柯萨奇病毒B组5型TaqMan一步法RT-qPCR检测方法的建立

目的建立柯萨奇病毒B组5型(coxsackievirusB5,CV-B5)特异的TaqMan一步法实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测方法。方法根据CV-B5的VP1序列,设计特异性引物和TaqMan探针。将目的基因插入pMD18^(TM)载体,在DH5α感受态细胞中扩增,大肠杆菌体外转录后获得RNA标准品并建立标准曲线,最后对检测方法的重复性、敏感度和特异性进行评价。结果该方法在10^(3)~10^(11)拷贝/微升的模板范围内具有良好的线性关系(r^(2)>0.99),扩增效率E=100.9%,敏感度达1×10^(3)拷贝/微升,只对CV-B5有特异性扩增曲线,且重复性较好。结论本实验建立的TaqMan一步法RT-qPCR检测方法有较高的敏感度、特异性和重复性,有良好的抗干扰性,可用于CV-B5的临床样本检测和绝对定量分析。

柯萨奇病毒B组1型感染动物模型研究进展

柯萨奇病毒B组1型(coxsakievirus B1,CVB1)能引起人类心肌炎、无菌性脑膜炎、新生儿全身感染等多种疾病,幼儿感染后病情较重甚至引发死亡,而目前尚无针对该病毒的疫苗及特效治疗药物。因此,建立并开展相关动物模型研究对CVB1感染后的机体免疫反应、病毒毒力机制、药物疫苗研发等问题的解决具有重要意义,同时也能为临床治疗提供部分依据。本文通过对CVB1病毒感染构建的不同动物模型进行总结,以期望为建立合适的动物模型以及开展相关研究提供参考。

柯萨奇病毒B组3型上海分离株的基因特征分析

为探讨上海市不同来源的柯萨奇病毒B组3型(coxsackievirus B3,CVB3)菌株的循环动态变化及基因特征,本研究对分离自上海市环境污水、健康儿童和急性弛缓性麻痹(acute flaccid paralysis,AFP)病例中的CVB3菌株进行VP1区基因序列测定,并对照全球CVB3代表株进行序列相似性分析和系统发生学分析。结果显示,1989-2021年上海市不同来源的CVB3分离株共有120株,属于D、E基因亚型。上海CVB3分离株的核苷酸和氨基酸相似性差异较大,分别为78.7%~100%和93.3%~100.0%。2016年首次从上海环境污水中分离到E基因亚型CVB3,2021年再次分离到该基因亚型。2021年上海环境污水中的E基因亚型CVB3分离株与2020年的广东手足口病(hand,foot,and mouth disease,HFMD)病例CVB3分离株VP1区的核苷酸相似性较高,但上海暂未有该基因亚型感染病例报道。因此,仍须长期对环境污水和不同肠道病毒感染病例进行监测,以提高肠道病毒监测的敏感性,为肠道病毒相关疾病的诊疗提供数据支撑。

辽宁省首株柯萨奇病毒B组5型全基因组序列分析

研究引起辽宁地区手足口病的柯萨奇病毒B组5型(coxsackievirus B5,CV-B5)基因组特征。对2018年从辽宁省688份肠道病毒核酸阳性的标本中分离到的1株CV-B5进行高通量测序,并对其全基因组进行遗传进化分析。结果表明,CV-B5辽宁分离株与国内流行株的全基因组核苷酸序列同源性为78.5%~97%,氨基酸序列同源性为75.3%~96.7%。基于全基因组的进化分析将CV-B5流行株分为A~D四个基因型,辽宁分离株属于D基因型。通过重组分析发现其在P3区的3D区段发生重组。首次在辽宁地区手足口病患儿中分离出CV-B5,辽宁省分离株(LN2018-23-21/CHN/2018)可能为重组株。

