2023年自贡市一起柯萨奇病毒A4引起的幼儿园疱疹性咽峡炎暴发疫情

目的 了解柯萨奇病毒A4(coxsackievirus A4,CV-A4)引起的疱疹性咽峡炎暴发疫情的流行病学特征及排毒时长,为疱疹性咽峡炎暴发疫情防控提供数据支撑。方法 2023年5月对自贡市金苹果幼儿园1起疱疹性咽峡炎暴发疫情进行调查处置,采集幼儿园小2班教师2份、全体儿童咽拭子9份和环境样本10份,经RT-PCR肠道病毒核酸检测,对阳性儿童再次连续采样(间隔1周)至核酸检测阴性时终止。结果 本次疫情共发现病例14名,罹患率为53.9%(14/26)。患儿临床症状以发热(100.0%)、咽痛(78.6%)及咽峡部疱疹(71.4%)为主,咽拭子和环境样本中均检出肠道病毒核酸阳性,分型为CV-A4。排毒时长中位数为21(95%CI:14.0~28.0)d,生存分析检验显示病例与隐性感染者、男性与女性排毒时长差异无统计学意义。结论 本次疫情为一起CV-A4型引起的幼儿园疱疹性咽峡炎暴发疫情,排毒时间较长,建议幼儿园、学校在节假日后强化晨午检工作,持续对儿童进行追踪随访,卫生与教育部门协同做好流行季节肠道病原学监测。

2020-2021年上海地区分离株柯萨奇病毒A4基因型的全基因组分析

目的对2020-2021年上海市环境污水和健康儿童粪便标本中分离的9株柯萨奇病毒A4(Coxsackievirus A4,CVA4)进行全基因组特征分析。方法利用人横纹肌肉瘤细胞(human rhabdomy-osarcoma,RD)和人喉癌上皮细胞(human laryngeal carcinoma,Hep-2)对污水样品和健康儿童粪便样品进行病毒分离,抽提病毒RNA进行逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR),利用Illumina二代测序技术进行全基因组序列测定。使用BioEdit 7.2.5软件对CVA4进行序列比对和同源性分析,使用软件MEGA10.0.4运用最大似然法(Maximum likelihood,ML)构建系统进化树,建树自展值(Bootstrap)检验1000次。使用Similarity Plots3.5.1软件对CVA4代表株进行重组分析。结果2021年上海市健康儿童粪便样品共分离出5株CVA4,2020-2021年环境污水中共分离出4株CVA4。2020年1月和12月以及2021年1-2月和4-5月采集的污水浓缩液均检出CVA4。9株CVA4分离株之间VP1区核苷酸和氨基酸相似性分别为90.2%~100%和96.3%~100%,均属于C2基因亚型。其中5个CVA4代表株间全基因组核苷酸和氨基酸相似性分别为89.8%~99.3%和96.3%~100%。基因重组分析显示,5个CVA4代表株的基因组在P1区与CVA4原型呈现高度相似性,而在5'UTR区域均与CVA6有重组区域,并在P3的3C区域与CVA5和CVA6存在重组现象。结论分离自上海地区的9株CVA4均属于C2基因亚型,该亚型是国内CVA4的优势基因亚型。其中5株CVA4在5􀆳UTR和3C区存在重组现象。本研究可为了解上海流行株CVA4的遗传变异情况提供数据支撑,CVA4的疫苗研发和相关疾病的防控具有参考意义。

