柯萨奇病毒B组5型TaqMan一步法RT-qPCR检测方法的建立

目的建立柯萨奇病毒B组5型(coxsackievirusB5,CV-B5)特异的TaqMan一步法实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测方法。方法根据CV-B5的VP1序列,设计特异性引物和TaqMan探针。将目的基因插入pMD18^(TM)载体,在DH5α感受态细胞中扩增,大肠杆菌体外转录后获得RNA标准品并建立标准曲线,最后对检测方法的重复性、敏感度和特异性进行评价。结果该方法在10^(3)~10^(11)拷贝/微升的模板范围内具有良好的线性关系(r^(2)>0.99),扩增效率E=100.9%,敏感度达1×10^(3)拷贝/微升,只对CV-B5有特异性扩增曲线,且重复性较好。结论本实验建立的TaqMan一步法RT-qPCR检测方法有较高的敏感度、特异性和重复性,有良好的抗干扰性,可用于CV-B5的临床样本检测和绝对定量分析。

柯萨奇病毒B组1型感染动物模型研究进展

柯萨奇病毒B组1型(coxsakievirus B1,CVB1)能引起人类心肌炎、无菌性脑膜炎、新生儿全身感染等多种疾病,幼儿感染后病情较重甚至引发死亡,而目前尚无针对该病毒的疫苗及特效治疗药物。因此,建立并开展相关动物模型研究对CVB1感染后的机体免疫反应、病毒毒力机制、药物疫苗研发等问题的解决具有重要意义,同时也能为临床治疗提供部分依据。本文通过对CVB1病毒感染构建的不同动物模型进行总结,以期望为建立合适的动物模型以及开展相关研究提供参考。

抗柯萨奇病毒B型药物的研究进展

柯萨奇病毒B型(Coxsackieviruses B,CVB)是一种微小、无包膜的单正链RNA病毒,属于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus),主要经消化道传播。CVB感染可以引起多种疾病,如手足口病、腹泻、急性心肌炎、无菌性脑膜炎、骨髓炎及出疹性疾病等。此外,CVB感染也是Ⅰ型糖尿病的诱发因素,严重威胁人们健康。目前,越来越多的天然和人工合成化合物以及单克隆抗体等已经被用于CVB感染的治疗,但是高效抗CVB药物仍然缺乏。本文对抗CVB病毒的药物进行综述,以期为CVB的预防、治疗和药物研发提供思路和依据。

lncRNA MAGI2-AS3靶向调控miR-130a-5p对柯萨奇病毒B3诱导的大鼠心肌细胞H9C2损伤的影响

目的:探讨lncRNA MAGI2-AS3靶向miR-130a-5p调控柯萨奇病毒B3(CVB3)诱导的大鼠心肌细胞H9C2损伤的分子机制。方法:对照组,用不含药物、病毒的DMEM处理H9C2细胞48 h。CVB3组,用含有100倍半数组织培养感染剂量CVB3的DMEM处理H9C2细胞48 h(感染)。CVB3+sh-NC组,H9C2细胞转染sh-NC慢病毒后感染CVB3。CVB3+sh-MAGI2-AS3组,H9C2细胞转染sh-MAGI2-AS3慢病毒后感染CVB3。CVB3+miR-NC组,H9C2细胞转染miR-NC后感染CVB3。CVB3+miR-130a-5p组,H9C2细胞转染miR-130a-5p mimic后感染CVB3。sh-MAGI2-AS3+抗miR-NC组,sh-MAGI2-AS3、抗miR-NC共转染H9C2细胞后感染CVB3。sh-MAGI2-AS3+抗miR-130a-5p组,sh-MAGI2-AS3、抗miR-130a-5p共转染H9C2细胞后感染CVB3。qRT-PCR检测MAGI2-AS3、miR-130a-5p相对表达量;Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率;ELISA法检测TNF-α、IL-6分泌水平;双荧光素酶报告实验验证MAGI2-AS3与miR-130a-5p靶向关系;Western blot检测Bcl-2、Cleaved-Caspase-3蛋白相对表达量。结果:与对照组比较,CVB3组MAGI2-AS3相对表达量、细胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3蛋白表达水平及TNF-α、IL-6分泌水平升高,而miR-130a-5p相对表达量、Bcl-2蛋白表达水平降低(P<0.05)。分别与CVB3+sh-NC组、CVB3+miR-NC组相比,CVB3+sh-MAGI2-AS3组、CVB3+miR-130a-5p组细胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3蛋白表达水平及TNF-α、IL-6分泌水平降低,Bcl-2蛋白表达水平升高(P<0.05)。MAGI2-AS3可靶向调控miR-130a-5p表达。与sh-MAGI2-AS3+抗miR-NC组比较,sh-MAGI2-AS3+抗miR-130a-5p组细胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3蛋白表达水平及TNF-α、IL-6分泌水平升高,Bcl-2蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论:沉默MAGI2-AS3可通过上调miR-130a-5p而抑制细胞凋亡、炎症反应,进而减轻CVB3诱导的H9C2细胞损伤。

