2009-2015年青岛市手足口病病原中柯萨奇病毒A4型VP1区基因特征分析

目的阐明2009-2015年引起青岛市手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)的病原之一柯萨奇病毒A4型(CV-A4)VP1编码区的基因特征。方法用荧光RT-PCR法对青岛市2009-2015年HFMD患者的咽拭子标本进行总肠道病毒(EV)、柯萨奇病毒A16(CV-A16)型和肠道病毒71(EVA71)型检测,以半巢式反转录PCR扩增非EV-A71,非CV-A16型肠道病毒VP1区部分基因序列,结合序列分析鉴定CV-A4血清型。对全部CV-A4阳性分离株进行VP1基因全长序列扩增及基因序列测定。用MEGA 5.0软件进行遗传进化及分子特征分析。结果青岛市2009-2015年7 967份HFMD患者的咽拭子标本中共分离到CV-A4 39株,分别占各年度肠道病毒总构成比的0.18%(1/541)、0.21%(2/944)、0.29%(2/681)、1.37%(4/292)、2.25%(12/534)、0.75%(7/928)和1.86%(11/591)。遗传进化分析显示,94.87%(37/39)的青岛地区CV-A4分离株位于C2b亚型,5.13%(2/39)位于C1亚型;青岛C2b亚型病毒株VP1区核苷酸一致性为90.7%~100.0%,氨基酸一致性为96.9%~100.0%。结论 CVA4不是引起HFMD的优势病原,C2b亚型毒株是青岛市CV-A4的优势流行株,同时伴有C1亚型毒株的流行。

泰安市2017-2018年柯萨奇病毒A4型分离株全基因组特征

目的分析2017—2018年泰安市柯萨奇病毒A4型(Coxsackievirus A4,CV-A4)分离株的基因组特征。方法收集2017—2018年到泰安市妇幼保健院就诊且临床表征为手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)特征的患儿咽拭子样本共60份,利用肠道病毒(enterovirus,EV)通用引物,经荧光定量PCR进行鉴定。核酸阳性样本进行高通量测序。通过Mega5.05、RaxML软件进行全基因组序列及VP1基因系统发育分析,并进行同源性及氨基酸突变位点分析。结果4条CV-A4全基因组序列,标本来自17~19月龄幼儿。系统进化分析表明,除了MG550920/AA/Henan/2016以外,包括4株泰安株以内的中国CV-A4毒株(97.2%)均位于Group 3分支。根据VP1基因可划分为4个基因型,98.5%的国内毒株均位于基因型D分支,4株泰安株位于基因型D2。值得注意的是,分离株A1/Taian同澳大利亚株(C179、C062)的全长序列及VP1基因进化关系均较近,且均与本实验室2016年烟台分离株YT184R高度同源。与CV-A4原型株High Point相比,4个泰安株在结构蛋白编码区即P1区共有18个位点发生氨基酸突变。结论4株泰安CV-A4分离株同国内多数CV-A4株的全基因组及VP1基因均位于同一进化分支,为近期国内流行株,与原型株相比其P1区发生了多个氨基酸变异,值得进一步研究。

4株手足口病相关柯萨奇病毒A4型的全基因组特征

目的了解青岛地区流行的柯萨奇病毒A4型(CVA4)的全基因组特征。方法选取2013—2015年间青岛地区流行的4株CVA4病毒,通过一步法RT-PCR对毒株进行全基因组扩增,采用MEGA7.0软件进行序列比对及系统进化分析,采用similarity plots 3.5.1软件进行基因重组分析。结果进化分析显示:在全基因组、P1区、P2区及P3区系统进化树上:毒株HS312/QD/CHN/2013和HS605/QD/CHN/2014与国内早期分离株共处同一分支;毒株FY218/QD/CHN/2015与2013年江苏温州分离株CV-A4/P1033/2013/China一起在各基因进化树上形成一独立分支;毒株HS144/QD/CHN/2014在P1区进化树上与HS312/QD/CHN/2014、HS605/QD/CHN/2014及国内早期分离株共处同一分支,但在全基因组、P2区及P3区进化树上各形成单一分支。重组分析提示:毒株HS144/QD/CHN/2014与2013年大陆流行的CVA2型毒株CV-A2/P373/2013/China在2C区~3D区间(5081~7301)发生基因重组;毒株FY218/QD/CHN/2015与毒株CV-A4/P1033/2013/China同源,都与CVA2型分离株CV-A2/P373/2013/China在2A区~2B区间(3821~4161)发生基因重组。结论青岛地区流行的CVA4在全基因组层面有明显的遗传多样性。