柯萨奇病毒B组1型感染叙利亚金黄地鼠动物模型建立

目的建立叙利亚金黄地鼠CVB1(Coxsackievirus B1,CVB1)感染动物模型。方法取叙利亚金黄地鼠经鼻腔滴注方式呼吸道感染CVB1,感染剂量每只为10^(7.25)CCID_(50)。观察14 d体重、体温、精神状态、皮肤黏膜变化、行为、粪便状态、是否有神经症状等临床情况;每天采集咽拭子、鼻灌洗液以及粪便进行病毒载量检测,感染第7天取3只实施安乐死,采血进行病毒载量及生化检测;同时采集脑、心脏、肝等多个组织样品进行病毒载量、组织病理学和IHC检测。结果感染CVB1病毒的动物在14 d内均出现不同程度精神萎靡、体温下降,以及口唇部出现典型的红疹及疱疹等类似人类手足口病临床表现。咽拭子、鼻灌洗液、粪便以及血液中能检测到病毒;组织中检测到病毒载量并观察到病毒抗原,同时伴有炎症、增生、出血等病理改变;血清酶中肝功、心肌酶升高。结论CVB1病毒经滴鼻方式感染叙利亚金黄地鼠建立的感染模型,表现出心肌和肝等组织器官的病理损伤特征,可用于人类手足口病的研究。

一株柯萨奇病毒B组5型(Cox.B5)病毒的分离及VP1基因分析

目的研究2009年昆明市无菌性脑膜炎的病原柯萨奇B5(coxsackie virus B5,CVB5)分离株(KMA193-09)的VP1基因特征。方法采用RD细胞、Hep-2细胞对患者粪便标本进行病毒分离,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒VP1基因并进行序列测定,用Mega 4.0等软件分析处理。结果从无菌性脑膜炎患者粪便标本中,分离到CVB5,其VP1区的核苷酸长度均为831bp,未发现核苷酸插入与丢失。与浙江COXB5/ZHEJIANG/12/02(CFS)株、山东02336/SD/CHN/2002/CB5株及浙江COXB5/ZHEJIANG/13/02株氨基酸同源性最高为98.19%,与国外毒株的同源性为95.67%～97.83%。在进化树上与YZ081/SD/CHN/2005/CB5株显示在同一个分支上。结论分离的肠道病毒为柯萨奇病毒B组5型(CVB5),分离株(KMA193-09)VP1区变异较小。

一株引起无菌性脑膜脑炎柯萨奇B组3型病毒的分离和VP1基因分析

摘要目的对一株从无菌性脑膜脑炎患者中分离到的柯萨奇B组3型病毒（coxsackievirusB3，CVB3）分离株KMA103-09进行VP1区的基因特征分析。方法采用Hep-2、RD细胞对患者粪便标本进行病毒分离，肠道病毒组合血清进行鉴别，反转录-聚合酶链反应（RT—PCR）扩增病毒目的片段，测序后进行VP1基因分析，用Mega4．1等软件分析处理。结果肠道病毒组合血清鉴别为柯萨奇病毒B组3型（Cox．B3），从病毒性脑膜脑炎患者粪便标本中，分离到CVB3，其VPl区的核苷酸长度为849bp，未发现核苷酸插入与丢失。与山东04433／SD／CHN／2004／CB3株、山东05280／SD／CHN／2005／CB3株及山东YZ127／SD／CHN／2005／CB3株氨基酸同源，与其余国内分离株同源性高于为99．29％，与国外毒株的同源性为95．41％-96．47％。在进化树上与AM06HZ／SD／CHN／2006／CB3株显示在同一个分支上。结论分离的肠道病毒为柯萨奇病毒B组3型（Cox．B3），分离株（KMA103—09）VP1区变异较小。

柯萨奇病毒B组5型非结构蛋白抑制NF-κB信号通路的作用机制研究

目的 柯萨奇病毒B组5型(CVB5)是手足口病的重要病原体之一,可导致发热、皮疹或疱疹等临床症状,重症者出现神经系统疾病,甚至死亡。天然免疫应答是机体抗病毒入侵的第一道防线,其中核因子κB (NF-κB)是宿主天然免疫反应中的重要蛋白质,然而关于CVB5感染后调控NF-κB介导信号通路的研究尚鲜有报道。方法 本研究通过检测启动子活性、促炎因子水平以及通路中关键蛋白表达等,阐明CVB5对NF-κB信号通路的调控作用机制。结果 CVB5感染可抑制促炎因子表达和p65的磷酸化。CVB5非结构蛋白(NSP)可抑制促炎因子表达以及重要蛋白p65和IκBα的磷酸化。经STRING11.1数据库预测表明,CVB5 3CD蛋白与宿主多聚胞嘧啶结合蛋白1 (PCBP1)具有相互作用,且PCBP1可促进IκBα和p65的磷酸化,抑制病毒复制。结论 CVB5 NSP可负调控NF-κB信号通路,且与3CD相互作用的PCBP1蛋白可通过调控NF-κB通路抑制CVB5复制。本研究探索病毒与宿主天然免疫应答的调控作用,从而为研制抗CVB5感染的药物提供作用靶点。