2011-2014年福建省手足口病相关病原柯萨奇病毒A组4型的分子流行病学分析

目的分析福建省手足口病患者中柯萨奇病毒A组4型(Coxsackievirus A4,CVA4)的流行病学、基因变异及遗传进化等特征。方法应用细胞培养方法获得病毒分离株,RT-PCR方法进行分子分型及扩增CVA4血清型完整VP1区全长序列,并进行序列变异及遗传进化分析。结果 2011-2014年,从福建省手足口病其它肠道病毒病例标本中分子分型33例CVA4病例,在407例的其它肠道病毒病例中的构成比为8.1%,其中2012年31例,2014年2例。CVA4病例在性别、年龄组分布特征,与一般手足口病流行特征相比,没有特异性。VP1区序列差异比较表明,2011-2014年福建省CVA4分离株之间VP1核苷酸及氨基酸序列相似性分别在92.6%~100%、95.7%~100%;与原型株及国外地方株的核苷酸序列相似性较低,分别为83.7%~85.4%、82.1%~89.1%,氨基酸序列相似性分别为96.1%~99.0%、90.4%~99.6%;与国内地方株核苷酸及氨基酸序列相似性较高,分别为87.9%~99.2%、96.1%~100%。进化树结果表明福建CVA4分离株与原型株及国外代表株的遗传距离远,与国内代表株的遗传距离近。福建CVA4分离株在进化树的分布呈多个分支。结论 CVA4已成为近年来福建省除EV71、CVA16、CVA6、CVA10外导致手足口病的又一重要病原体。福建CVA4分离株与国内地方株同进化共循环,在福建省各个地区同时流行多条亲缘关系接近的传播链。

2009-2015年青岛市手足口病病原中柯萨奇病毒A4型VP1区基因特征分析

目的阐明2009-2015年引起青岛市手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)的病原之一柯萨奇病毒A4型(CV-A4)VP1编码区的基因特征。方法用荧光RT-PCR法对青岛市2009-2015年HFMD患者的咽拭子标本进行总肠道病毒(EV)、柯萨奇病毒A16(CV-A16)型和肠道病毒71(EVA71)型检测,以半巢式反转录PCR扩增非EV-A71,非CV-A16型肠道病毒VP1区部分基因序列,结合序列分析鉴定CV-A4血清型。对全部CV-A4阳性分离株进行VP1基因全长序列扩增及基因序列测定。用MEGA 5.0软件进行遗传进化及分子特征分析。结果青岛市2009-2015年7 967份HFMD患者的咽拭子标本中共分离到CV-A4 39株,分别占各年度肠道病毒总构成比的0.18%(1/541)、0.21%(2/944)、0.29%(2/681)、1.37%(4/292)、2.25%(12/534)、0.75%(7/928)和1.86%(11/591)。遗传进化分析显示,94.87%(37/39)的青岛地区CV-A4分离株位于C2b亚型,5.13%(2/39)位于C1亚型;青岛C2b亚型病毒株VP1区核苷酸一致性为90.7%~100.0%,氨基酸一致性为96.9%~100.0%。结论 CVA4不是引起HFMD的优势病原,C2b亚型毒株是青岛市CV-A4的优势流行株,同时伴有C1亚型毒株的流行。

2015年烟台地区手足口病监测中柯萨奇病毒A4基因特征分析

研究2015年山东省烟台地区手足口病的病原谱,以及柯萨奇病毒A组4型（Coxsackievirus A4,CV-A4）的分子流行病学。采用实时荧光逆转录聚合酶链反应方法,对2015年烟台地区采集于手足口病患者的696份样品进行总肠道病毒（EV）、柯萨奇病毒A16（CV-A16）型和肠道病毒A71型（EV-A71）的核酸检测,并对非EV-A71非CV-A16的EV阳性标本,进行CV-A4的核酸检测。对CV-A4阳性标本进行病毒分离,对病毒分离阳性的CV-A4标本进行全长VP1区扩增,并进行核苷酸序列测定和分析,然后进行核苷酸/氨基酸相似性分析和系统发育分析。从696份标本中检出肠道病毒阳性标本412份,其中101份为CV-A16,76份为EV-A71,16份为CV-A4。9份CV-A4阳性标本成功病毒分离,并进行了全长VP1区核苷酸序列分析,结果表明,其核苷酸相似性为91.04%～100%,氨基酸相似性为95.24%～100%。系统进化分析显示9株CV-A4烟台株均属于G1基因群。与参考株CVA4-High Point-AY421762-genome相比,氨基酸序列的第20、34,102、111、143、184、185、200及304位氨基酸出现突变,本研究的9株分离株的这些位点也有不同,表明烟台地区的CV-A4有其独特的突变位点。CV-A4是引起2015年烟台地区手足口病发病的病原体之一,本次分离到的CV-A4均属于G1基因群进化分支。

