之一。其中,肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)和柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CVA16)是引起手足口病的主要病原体。但2011年以后,中国手足口病的流行趋势发生了变化,柯萨奇病毒A组10型(coxsackievirus A10,CVA10)和柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus A6,CVA6)引起的手足口病呈增多趋势,在部分地区已替代EV71和CVA16成为引起手足口病的主要病原体,已引起越来越多的关注。现就CVA10的病原学、流行病学、实验室诊断、动物模型及疫苗相关研究作一综述。

2018-2019年吉安市柯萨奇病毒A组6型和10型的病原学检测和流行特征分析

目的通过吉安市近年手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)标本中通用型肠道病毒核酸(EV-RNA)阳性中的非柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CA16)和非肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)肠道病毒标本做柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6,CA6)和10型(Coxsackievirus A10,CA10)病原学检测,回顾性分析CA6、CA10的流行规律,探讨吉安地区手足口病例的病毒谱的变化情况,为制定、调整吉安市HFMDR防控策略提供科学依据。方法使用RT-PCR法对2018-2019年吉安市收集的1433份手足口病病例标本进行EV、CA16和EV71核酸检测,对其中EV阳性的非CA16和非EV71型标本做CA6、CA10核酸检测并做流行病学特征分析。结果437份非CA16和非EV71肠道病毒标本中CA6型266份(60.87%),CA10型23份(5.26%),其他未分出型别148份(33.87%)。病原流行高峰期主要集中在7~10月份,检出226份(51.72%)。男女比例1.93:1;病例主要集中在3岁及以下幼儿(97.48%)。各县(市、区)病例分布有统计学意义。标本类型以肛拭子(268份,61.33%)和粪便(118份,27.00%)为主;疱疹液中检出阳性率最高(25/25,100.00%)。结论近年来吉安市手足口病病原体由EV71型、CA16型为主转变为其他肠道病毒型别为主,其中以CA6型等为主要病原,提示应加强对CA6、CA10等其他肠道病毒的监测和分型,并制定切实可行的防控措施。

手足口病柯萨奇病毒A6和A10流行病学特点

近年来,中国大陆地区引起手足口病的主要病原体是肠道病毒71（EV71）和柯萨奇病毒A16（Cox A16）。然而,自2008年开始,柯萨奇病毒A6（Cox A6）在部分地区逐渐出现并成为引发手足口病暴发流行的优势菌株。尤其是2013年以来,中国大陆地区Cox A6相关的手足口病引起了医学界较大的关注,部分地区Cox A6甚至超越了EV71和Cox A16而成为第一位引起手足口病的病原体,同时还检测到了柯萨奇10（Cox A10）。现就近年来我国手足口病优势病原体Cox A6和Cox A10的流行病学作一综述。

猪圆环病毒Ⅱ型和巨噬细胞对体外培养仔猪淋巴细胞白介素-6和白介素-10及其受体表达的影响

选取5头猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)血清抗体阴性的普通断奶仔猪,无菌取其脾脏制成单细胞悬液后,分设淋巴细胞(L组)、淋巴细胞+PCV2(L+V组)、淋巴细胞+巨噬细胞(L+M组)和淋巴细胞+巨噬细胞+PCV2(L+M+V组)4组进行体外培养。分别在培养后0 h、6 h、12 h和24 h收获淋巴细胞及其上清液。用ELISA检测上清液中猪淋巴细胞白介素-6(IL-6)和白介素-10(IL-10)的含量,用RT-PCR检测淋巴细胞中IL-6、IL-6R、IL-10和IL-10RmRNA的表达。结果显示:与L组相比,L+V组中IL-6的含量在攻毒后24 h显著升高(P<0.05);PCV2在攻毒后12 h对IL-6RmRNA的表达呈显著抑制(P<0.05);PCV2在攻毒后6 h显著促进IL-10的表达(P<0.05)。上述结果表明,PCV2能促进淋巴细胞中IL-6和IL-10的表达;而巨噬细胞能抑制PCV2对淋巴细胞中IL-6表达的上调作用,同时协同PCV2促进淋巴细胞中IL-10及其受体持续性高表达,导致持续的免疫抑制,在PCV2的致病过程中扮演重要角色。