辽宁省首株柯萨奇病毒B组5型全基因组序列分析

研究引起辽宁地区手足口病的柯萨奇病毒B组5型(coxsackievirus B5,CV-B5)基因组特征。对2018年从辽宁省688份肠道病毒核酸阳性的标本中分离到的1株CV-B5进行高通量测序,并对其全基因组进行遗传进化分析。结果表明,CV-B5辽宁分离株与国内流行株的全基因组核苷酸序列同源性为78.5%~97%,氨基酸序列同源性为75.3%~96.7%。基于全基因组的进化分析将CV-B5流行株分为A~D四个基因型,辽宁分离株属于D基因型。通过重组分析发现其在P3区的3D区段发生重组。首次在辽宁地区手足口病患儿中分离出CV-B5,辽宁省分离株(LN2018-23-21/CHN/2018)可能为重组株。

柯萨奇病毒B组3型上海分离株的基因特征分析

为探讨上海市不同来源的柯萨奇病毒B组3型(coxsackievirus B3,CVB3)菌株的循环动态变化及基因特征,本研究对分离自上海市环境污水、健康儿童和急性弛缓性麻痹(acute flaccid paralysis,AFP)病例中的CVB3菌株进行VP1区基因序列测定,并对照全球CVB3代表株进行序列相似性分析和系统发生学分析。结果显示,1989-2021年上海市不同来源的CVB3分离株共有120株,属于D、E基因亚型。上海CVB3分离株的核苷酸和氨基酸相似性差异较大,分别为78.7%~100%和93.3%~100.0%。2016年首次从上海环境污水中分离到E基因亚型CVB3,2021年再次分离到该基因亚型。2021年上海环境污水中的E基因亚型CVB3分离株与2020年的广东手足口病(hand,foot,and mouth disease,HFMD)病例CVB3分离株VP1区的核苷酸相似性较高,但上海暂未有该基因亚型感染病例报道。因此,仍须长期对环境污水和不同肠道病毒感染病例进行监测,以提高肠道病毒监测的敏感性,为肠道病毒相关疾病的诊疗提供数据支撑。

柯萨奇病毒B组1型感染叙利亚金黄地鼠动物模型建立

目的建立叙利亚金黄地鼠CVB1(Coxsackievirus B1,CVB1)感染动物模型。方法取叙利亚金黄地鼠经鼻腔滴注方式呼吸道感染CVB1,感染剂量每只为10^(7.25)CCID_(50)。观察14 d体重、体温、精神状态、皮肤黏膜变化、行为、粪便状态、是否有神经症状等临床情况;每天采集咽拭子、鼻灌洗液以及粪便进行病毒载量检测,感染第7天取3只实施安乐死,采血进行病毒载量及生化检测;同时采集脑、心脏、肝等多个组织样品进行病毒载量、组织病理学和IHC检测。结果感染CVB1病毒的动物在14 d内均出现不同程度精神萎靡、体温下降,以及口唇部出现典型的红疹及疱疹等类似人类手足口病临床表现。咽拭子、鼻灌洗液、粪便以及血液中能检测到病毒;组织中检测到病毒载量并观察到病毒抗原,同时伴有炎症、增生、出血等病理改变;血清酶中肝功、心肌酶升高。结论CVB1病毒经滴鼻方式感染叙利亚金黄地鼠建立的感染模型,表现出心肌和肝等组织器官的病理损伤特征,可用于人类手足口病的研究。

柯萨奇病毒B3(CVB3)通过激活NADK2促进小鼠巨噬细胞NLRP3的活化

目的研究在柯萨奇病毒B3(CVB3)刺激下,小鼠巨噬细胞中含pyrin结构域NOD样受体家族蛋白3(NLRP3)表达的变化及机制。方法CVB3刺激RAW264.7细胞、小鼠原代(骨髓来源或腹腔)巨噬细胞以及感染NLRP3短发夹RNA(shRNA-NLRP3)慢病毒的RAW264.7细胞,实时荧光定量PCR检测NLRP3和白细胞介素1β(IL-1β)表达水平;ELISA检测细胞上清中IL-1β的含量;Western blot法检测NLRP3蛋白的变化,免疫共沉淀(Co-IP)法检测NLRP3相互作用蛋白的表达。结果CVB3刺激RAW264.7细胞、骨髓来源或腹腔巨噬细胞后,NLRP3和IL-1β表达明显升高;下调NLRP3后,IL-1β分泌明显减少;NLRP3抗体Co-IP所得复合物银染,组间差异蛋白经质谱分析鉴定为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶2(NADK2),证明CVB3诱导NADK2与NLRP3相互作用。结论CVB3通过激活NADK2促进巨噬细胞NLRP3活化,增加炎症因子IL-1β表达和释放。