手足口病患儿柯萨奇病毒A4的鉴定及其5′UTR-VP4-VP2区序列分析

目的分析2009年北京市西城区手足口病患儿柯萨奇病毒A4(CoxA4)5′UTR-VP4-VP2区进化特征,探讨其与国内外其他地区CoxA4分离株的关系。方法提取病毒RNA,进行半巢式RT-PCR扩增肠道病毒(EV)5′UTR-VP4-VP2区。通过测序和Blast比对确定EV型别;并对其进行序列和进化分析。结果共鉴定出两株CoxA4,Genbank登录号为JQ429434和JQ429435。进化分析表明,CoxA4包括3个进化树分支:原型株AY421762位于独立的分支,其余CoxA4构成两个基因型(Ⅰ型和Ⅱ型),每个基因型包括两个亚型(A和B)。在5′UTR-VP4-VP2区,两株CoxA4核苷酸序列同源性为96.00%;它们与原型株、基因Ⅰ型及Ⅱ型毒株序列同源性分别为87.00%～88.00%,85.00%～87.00%,92.00%～98.00%。两株CoxA4与其他中国株均位于基因Ⅱ型分支上。结论北京市西城区CoxA4株与我国近年CoxA4流行株在5′UTR-VP4-VP2区具有较高的同源性,且进化关系密切。

长沙地区1株重组柯萨奇病毒A4基因型的全基因组序列分析

目的对湖南省长沙市手足口病患儿咽拭子中分离的1株柯萨奇病毒A组4型(coxsackievirus A4,CV-A4)毒株进行全基因组序列及分子进化特征分析。为手足口病的疫情防控提供理论数据支持。方法利用人类横纹肌肉瘤(human rhabdomyosarcoma,RD)细胞对2019年6月长沙市常规监测的手足口病病例咽拭子标本进行病毒分离,提取病毒RNA序列进行逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR),并利用Illumina二代测序技术对其进行全基因组序列测定,利用MEGA 6.0构建系统进化树,用BioEdit和Simplot软件进行重组和进化分析。结果手足口病患儿的咽拭子中分离的CV-A4毒株为1株重组毒株,毒株命名为S270/Changsha/CHN/2019(简称S270),序列全长为7454 bp。基于核苷酸序列的进化树结果表明,S270毒株的结构蛋白区域(P1)属于CV-A4分支,非结构蛋白区域(P2和P3)属于CV-A2分支。S270毒株与AY421762株(简称CV-A4代表株)对比,核苷酸序列P1区的同源性为85.05%;非结构蛋白P2和P3区的同源性为83.90%。全基因组氨基酸序列与CV-A4代表株的同源性为84.7%。VP1区氨基酸序列与CV-A4代表株的同源性为83.8%,氨基酸位点出现A55T和M229T两个突变。重组位点分析发现S270毒株全基因组重组位点发生在2B非结构蛋白区域,位于基因组序列位点约3849 bp位置。结论S270分离株属于CV-A4重组毒株,基因重组位点位于2B区内,属于GI基因群的GIB亚型。