白细胞介素-10基因多态性与儿童肠道病毒71型感染的相关性研究

目的探讨白细胞介素-10(IL-10)基因位点-1082A/G、-819C/T和-592C/A多态性与IL-10水平及儿童肠道病毒71型(EV71)感染程度的关系。方法选取EV71感染的手足口病患儿137例为研究对象,其中轻症组91例,重症组46例,另选取行健康体检儿童122例为健康对照组,采集临床数据。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清IL-10水平。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析技术检测IL-10基因位点-1082A/G、-819C/T和-592C/A的多态性。结果与健康对照组相比,EV71感染组患儿的-1082位点AA基因型频率和A等位基因频率更高(P<0.05)。在EV71感染组中,重症组-1082位点AA基因型频率和A等位基因频率高于轻症组(P<0.05)。两组间IL-10基因位点-819C/T和-592C/A多态性的分布比较差异均无统计学意义(P>0.05)。重症组患儿血清IL-10水平明显高于轻症组和健康对照组(P<0.05)。IL-10-1082AA基因型、-819 TT基因型和-592 AA基因型与IL-10的低表达有关(P<0.05)。在单倍型构建上,EV71感染组GCC单倍型的频率低于健康对照组(P<0.05)。在EV71重症感染组中,ATA单倍型患儿的IL-10水平较其他单倍型显著降低,而GCC患儿的IL-10水平较其他单倍型显著升高(P<0.05);轻症组和健康对照组各单倍型间的IL-10水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论IL-10基因多态性与IL-10表达水平及EV71感染严重程度有关。

人IL-10基因重组复制缺陷型腺病毒DNA的构建

目的 构建人IL-10基因的重组腺病毒并进行体外表达和检测。方法从质粒pcDNA3IL-10的CMV启动子下游完整切下IL-10 cDNA的片段,将其定向插入Gateway载体,在克隆酶的作用下将阳性克隆质粒转入目的腺病毒载体。PacI酶线性化IL-10腺病毒DNA后阳离子质脂体转染293A细胞,获得人IL-10的复制缺陷型重组腺病毒。体外感染人胰腺癌细胞株Bxpc-3和大鼠胰腺细胞株AR-42J;Western blot检测人IL-10的表达。结果 成功地构建人IL-10重组腺病毒,病毒滴度达2×109PFU/mL。体外感染的细胞株均检测到IL-10的表达。结论 构建复制缺陷型重组腺病毒能够介导IL-10的基因表达,为细胞因子的抗炎冶疗奠定实验基础。

高危型人乳头瘤病毒感染宫颈上皮内瘤变患者阴道局部白介素-10、12水平及凤香洗液的干预作用

目的观察高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染的宫颈上皮内瘤变(CIN)患者阴道局部组织的免疫状态,探讨凤香洗液对其的干预作用。方法选取伴高危型HPV感染的CIN患者60例,分为CINⅠ组及CINⅡ组各30例,同期30例健康妇女为对照组。留取对照组、CINⅡ组阴道灌洗液,CINⅠ组给予中药凤香洗液于宫颈及阴道局部治疗,于治疗前后留取阴道灌洗液,采用ELISA方法测定阴道灌洗液白介素(IL)-10、IL-12的水平。结果在对照组、CINⅠ组及CINⅡ组中,治疗前患者阴道灌洗液的IL-10表达水平随宫颈病变程度的加重而升高(P<0.05),IL-12表达水平随宫颈病变程度的加重而降低(P<0.05),IL-12/IL-10比值随宫颈病变程度的加重而降低(P<0.05)。CINⅠ组治疗后阴道灌洗液IL-10水平较治疗前降低,IL-12较治疗前升高,IL-12/IL-10升高(P<0.05)。结论 CIN患者阴道灌洗液中IL-10表达升高、IL-12表达及IL-12/IL-10降低,可能在CIN的发病过程中起到一定的作用;凤香洗液可能通过调节IL-10、IL-12的表达水平,维持Th1/Th2的免疫平衡,从而清除高危型HPV并阻断CIN的进展。

单纯疱疹病毒2型DNA提取及ICP10启动子基因获得和纯化

目的用单纯疱疹病毒2型DNA,扩增并纯化得到ICP10启动子基因。方法培养vero细胞并接种HSV-2,获得大量HSV-2。用酚:氯仿提取病毒DNA,用PCR方法获得病毒ICP10启动子基因,并用UNIQ-10柱试剂盒纯化PCR产物。结果接种病毒的vero细胞出现病变,病变为“”,收集细胞,反复冻融3次,使细胞裂解,获得大量HSV-2。经PCR扩增获得641bp大小的目的基因片段。电泳显示片断大小符合。结论获得的ICP10启动子基因,经过测序正确后,可以和其他基因连接,用于进一步研究。