2023年自贡市一起柯萨奇病毒A4引起的幼儿园疱疹性咽峡炎暴发疫情

目的 了解柯萨奇病毒A4(coxsackievirus A4,CV-A4)引起的疱疹性咽峡炎暴发疫情的流行病学特征及排毒时长,为疱疹性咽峡炎暴发疫情防控提供数据支撑。方法 2023年5月对自贡市金苹果幼儿园1起疱疹性咽峡炎暴发疫情进行调查处置,采集幼儿园小2班教师2份、全体儿童咽拭子9份和环境样本10份,经RT-PCR肠道病毒核酸检测,对阳性儿童再次连续采样(间隔1周)至核酸检测阴性时终止。结果 本次疫情共发现病例14名,罹患率为53.9%(14/26)。患儿临床症状以发热(100.0%)、咽痛(78.6%)及咽峡部疱疹(71.4%)为主,咽拭子和环境样本中均检出肠道病毒核酸阳性,分型为CV-A4。排毒时长中位数为21(95%CI:14.0~28.0)d,生存分析检验显示病例与隐性感染者、男性与女性排毒时长差异无统计学意义。结论 本次疫情为一起CV-A4型引起的幼儿园疱疹性咽峡炎暴发疫情,排毒时间较长,建议幼儿园、学校在节假日后强化晨午检工作,持续对儿童进行追踪随访,卫生与教育部门协同做好流行季节肠道病原学监测。

手足口病柯萨奇病毒A2、A4和A5型SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立一种快速、灵敏、特异的SYBR GreenⅠ实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(rRT-PCR)方法,以期用于检测柯萨奇病毒A2、A4和A5型。方法根据3种病毒vp1基因保守序列设计特异性引物,建立并优化SYBR GreenⅠrRT-PCR方法。分别构建3种病毒的vp1部分基因的重组质粒作为病毒的体外转录标准品,分别以100~109和102~105倍稀释的标准品、其他6种肠道病毒、两种呼吸道RNA病毒及以临床诊断为手足口病的临床标本为模板,经过优化SYBR GreenⅠrRT-PCR反应条件,建立标准曲线和溶解曲线对其灵敏度、重复性、特异性进行评价,分析其临床应用中的效果。结果成功建立了3种柯萨奇病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量rRT-PCR方法及定量标准曲线,方法的灵敏度为101copies/μl质粒标准品,变异系数均<2%,与柯萨奇病毒A组6、10、16型,肠道病毒EV71型,诺如病毒,轮状病毒,麻疹病毒和乙型流感病毒均无交叉反应。检测84份手足口病临床标本,阳性率分别为36.9%(CVA4)、8.33%(CVA5)和7.14%(CVA2),经测序验证符合率为100%。结论建立的检测柯萨奇病毒A2、A4和A5型的SYBR GreenⅠrRT-PCR方法具有良好的灵敏度、重复性和特异性,可用于手足口病病原体的分型检测。

四川省德阳市柯萨奇病毒A组4型基因特征分析

目的分析四川省德阳市柯萨奇病毒A组4型(coxsackievirus A4,CV-A4)的基因特征。方法对2014-2015年德阳市手足口病咽拭子标本进行病毒分离和核苷酸测序,VP1区序列与世界各地的CV-A4参考株序列构建进化树并分析基因特征。结果德阳市5株CV-A4分离株之间,VP1区核苷酸序列一致性91.5%~96.8%(推导氨基酸序列一致性97.7%~99.3%);同CV-A4原型株(High Point)比较,核苷酸序列一致性≥84.0%(推导氨基酸序列一致性≥97.0%);进化树分析显示,德阳市CV-A4分离株均为G1B基因亚型,分别与云南、上海和浙江分离株有较近的亲缘关系。G1B基因亚型内的平均核苷酸遗传距离为10.4%。结论德阳市CV-A4为G1B基因亚型,为中国大陆的优势基因亚型;VP1区核苷酸变异较大,形成不同的进化分支并在德阳市循环传播。