柯萨奇病毒B组5型非结构蛋白抑制NF-κB信号通路的作用机制研究

目的 柯萨奇病毒B组5型(CVB5)是手足口病的重要病原体之一,可导致发热、皮疹或疱疹等临床症状,重症者出现神经系统疾病,甚至死亡。天然免疫应答是机体抗病毒入侵的第一道防线,其中核因子κB (NF-κB)是宿主天然免疫反应中的重要蛋白质,然而关于CVB5感染后调控NF-κB介导信号通路的研究尚鲜有报道。方法 本研究通过检测启动子活性、促炎因子水平以及通路中关键蛋白表达等,阐明CVB5对NF-κB信号通路的调控作用机制。结果 CVB5感染可抑制促炎因子表达和p65的磷酸化。CVB5非结构蛋白(NSP)可抑制促炎因子表达以及重要蛋白p65和IκBα的磷酸化。经STRING11.1数据库预测表明,CVB5 3CD蛋白与宿主多聚胞嘧啶结合蛋白1 (PCBP1)具有相互作用,且PCBP1可促进IκBα和p65的磷酸化,抑制病毒复制。结论 CVB5 NSP可负调控NF-κB信号通路,且与3CD相互作用的PCBP1蛋白可通过调控NF-κB通路抑制CVB5复制。本研究探索病毒与宿主天然免疫应答的调控作用,从而为研制抗CVB5感染的药物提供作用靶点。

抗柯萨奇病毒B病毒性心肌炎胶囊对病毒性心肌炎小鼠血清CK、LDH、cTnI的影响

目的:探讨抗柯萨奇病毒B病毒性心肌炎胶囊(K-CoxB-JN)对于阿霉素(ADM)诱导小鼠心肌损伤模型的保护作用。方法:将小鼠随机分为5组,正常对照组、模型组、K-CoxB-JN低剂量组、K-CoxB-JN中剂量组、K-CoxB-JN高剂量组,观察K-CoxB-JN对心肌组织病理、小鼠心脾指数、小鼠血清血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、心肌肌钙蛋白I(cTn)I的影响。结果:K-CoxB-JN低、中、高剂量组炎性和坏死病理改变明显轻于模型组;K-CoxB-JN中、高剂量组的心脏指数与模型组比较,差异均有非常显著性意义(P<0.01),K-CoxB-JN中剂量组的小鼠脾脏指数与模型组比较,差异有显著性意义(P<0.05);K-CoxB-JN低、中、高剂量组CK和cTnI的值均降低,与模型组比较,差异均有非常显著性意义(P<0.01),K-CoxB-JN中剂量组LDH的值降低,与模型组比较,差异有显著性意义(P<0.05)。结论:K-CoxB-JN对心肌损伤小鼠血清CK、LDH、cTnI有抑制作用,K-CoxB-JN对心肌具有保护作用。

孕期柯萨奇病毒B型感染对母儿的影响

目的探讨孕期柯萨奇病毒B型感染对母亲和围产儿的影响。方法1993至2003年间前瞻性对可疑柯萨奇病毒感染的孕妇进行全套辅助检查。将其中70例孕期柯萨奇病毒B型抗原和抗体阳性且临床资料完整的孕产妇作为孕期感染组,根据感染时间分为早期、中期、晚期3个亚组;59例有心肌炎后遗症病史者为心肌炎后遗症组;408例正常分娩者作为对照。结果①柯萨奇病毒B型感染对孕产妇心脏有不同程度的影响,各种心律失常的发生率为70%,严重心功能衰竭的发生率为8.57%。不同孕期感染者的心律失常发生率、疾病种类及心功能不良发生率的差异无显著性(P>0.05)。孕期感染组与心肌炎后遗症组间,心功能下降发生率的差异无显著性(P>0.05)。②孕期感染组的平均孕周为38周,平均新生儿体重>3000 g。孕期感染组、心肌炎后遗症组与正常分娩组间平均孕周和平均新生儿体重的差异均无显著性(P值均>0.05)。③各组间围产儿疾病发生率的差异也无显著性(P>0.05)。结论①孕期柯萨奇病毒感染可以影响母亲心功能,出现各种心律失常,甚至因严重病毒性心肌炎而发生心功能衰竭。②经过积极治疗,可以改善心功能而继续妊娠,孕期感染组各亚组均可达到足月妊娠。③孕期病毒感染并未增加围产儿的发病率和死亡率,围产儿结局良好。