重组复制缺陷型腺病毒AdIL-10构建及其在HSC中的表达

目的利用AdEasy系统构建重组复制缺陷型腺病毒AdIL 10 ,并观察其在肝星状细胞 (HSC)中的表达。方法从SD大鼠脾脏单核细胞中抽提总RNA ,通过RT PCR获得鼠IL 10cDNA片段 ,插入穿梭质粒pAdTrack巨细胞病毒 (CMV)启动子下游 ,构建重组穿梭载体pAdTrack CMV IL 10 ,线性化后与AdEasy 1电穿孔共转化BJ5 183,获得重组腺病毒质粒pAdIL 10。pAdIL 10用Lipo fectamin包装转染HEK 2 93细胞 ,获得重组腺病毒AdIL 10。将AdIL 10体外感染HSC ,3d后抽提HSC总RNA ,以RT PCR检测IL 10的表达。结果通过酶切和测序法筛选出pAdIL 10 ;经 2 93细胞包装 ,3d后观察到绿色荧光蛋白 (GFP)表达 ;AdIL 10感染HSC3d后观察到GFP表达 ,通过RT PCR可检测到IL 10的表达。结论利用AdEasy系统可制备重组腺病毒AdIL 10 ;AdIL 10感染HSC后可表达IL

斜纹夜蛾核型多角体病毒日本株(C3)p10基因的克隆及序列分析

从斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodopteralituramulticapsidnucleopolyhedrovirus,SpltMNPV)日本株(C3)基因组中克隆了p10基因.核苷酸序列分析表明,该克隆片断涵盖了318bp的读码框及5′端启动子区191bp和3′端终止区62bp的序列.在起始密码子ATG上游-63～-59bp处有一杆状病毒晚期和晚晚期启动子基序TAAG.联配分析表明,SpltMNPV日本株(C3)的核苷酸序列和氨基酸序列与其它9种核多角体病毒的同源性有较大差异.以p10基因为基础绘制的杆状病毒分子进化树将家蚕核多角体病毒(Bombyxmorinucle opolyhedrovirus,BmNPV)与苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographacalifornicamulticapcidnucleopolyhe drovirus,AcMNPV)归到同一分枝,这与以gp37基因和egt基因为基础绘制的杆状病毒分子进化树结果一致.

腺病毒介导的鼠IL-10基因对非肥胖型糖尿病小鼠胰岛β细胞的保护作用

目的探讨腺病毒介导的鼠IL-10(Ad-rIL-10)基因对非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠1型糖尿病早期胰岛β细胞的保护作用。方法随机将46只NOD小鼠分为4组:生理盐水对照组10只、糖尿病对照组12只、空载体对照组12只、Ad-rIL-10组12只。除生理盐水对照组外,其他组腹腔注射环磷酰胺诱导糖尿病早期模型。成模后,Ad-rIL-10组立即给予腹腔注射含Ad-rIL-10的重组腺病毒液0.1 mL、空载体对照组给予含Ad-eGFP的重组腺病毒液0.1 mL,其他组给予等量生理盐水。每周检测小鼠体质量、血糖。3周后处死小鼠,留取小鼠血清标本,采用ELISA法测定血清C肽、IFN-γ、IL-4及IL-10水平;制作胰腺标本,免疫组化法观察小鼠胰腺炎症浸润程度和rIL-10局部表达情况。结果与生理盐水对照组相比,成模后其他组血糖水平、体质量变化有明显差异(P均<0.05),血清IFN-γ水平明显增高(P均<0.05),而IL-4、IL-10和C肽水平明显降低(P均<0.05)。糖尿病对照组、Ad-rIL-10组、空载体对照组血糖水平、体质量、胰岛炎症浸润程度及血清学指标变化不明显。结论 Ad-rIL-10基因对NOD小鼠1型糖尿病早期胰岛炎症无明显减轻作用,对残余胰岛β细胞无明显保护作用。

人疱疹病毒6型诱导单核细胞产生IL—10

目的 探讨人疱疹病毒６型（ＨＨＶ－６）感染的发病机理。方法 用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）检测白细胞介素－１０（ＩＬ－１０）等细胞因子的产生。结果 ＨＨＶ－６诱导单核细胞表达和产生ＩＬ－１０，细胞因子ｍＲＮＡ动力学研究发现ＴＮＦ－α（肿瘤坏死因子），ＩＬ－１β及ＩＬ－６随ＩＬ－１０ｍＲＮＡ积累而减少。