柯萨奇病毒B组5型分离株VP1区序列基因组成和密码子使用模式分析

目的探索柯萨奇病毒B组5型(Coxsackievirus group B5,CVB5)分离株VP1区序列基因组成和密码子使用模式。方法在GenBank核苷酸数据库检索CVB5毒株的VP1区全长序列,应用CodonW软件,计算CVB5分离株基因组成和密码子使用偏爱性参数,包括密码子和氨基酸含量、同义密码子各碱基含量、同义密码子第3位GC含量(GC_(3))、有效密码子数(ENC)和同义密码子相对使用度(Relative Synonymous Codon Usage,RSCU);通过ENC曲线、中性绘图、RSCU和奇偶规则(PR2)分析自然选择和突变对病毒的进化影响。结果共纳入413株CVB5分离株,其VP1区碱基含量由高到低依次为A(29.78%)、C(24.84%)、G(24.16%)、T(21.22%);密码子第3位密码子含量均值分别为A_(3)(25.90%)、T_(3)(23.31%)、C_(3)(26.31%)和G_(3)(24.49%);密码子含量前3位依次为GTG(4.67%)、ACA(3.73%)和CCA(3.70%),氨基酸含量前3位依次为Thr(11.25%)、Ser(8.11%)和Val(7.92%);共有59组密码子,其中29个同义密码子相对使用度(RSCU)均值>1,占49.15%。CVB5毒株VP1区有效密码子数(ENC)值为(55.96±2.40),中性绘图分析显示,GC_(3)和GC_(12)含量有统计学关联,但相关性较弱(b=0.046,r=0.316,P<0.001);PR2分析显示,自然选择对CVB5病毒密码子使用偏爱性作用为95.40%。结论 CVB5分离株总体密码子使用相似、偏爱性较弱,受到自然选择和突变双重影响,病毒进化相对保守。

柯萨奇病毒A组16型中国分离株(Cox.A16 SHZH00-1)全基因组序列测定及分析

对分离自2000年中国深圳地区手足口病患儿粪便标本的柯萨奇病毒A组16型(CoxsackievirusA16,Cox.A16)病毒SHZH00-1株进行全基因组序列测定及分析后发现,Cox.A16SHZH00-1的基因组(未包括多聚腺苷酸尾)长度为7410bp,其中5′端非编码区(5′UTR)长为745bp,病毒基因组编码区全长6582个核苷酸,编码一个含2193个氨基酸残基的多聚蛋白,3′端非编码区长为83bp。Cox.A16SHZH00-1基因组的结构与Cox.A16亚洲地方株Tainan-5079-98(AF177911)十分相近,整个基因组的核苷酸同源性为97.5%,氨基酸同源性为98.8%;而与Cox.A16国际标准株G10(U05876)差别较大,两者核苷酸同源性仅为79.1%,氨基酸同源性为94.5%。Cox.A16SHZH00-1与两株肠道病毒71型SHZH03(AY465356)和BrCr(U22521)比较,核苷酸同源性均不超过80%。

住院儿柯萨奇病毒B组感染状况的分析

目的 :分析近 3年院内柯萨奇病毒 B组感染状况 ,认识柯萨奇病毒 B组与小儿疾病的内在关系。 方法 :观察了 796例病儿 ,其中上呼吸道感染 2 18例、肺炎 179例、哮喘 10 6例、心肌炎 15 5例、紫癜 19例、其他疾病 89例。采用 EL ISA方法检测柯萨奇病毒 B组 (CVB)的抗原 (CVB- Ag)和抗体 Ig M(CVB- Ig M)。结果 :(1)上呼吸道感染组和肺炎组 CVB阳性率分别是47.2 5 %和 48.0 4% ,两组间无统计学差异 ;(2 )哮喘、心肌炎和紫癜儿 CVB阳性率分别是 6 2 .2 6 %、6 1.2 9%和 6 8.42 % ,三组间比较无统计学差异 ,但 CVB阳性率均高于上呼吸道感染组和肺炎组 (P<0 .0 5 ) ;(3)其他疾病组和健康儿 CV B感染发生率均低 (分别是 15 .73%和 3.33% ) ,两组间无差异。 结论 :CVB感染与小儿多种疾病相关 ,尤其应该重视研究 CVB感染与哮喘、病毒性心肌炎和过敏性紫癜发病的内在联系。