一起由柯萨奇病毒A4引起的聚集性发热的分子流行病学研究

目的对2018年北京市一起聚集性发热疫情的病原进行鉴定,并对其进行分子流行病学分析。方法采集此次疫情4例患儿咽拭子标本,提取标本核酸,用实时荧光PCR对其进行初步病原学鉴定。用分型引物通过RT-nPCR对肠道病毒VP1区部分核苷酸序列进行扩增,通过测序和GenBank Blast比对确定肠道病毒型别,并对其进行序列和进化分析。结果 4例患儿标本均为CVA4阳性,在VP1区,其核苷酸序列同源性为100%;序列分析发现,其与2016年澳大利亚CVA4分离株MH111027同源性最高,为99%;与2004—2016年中国境内CVA4分离株同源性为83%～90%。进化分析显示,此次疫情毒株与近年来中国境内流行的CVA4优势毒株不在一个进化树分支上。结论引起此次聚集性发热疫情的病原体是CVA4,其与近年来我国流行的CVA4优势毒株具有不同的种系来源。

泰安市2017-2018年柯萨奇病毒A4型分离株全基因组特征

目的分析2017—2018年泰安市柯萨奇病毒A4型(Coxsackievirus A4,CV-A4)分离株的基因组特征。方法收集2017—2018年到泰安市妇幼保健院就诊且临床表征为手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)特征的患儿咽拭子样本共60份,利用肠道病毒(enterovirus,EV)通用引物,经荧光定量PCR进行鉴定。核酸阳性样本进行高通量测序。通过Mega5.05、RaxML软件进行全基因组序列及VP1基因系统发育分析,并进行同源性及氨基酸突变位点分析。结果4条CV-A4全基因组序列,标本来自17~19月龄幼儿。系统进化分析表明,除了MG550920/AA/Henan/2016以外,包括4株泰安株以内的中国CV-A4毒株(97.2%)均位于Group 3分支。根据VP1基因可划分为4个基因型,98.5%的国内毒株均位于基因型D分支,4株泰安株位于基因型D2。值得注意的是,分离株A1/Taian同澳大利亚株(C179、C062)的全长序列及VP1基因进化关系均较近,且均与本实验室2016年烟台分离株YT184R高度同源。与CV-A4原型株High Point相比,4个泰安株在结构蛋白编码区即P1区共有18个位点发生氨基酸突变。结论4株泰安CV-A4分离株同国内多数CV-A4株的全基因组及VP1基因均位于同一进化分支,为近期国内流行株,与原型株相比其P1区发生了多个氨基酸变异,值得进一步研究。

4株手足口病相关柯萨奇病毒A4型的全基因组特征

目的了解青岛地区流行的柯萨奇病毒A4型(CVA4)的全基因组特征。方法选取2013—2015年间青岛地区流行的4株CVA4病毒,通过一步法RT-PCR对毒株进行全基因组扩增,采用MEGA7.0软件进行序列比对及系统进化分析,采用similarity plots 3.5.1软件进行基因重组分析。结果进化分析显示:在全基因组、P1区、P2区及P3区系统进化树上:毒株HS312/QD/CHN/2013和HS605/QD/CHN/2014与国内早期分离株共处同一分支;毒株FY218/QD/CHN/2015与2013年江苏温州分离株CV-A4/P1033/2013/China一起在各基因进化树上形成一独立分支;毒株HS144/QD/CHN/2014在P1区进化树上与HS312/QD/CHN/2014、HS605/QD/CHN/2014及国内早期分离株共处同一分支,但在全基因组、P2区及P3区进化树上各形成单一分支。重组分析提示:毒株HS144/QD/CHN/2014与2013年大陆流行的CVA2型毒株CV-A2/P373/2013/China在2C区~3D区间(5081~7301)发生基因重组;毒株FY218/QD/CHN/2015与毒株CV-A4/P1033/2013/China同源,都与CVA2型分离株CV-A2/P373/2013/China在2A区~2B区间(3821~4161)发生基因重组。结论青岛地区流行的CVA4在全基因组层面有明显的遗传多样性。