手足口病患儿柯萨奇病毒A4的鉴定及其5′UTR-VP4-VP2区序列分析

目的分析2009年北京市西城区手足口病患儿柯萨奇病毒A4(CoxA4)5′UTR-VP4-VP2区进化特征,探讨其与国内外其他地区CoxA4分离株的关系。方法提取病毒RNA,进行半巢式RT-PCR扩增肠道病毒(EV)5′UTR-VP4-VP2区。通过测序和Blast比对确定EV型别;并对其进行序列和进化分析。结果共鉴定出两株CoxA4,Genbank登录号为JQ429434和JQ429435。进化分析表明,CoxA4包括3个进化树分支:原型株AY421762位于独立的分支,其余CoxA4构成两个基因型(Ⅰ型和Ⅱ型),每个基因型包括两个亚型(A和B)。在5′UTR-VP4-VP2区,两株CoxA4核苷酸序列同源性为96.00%;它们与原型株、基因Ⅰ型及Ⅱ型毒株序列同源性分别为87.00%～88.00%,85.00%～87.00%,92.00%～98.00%。两株CoxA4与其他中国株均位于基因Ⅱ型分支上。结论北京市西城区CoxA4株与我国近年CoxA4流行株在5′UTR-VP4-VP2区具有较高的同源性,且进化关系密切。

一起由柯萨奇病毒A组引起的呼吸道感染疫情病原分子特征分析

目的分析2018年11月深圳市大鹏新区某小学1起呼吸道感染疫情的病原学及分子遗传学特征。方法采用实时荧光RT-PCR对采集的患儿咽拭子标本进行常见呼吸道病毒及肠道病毒的检测,对肠道病毒阳性样本进一步分型鉴定。通过RT-PCR扩增、测序并获得VP1基因序列,运用MEGA 7.0软件分析VP1的分子特征,构建遗传进化树。结果采集的11份样本全部是常见呼吸道病毒阴性,其中5份为柯萨奇病毒A组(简称CVA4)阳性。VP1区基因序列分析表明:本次疫情毒株的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.9%~100.0%,100.0%。系统进化树结果显示,5株毒株亲缘关系最近,应来自于同一亲缘株;与国内分离株位于同一分支,而且与2017年山东、2016年广东和宁夏的分离株亲缘关系较近;5株毒株与国外的CVA4毒株位于不同的分支,亲缘关系较远,其中包括来自美国的CVA4原型株AY421762,但未见特异性的氨基酸差异位点。结论本起呼吸道感染暴发疫情由CVA4毒株引起,肠道病毒引起的呼吸道系统疾病应受到足够重视。

2010-2015年广州地区手足口病Cox A6,Cox A4和Cox A10的病原监测和流行分析

目的 了解引起广州地区手足口病（HFMD）的柯萨奇病毒A组6型（Cox A6）、A组4型（Cox A4）和A组10型（Cox A10）的分子流行病学特征。方法 对2010-2015年收集的HFMD病例标本进行荧光定量PCR检测,以Cox A6、Cox A4和Cox A10的VP1部分基因序列进行同源分析和构建系统发育树。运用统计学方法对不同肠道病毒引起的HFMD流行特征进行描述性分析。结果 从广州地区HFMD患儿的12 054份临床标本中检出8945份肠道病毒阳性,其中2174份为Cox A6（24.30%）,144份为Cox A4（1.61%）,155份为Cox A10阳性（1.73%）。Cox A6和Cox A10的主要感染人群为1~2岁幼儿,Cox A4为3~4岁幼儿,男性病例多于女性。HFMD发病时间集中于的4-10月。广州市肠道病毒Cox A6、Cox A4和Cox A10流行株与国内其他地区的流行株亲缘关系接近。结论 广州地区引起HFMD流行的优势病毒株包括EV71、Cox A16和Cox A6 3种肠道病毒,并呈交替或共同流行状态。Cox A4和Cox A10也是重要的病原体。应加强肠道病毒流行趋势的长期监测及深入研究,以掌握HFMD流行的变化趋势。