家蚕质型多角体病毒miRNA BmCPV-miR-10的鉴定和功能分析

家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cypovirus,BmCPV)是家蚕的重要病原之一,也是典型的RNA病毒,为探索其在侵染过程中与家蚕免疫防御系统的互作机制,选择由BmCPV基因组编码的miRNA BmCPV-miR-10进行研究。通过stem-loop qRT-PCR在感染BmCPV的家蚕幼虫中肠中检测到BmCPV-miR-10的表达;靶基因预测发现,家蚕R2D2蛋白基因(BmR2D2)为BmCPV-miR-10的候选靶基因,靶位点位于BmR2D2 mRNA序列的CDS区域。进一步验证miRNA对靶基因的调控作用,分别构建BmCPV-miR-10及其靶基因BmR2D2的慢病毒表达载体,借助包装质粒共转染HEK293T细胞,同时合成了BmCPVmiR-10 mimics转染BmN细胞,qRT-PCR检测结果均证明BmCPV-miR-10能下调靶基因BmR2D2的表达。对感染BmCPV的家蚕幼虫体腔注射BmCPV-miR-10 mimics,分别检测靶基因和BmCPV基因组RNA片段的表达变化,亦证明了BmCPV-miR-10对靶基因BmR2D2的调控作用,并且促进BmCPV基因组的复制。上述结果表明,BmCPV在侵染家蚕的过程中,可能通过编码BmCPV-miR-10下调靶基因BmR2D2的表达,影响宿主RNAi途径在抵抗病毒过程中的作用,从而促进病毒自身的复制。

10亿PIB/mL甜菜夜蛾核型多角体病毒悬浮剂防治甘蓝甜菜夜蛾的效果及对天敌昆虫的影响

10亿PIB/mL甜菜夜蛾核型多角体病毒悬浮剂防治甘蓝甜菜夜蛾的田间药效试验结果表明,该药剂对甘蓝甜菜夜蛾具有良好的防治效果。田间每667 m2用量75～100 g时,药后5 d对甜菜夜蛾幼虫的防效可达80%以上,药后10 d防效仍高达70%以上,具有极好的持效性。而该药剂对菜田蜘蛛等天敌影响的统计表明,其对蜘蛛种群影响较小,当试验药剂和对照药剂用量为75 g时,药后5 d和10 d,百株甘蓝上蜘蛛的减退率分别为1.2%和0.5%,显著低于对照药剂3%高效氯氰菊酯.107PIB/mL甜菜夜蛾核型多角体病毒悬浮剂处理区的减退率。说明该药剂具有良好的应用前景。

CVA10候选疫苗病毒株的分离、鉴定及其致病性和免疫保护性研究

目的分离、筛选柯萨奇病毒A组10型(Coxsackievirus A10,CVA10)病毒候选疫苗株,并对其免疫原性及免疫保护性进行评价,为CVA10疫苗的研制奠定基础。方法本研究从北京市儿童医院、军事医学研究院、北京市疾控中心共收集80个手足口病(hand foot and mouth disease,HFMD)标本,通过细胞培养法、RT-PCR的方法分离、鉴定CVA10病毒株。对病毒进行嗜斑纯化,各纯化病毒株与Al(OH)3(0.5 g/ml)佐剂混合后制备原疫苗,免疫Balb/c小鼠,收集血清。应用交叉中和实验及抗体阳转率实验筛选候选CVA10疫苗株。筛选后T9疫苗株免疫ICR乳鼠,观察ICR乳鼠的致病情况。结果共分离出14株CVA10病毒株。交叉中和实验筛选得到4株候选疫苗株。最后阳转率实验确定T9为候选疫苗株。Al(OH)3+CVA10灭活抗原在Balb/c小鼠体内能诱生高滴度的特异性抗体,该抗体对Balb/c小鼠有保护作用。T9病毒免疫ICR乳鼠后,对乳鼠完全致死。结论筛选1株CVA10病毒候选疫苗株,CVA10候选疫苗对ICR乳鼠动物模型有致病性。

湖北2013年部分柯萨奇A16型肠道病毒VP1基因分子特征分析

目的全面研究和了解2013年湖北省柯萨奇A16型的VP1基因特征,分析CVA16型病毒在我省的基因型别及分子进化分析。方法对2013年湖北省21株CVA16病毒流行株进行VP1区全长基因序列测定,并对核苷酸及氨基酸序列进行同源性比较及系统进化分析。结果2013年湖北省21株CVA16型病毒流行株的VP1区核苷酸序列全长均为891bp,VP1区核苷酸和蛋白氨基酸序列同源性分别为90.0%～100.0%和96.3%～100.0%。VP1区基因系统进化分析表明,湖北CVA16流行株主要位于ligeage1和3分支上,分属于B1a和B1b基因亚型。结论 2013年湖北省21株CVA16型流行株主要为B1b基因亚型,其次为B1a基因亚型,在同一地区有两种基因亚型的CVA 16病毒同时存在,在不同的地区存在同一种亚型的CVA16病毒。