2015—2022年江苏省柯萨奇病毒A组4型全基因组序列特征分析

目的回顾性分析2015—2022年江苏省柯萨奇病毒A组4型(CVA4)的分子流行病学特征及重组情况。方法收集疱疹性咽峡炎和手足口病患者咽拭子或肛拭子标本,采用荧光定量PCR检测试剂盒对CVA4进行鉴定。利用72个CVA4完整基因组序列、99个CVA4 VP1序列进行全面系统的系统发育分析,同时采用生物信息学软件DNAStar、MEGA7.0和Similarity plots3.5.1对江苏省CVA4分离株同源性、基因重组和氨基酸变异位点进行分析。结果根据现有VP1核苷酸序列CVA4被分为A、B、C和D基因型,基因型C可以进一步分为C1~C55个亚基因型,其中,C2基因型是与手足口病相关的CVA4主要亚基因型。江苏省分离株序列在P1区与CVA4原型具有较高的同源性,而在P2和P3区与其他肠道病毒A组(EV-A)流行株具有较高的同源性。重组分析表明,江苏省分离株在P2、P3和3′-UTR区与其他EV-A流行株存在3种基因重组模式,这些重组模式是CVA4在人群中持续和广泛传播过程中获得的,更利于CVA4传播。结论分析28个江苏省分离株CVA4完整基因组的系统发育和分子特征,丰富了已知CVA4基因组多样性;研究基因重组和VP1氨基酸位点突变情况、及时把控CVA4感染及疾病发生造成的影响,可更好地了解CVA4的进化关系和传播途径,从而帮助指导疾病控制和预防。

手足口病柯萨奇病毒A2、A4和A5型SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立一种快速、灵敏、特异的SYBR GreenⅠ实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(rRT-PCR)方法,以期用于检测柯萨奇病毒A2、A4和A5型。方法根据3种病毒vp1基因保守序列设计特异性引物,建立并优化SYBR GreenⅠrRT-PCR方法。分别构建3种病毒的vp1部分基因的重组质粒作为病毒的体外转录标准品,分别以100~109和102~105倍稀释的标准品、其他6种肠道病毒、两种呼吸道RNA病毒及以临床诊断为手足口病的临床标本为模板,经过优化SYBR GreenⅠrRT-PCR反应条件,建立标准曲线和溶解曲线对其灵敏度、重复性、特异性进行评价,分析其临床应用中的效果。结果成功建立了3种柯萨奇病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量rRT-PCR方法及定量标准曲线,方法的灵敏度为101copies/μl质粒标准品,变异系数均<2%,与柯萨奇病毒A组6、10、16型,肠道病毒EV71型,诺如病毒,轮状病毒,麻疹病毒和乙型流感病毒均无交叉反应。检测84份手足口病临床标本,阳性率分别为36.9%(CVA4)、8.33%(CVA5)和7.14%(CVA2),经测序验证符合率为100%。结论建立的检测柯萨奇病毒A2、A4和A5型的SYBR GreenⅠrRT-PCR方法具有良好的灵敏度、重复性和特异性,可用于手足口病病原体的分型检测。

四川省德阳市柯萨奇病毒A组4型基因特征分析

目的分析四川省德阳市柯萨奇病毒A组4型(coxsackievirus A4,CV-A4)的基因特征。方法对2014-2015年德阳市手足口病咽拭子标本进行病毒分离和核苷酸测序,VP1区序列与世界各地的CV-A4参考株序列构建进化树并分析基因特征。结果德阳市5株CV-A4分离株之间,VP1区核苷酸序列一致性91.5%~96.8%(推导氨基酸序列一致性97.7%~99.3%);同CV-A4原型株(High Point)比较,核苷酸序列一致性≥84.0%(推导氨基酸序列一致性≥97.0%);进化树分析显示,德阳市CV-A4分离株均为G1B基因亚型,分别与云南、上海和浙江分离株有较近的亲缘关系。G1B基因亚型内的平均核苷酸遗传距离为10.4%。结论德阳市CV-A4为G1B基因亚型,为中国大陆的优势基因亚型;VP1区核苷酸变异较大,形成不同的进化分支并在德阳市循环传播。