儿童急性暂时性髋关节滑膜炎与柯萨奇B组3型病毒感染的相关性研究

目的 :探讨儿童急性暂时性髋关节炎与柯萨奇B组 3型病毒的相关性。方法 :采用ELISA法检测 10 0例急性暂时性髋关节滑膜炎患儿血清及髋关节液中柯萨奇B组病毒 (CoXB)、腺病毒 (AdV )、巨细胞病毒 (CMV)、呼吸道合胞病毒 (RSV)抗体 ,其中 79例作病毒血清免疫学检测 ,2 1例作髋关节病毒学检测 ,怀疑柯萨奇病毒感染者 ,随机抽样 9例作髋关节液中的病毒分离。结果 :急性暂时性髋关节滑膜炎患儿 79例血清免疫学检测查出Coxb lgM阳性 11例 ,AdV lgM阳性 14例 ,CMV lgM阳性 8例 ,RSV lgM阳性 8例 ,3 8例阴性。 2 1例髋关节液中查出CoXB阳性 7例 ,AdV阳性 5例 ,CMV阳性 2例 ,7例阴性。同时在血液和髋关节液中查出CoXB阳性 1例 ,AdV阳性 2例。随机抽样 9例作病毒分离培养 ,1例分离出柯萨奇病毒 ,采用中和试验证实为柯萨奇B组 3型病毒 ,并经电子显微镜检查确认。结论 :柯萨奇B组 3型病毒具有感染儿童导致急性暂时性髋关节滑膜炎的可能性。

青蒿素抗柯萨奇B组病毒感染的实验观察

目的探讨青蒿素体外抗柯萨奇B组3型病毒(CVB3)的作用。方法以CVB3感染HeLa细胞为实验模型,采用微量细胞病变抑制法、半定量RT鄄PCR实验和间接免疫荧光实验的方法,观察分析青蒿素对CVB3的直接灭活、阻断吸附和抑制复制的作用,以及青蒿素对CVB3在感染细胞内核酸复制和蛋白表达的影响。结果青蒿素不同程度地阻断病毒吸附和抑制病毒复制,明显抑制CVB3核酸复制与蛋白表达,未发现有直接灭活病毒的作用。结论青蒿素类药物具有体外抗CVB3的作用,其抗病毒机制是通过阻断病毒吸附和抑制病毒复制来完成的。

用原位核酸杂交法探讨柯萨奇B组病毒与克山病的关系──（黑龙江省急型克山病）

为探讨柯萨奇Ｂ组病毒感染与黑龙江省急型克山病的关系。本文用缺口平移法制备生物标记的柯萨奇Ｂ３病毒的ｃＤＮＡ探针与１３例急型克山病尸检心肌组织及脑外伤、ＣＯ中毒等意外死亡的正常成人心肌组织１０例，非病区７～８个月引产胎儿心肌组织１０例的石腊切片进行原位杂交。结果１３例急型克山病中有８例出现阳性杂交信号，即有柯萨奇Ｂ组病毒的ＲＮＡ存在，阳性率达６１．５％。对照组均为阴性，提示黑龙江省急型克山病有柯萨奇Ｂ组病毒感染，可能是急型克山病发病因素之一。

用原位核酸杂交法探讨柯萨奇B组病毒与云南慢型克山病的关系

为了探讨柯萨奇 B 组病毒感染与云南慢型克山病的关系,本文用缺口平移法制备生物素标记的柯萨奇 B_3病毒的 cDNA 探针与云南慢型克山病尸检心肌组织15例及脑外伤等非正常死亡的尸检心肌组织10例石腊切片及引产胎儿心肌组织10例的石腊切片进行原位杂交。结果云南慢克16例中有11例出现阳性杂交信号,即有柯萨奇 B 组病毒(CVB)RNA 存在,阳性率达73.3%。脑外伤等非正常死亡的心肌及胎心均为阴性。提示云南慢型克山病与 CVB 的感染高度相关。

用原位核酸杂交法探讨慢型克山病与柯萨奇B组病毒的关系

为探讨山东慢型克山病与柯萨奇 B 组病毒的关系,用缺口平移法制备生物素标记 CoxB_3病毒的 cDNA 探针与慢型克山病14例尸检心肌组织及10例脑外伤,CO 中毒等意外死亡的正常成人心肌组织及10例非病区7～8个月引产胎儿的心肌组织切片进行原位杂交,14例慢克中有9例检测到柯萨奇 B 组病毒的 RNA,阳性率达64%,而对照组均为阴性。提示柯萨奇 B 组病毒感染可能是山东慢型克山病发病因素之一。