大蒜多糖体外抗柯萨奇病毒B_3作用

目的 研究大蒜多糖体外抗柯萨奇病毒B3 (CoxsackievirusgroupBtype3, CVB3 )作用。方法 观察大蒜多糖A,B,C的细胞毒性、对CVB3 直接灭活作用、抗CVB3 吸附作用及对CVB3 生物合成抑制作用。结果 大蒜多糖A,B,C对Hep 2细胞的半数中毒浓度(TC50 )分别为 1000, 800, 4000μg/mL;均无直接灭活CVB3 及抗CVB3 吸附作用;除A外,B和C均可剂量依赖性抑制CVB3 生物合成.。结论 大蒜多糖B和C在体外通过抑制CVB3 生物合成而发挥抗CVB3 的作用。

住院儿柯萨奇病毒B组感染状况的分析

目的 :分析近 3年院内柯萨奇病毒 B组感染状况 ,认识柯萨奇病毒 B组与小儿疾病的内在关系。 方法 :观察了 796例病儿 ,其中上呼吸道感染 2 18例、肺炎 179例、哮喘 10 6例、心肌炎 15 5例、紫癜 19例、其他疾病 89例。采用 EL ISA方法检测柯萨奇病毒 B组 (CVB)的抗原 (CVB- Ag)和抗体 Ig M(CVB- Ig M)。结果 :(1)上呼吸道感染组和肺炎组 CVB阳性率分别是47.2 5 %和 48.0 4% ,两组间无统计学差异 ;(2 )哮喘、心肌炎和紫癜儿 CVB阳性率分别是 6 2 .2 6 %、6 1.2 9%和 6 8.42 % ,三组间比较无统计学差异 ,但 CVB阳性率均高于上呼吸道感染组和肺炎组 (P<0 .0 5 ) ;(3)其他疾病组和健康儿 CV B感染发生率均低 (分别是 15 .73%和 3.33% ) ,两组间无差异。 结论 :CVB感染与小儿多种疾病相关 ,尤其应该重视研究 CVB感染与哮喘、病毒性心肌炎和过敏性紫癜发病的内在联系。

槐果碱体外抗柯萨奇病毒B3m的作用

目的 以HeLa细胞为模型，观察从苦参中提取的槐果碱在体外抗柯萨奇病毒B3m（CVB3m）的作用。方法 ①用微量细胞培养法观察槐果碱对HeLa细胞的毒性。②用细胞病变效应（CPE）抑制法观察槐果碱体外抗CVB3m作用。③用MTT法和结晶紫染色法观察槐果碱对CVB3m感染的HeLa细胞的保护作用：在96孔板上种植HeLa细胞并予CVB3m吸附1h，加入不同浓度的槐果碱，并设立病毒、细胞、槐果碱对照，培养15h后以MTT法和结晶紫染色法测定比较各组细胞能量代谢率和细胞存活数。结果 ①槐果碱稀释到〈391μg／mL，对HeLa细胞无毒性；≥783μg／mL引起HeLa细胞CPE。②槐果碱6．25～50μs／mL有直接抗病毒作用，减轻CPE；〉100μg／mL反而会加重、加快CPE。③槐果碱1．56～25μg／mL对感染CVB3m的HeLa细胞有保护作用，用MTT法和结晶紫染色法测得细胞能量合成代谢、细胞存活数较病毒对照组增加（P〈0．05）；槐果碱在50、100μg／mL时反而加重病毒对细胞的抑制，使细胞存活数、细胞代谢率较病毒对照组下降（P〈0．05）。结论 一定浓度的槐果碱在体外有抗CVB3m作用，对感染CVB3m的HeLa细胞有保护作用。

黄芩茎叶提取物与生脉饮抗柯萨奇病毒B3的体外研究

目的:探讨黄芩茎叶提取物及生脉饮体外抗柯萨奇病毒B3(CVB3)的作用。方法:应用细胞感染模型按照药物对Hela细胞及CVB3不同作用方式设直接抗病毒作用组、增强细胞抗病毒作用组、对感染细胞保护作用组及正交设计组。采用光镜观察并结合MTT测定的方法进行综合判断。结果:与病毒对照组比较黄芩茎叶提取物、生脉饮对细胞病变有抑制作用(P<0.05)。结论:黄芩茎叶提取物、生脉饮均有直接抗病毒作用以及对未感染或已感染Hela细胞的保护作用。生脉饮与黄芩茎叶提取物之间有交互作用。