一起由柯萨奇病毒A组引起的呼吸道感染疫情病原分子特征分析

目的分析2018年11月深圳市大鹏新区某小学1起呼吸道感染疫情的病原学及分子遗传学特征。方法采用实时荧光RT-PCR对采集的患儿咽拭子标本进行常见呼吸道病毒及肠道病毒的检测,对肠道病毒阳性样本进一步分型鉴定。通过RT-PCR扩增、测序并获得VP1基因序列,运用MEGA 7.0软件分析VP1的分子特征,构建遗传进化树。结果采集的11份样本全部是常见呼吸道病毒阴性,其中5份为柯萨奇病毒A组(简称CVA4)阳性。VP1区基因序列分析表明:本次疫情毒株的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.9%~100.0%,100.0%。系统进化树结果显示,5株毒株亲缘关系最近,应来自于同一亲缘株;与国内分离株位于同一分支,而且与2017年山东、2016年广东和宁夏的分离株亲缘关系较近;5株毒株与国外的CVA4毒株位于不同的分支,亲缘关系较远,其中包括来自美国的CVA4原型株AY421762,但未见特异性的氨基酸差异位点。结论本起呼吸道感染暴发疫情由CVA4毒株引起,肠道病毒引起的呼吸道系统疾病应受到足够重视。

2010-2015年广州地区手足口病Cox A6,Cox A4和Cox A10的病原监测和流行分析

目的 了解引起广州地区手足口病（HFMD）的柯萨奇病毒A组6型（Cox A6）、A组4型（Cox A4）和A组10型（Cox A10）的分子流行病学特征。方法 对2010-2015年收集的HFMD病例标本进行荧光定量PCR检测,以Cox A6、Cox A4和Cox A10的VP1部分基因序列进行同源分析和构建系统发育树。运用统计学方法对不同肠道病毒引起的HFMD流行特征进行描述性分析。结果 从广州地区HFMD患儿的12 054份临床标本中检出8945份肠道病毒阳性,其中2174份为Cox A6（24.30%）,144份为Cox A4（1.61%）,155份为Cox A10阳性（1.73%）。Cox A6和Cox A10的主要感染人群为1~2岁幼儿,Cox A4为3~4岁幼儿,男性病例多于女性。HFMD发病时间集中于的4-10月。广州市肠道病毒Cox A6、Cox A4和Cox A10流行株与国内其他地区的流行株亲缘关系接近。结论 广州地区引起HFMD流行的优势病毒株包括EV71、Cox A16和Cox A6 3种肠道病毒,并呈交替或共同流行状态。Cox A4和Cox A10也是重要的病原体。应加强肠道病毒流行趋势的长期监测及深入研究,以掌握HFMD流行的变化趋势。

深圳市大鹏新区2起儿童疱疹性咽颊炎聚集性疫情的病原鉴定与基因分型分析

【目的】分析2021年5月深圳市大鹏新区2起儿童疱疹性咽颊炎疫情的病原特征及其基因型。【方法】采集2起疱疹性咽峡炎暴发疫情患儿的5份咽拭子,用实时荧光聚合酶链式反应(PCR)对其进行常见肠道病毒的基因检测,采用逆转录巢式聚合酶链式反应(RT⁃nPCR)法扩增肠道病毒VP1区,通过测序和比对进行序列分析,运用MEGA7软件中的CLUSTAL W程序进行位点对齐并构建系统进化树。【结果】引起这2起疱疹性咽峡炎疫情的病原体为柯萨奇病毒A4(CVA4)。VP1区基因序列分析发现2起疫情样本之间的核苷酸同源性为92%;A幼儿园的3株毒株与深圳2018株(MN840533)进化关系最近,核苷酸同源性为98.11%;B幼儿园的2株毒株与四川2018株(MW178763)进化关系最近,核苷酸同源性为97.88%。系统进化树显示,本研究的5株CVA4病毒均属C2基因亚型。【结论】2起儿童疱疹性咽颊炎疫情都是由CVA4病毒引起,均属C2基因亚型。