柯萨奇B组病毒感染与儿童胰岛素依赖型糖尿病的相关性研究

采用酶联免疫吸附试验 (ELISA)及逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测 35例儿童胰岛素依赖型糖尿病 (Insulindependentdiabetesmellitus ,IDDM)血清中柯萨奇B组病毒 (CoxsackievirusgroupB ,CBV)抗体IgM(CBV IgM) ,外周血中CBV RNA ,并选择 2 2例健康儿童做对照组以探讨CBV感染与儿童IDDM之间的关系。结果显示病例组 35例患儿血中CBV IgM阳性率 37 14% ,外周血CBV RNA阳性率 42 85 % ,对照组 2 2例阳性率分别为 4 5 4% ,9 0 9% ,两组比较差别显著 (P <0 0 5 )。从而提示儿童胰岛素依赖型糖尿病与柯萨奇B组病毒感染相关。

用原位核酸杂交法探讨柯萨奇B组病毒与黑龙江慢型克山病的关系

克山病是原因未明的地方性心肌病,慢型克山病有关病毒病因的研究未见有关报道,作者用生物素标记的柯萨奇 B_3病毒的 cDNA 探针与黑龙江病区慢型克山病尸检心肌组织及非正常死亡成人心肌组织和非病区7～8个月引产胎儿心肌组织进行了原位杂交,以检测柯萨奇 B 组病毒 RNA。结果13例慢型克山病中有9例呈现阳性杂交信号,阳性率达69.2%,两对照组均为阴性。表明黑龙江慢型克山病心肌组织中有柯萨奇 B 组病毒 RNA 的存在,提示黑龙江病区慢型克山病与柯萨奇 B 组病毒的感染呈现高度相关。

柯萨奇病毒B组3型VP1蛋白的原核表达及免疫效果研究

目的:用原核细胞表达柯萨奇病毒B组3型VP1蛋白并观察其免疫效果。方法:构建原核表达质粒pET-his/VP1,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,诱导VP1蛋白的表达并纯化。BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组。实验组腹腔注射VP1蛋白,对照组注射PBS,每3周免疫1次,共免疫3次。每次免疫后2周取血清,用微量中和试验法检测血清CVB3特异性中和抗体滴度;末次免疫后3周,每组随机取3只小鼠,用细胞计数试剂盒检测淋巴细胞增殖活性和特异性CTL杀伤活性;每组另随机抽取3只腹腔注射3LD50CVB3,第7天检测血中病毒滴度;用致死量的CVB3攻击每组剩余12只小鼠,观察免疫保护作用。结果:实验组小鼠血清中和抗体滴度随免疫次数增加而提高(P<0.05),第3次免疫后中和抗体滴度达70.79±1.31,明显高于PBS对照组(P<0.05);非特异性淋巴细胞增殖活性亦明显高于PBS组(P<0.05),但特异性淋巴细胞增殖活性和CTL杀伤活性两组间无统计学差别(P>0.05);CVB3攻击后,实验组小鼠血中病毒滴度显著降低,生存率达33.33%,而PBS组小鼠无存活,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:VP1蛋白可显著增强小鼠的体液免疫应答水平,提高致死量CVB3感染后小鼠的生存率。

柯萨奇B组病毒3型VPI基因疫苗免疫效果的研究

目的为研制防治病毒性心肌炎的基因疫苗打下基础。方法以带有CVB。P1、P2区核酸序列的pGEM质粒为模板，用PCR方法克隆CVB3VP1基因cDNA，插入真核表达载体pcDNA3中的HindⅢ和XbaⅠ位点之间，构建成重组质粒。经大量扩增纯化后，肌肉注射免疫BALB／c小鼠3次，用CVB3毒株攻击小鼠，取血及脾细胞检测其免疫效果。结果小鼠经3次免疫后，虽未测出明显免疫应答指标，但诱导了T、B细胞的免疫记忆反应，免疫组鼠在CVB3毒株攻击后，迅速诱导产生了强烈的二次免疫应答。结论CVB3VP1基因疫苗对CVB3毒株的攻击有一定程度的保护作用。