空心莲子草微乳体外抗柯萨奇病毒B3的实验研究

目的:观察空心莲子草微乳在体外抗柯萨奇病毒B3(CVB3)的作用,为将纳米技术应用于该药的研发提供理论依据。方法:提取空心莲子草抗病毒活性成分并制备成微乳制剂,以高效液相法测定微乳中空心莲子草浓度,测定微乳的粒径及其分布,考察微乳的稳定性,通过细胞实验评价药物的抗病毒作用。结果:微乳的平均粒径为32 nm,具有很好的稳定性,有明显抑制CVB3的作用,治疗指数27.31。结论:空心莲子草微乳有显著的抗CVB3的作用,微乳化的空心莲子草安全性比未经微乳化的高。

雷帕霉素对柯萨奇病毒B3诱导的大鼠心肌细胞mTOR和eIF-4E表达的调控作用

目的:研究雷帕霉素对柯萨奇病毒B3(coxsackievirus B3,CVB3)诱导的心肌细胞哺乳类雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)和真核起始因子4E(eukaryotic initiation factor-4E,eIF-4E)表达的调控,探讨mTOR/eIF-4E信号传导在病毒性心肌炎(viral myocarditis,VM)的作用。方法:CVB3感染原代培养的SD大鼠心肌细胞建立病毒性心肌炎的细胞模型。根据细胞毒力实验筛选10 nmol/L的雷帕霉素干预CVB3感染的心肌细胞,采用RT-PCR和Western免疫印迹方法检测mTOR和eIF-4E mRNA表达及蛋白质水平。结果:CVB3诱导心肌细胞变性,雷帕霉素可减轻其变性;CVB3使大鼠心肌细胞的mTOR和eIF-4E mRNA和蛋白表达上调,与对照组比较,有统计学差异(P<0.05),雷帕霉素可使CVB3感染的心肌细胞mTOR和eIF-4E mRNA和蛋白表达明显下调,与CVB3组比较,有统计学差异(P<0.05)。结论:雷帕霉素能明显抑制CVB3感染的大鼠心肌细胞mTOR和eIF-4E表达,提示mTOR/eIF-4E信号传导在病毒性心肌炎中可能起重要作用。

柯萨奇病毒B4’致低硒鼠心肌损伤的实验研究

目的 探讨柯萨奇病毒B4’致低硒鼠心肌损伤的特点。方法 用补硒和低硒饲料分别喂养昆明鼠4周后交配,给其子代雄性鼠（出生后 4周）腹腔接种柯萨奇病毒B4’0.1ml,对照组接种等量RPMI 1640培养液。观察各组鼠的心肌光镜结果,全血中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性和肝脏组织中脂质过氧化物酶（LPO）含量。结果 低硒和补硒饲料病毒组的心肌病变检出率分别为78.1％和16.7％。低硒和补硒饲料对照组的心肌未见病变。低硒组全血中GSH-Px活性明显降低,LPO含量明显增高。结论 低硒可以使柯萨奇病毒B4’致昆明鼠心肌损伤加重。

支气管肺炎的柯萨奇病毒B组感染

为探讨柯萨奇病毒B组（CVB）感染与小儿支气管肺炎的关系，ELISA法检测CVB特异性抗体IgM，阳性率30．3％；RT-PCR技术检测CVB-RNA，阳性率4．8％。对CVB-IgM阳性患儿采用抗病毒治疗，疗效好。认为CVB感染已成为我国小儿支气管肺炎的重要病因，CVB-IgM检测简便，结果可靠，对临床治疗极具指导价值。

柯萨奇病毒B_3致病模型的建立

目的 :建立柯萨奇病毒 (CV)B3 的实验动物模型 ,以期为抗病毒药物筛选提供工具。方法 :雄性BALB/C鼠腹腔注射CVB3 后 ,观察小鼠发病症状 ,并在不同时间处死小鼠 ,取小鼠心、脾、肝、肾等组织进行病毒分离、病毒核酸检测、心肌组织病理检查。结果 :感染后第 3d小鼠即出现症状 ,第 5d在小鼠的心脏、脾脏、肾脏均可分离出感染性病毒 ,其滴度分别为 :10 4 .7,10 3.3 ,10 3.2 TCID50 / 0 .1ml,同时小鼠心、脾、肾、等组织及血清中CVB RNA检测为阳性 ,心肌组织出现典型炎性改变。结论 :雄性BALB/C鼠感染CVB3