柯萨奇病毒B组4型河南分离株全基因组序列分析

目的了解河南省手足口病病原柯萨奇病毒B组4型(coxsackievirus B4,CV-B4)全基因组特征,分析不同疾病来源CV-B4病毒分离株VP1区基因异同。方法对采集的手足口病患者临床标本134份进行RT-PCR扩增和病毒分离鉴定;对其中1株分离株通过4对引物分段扩增,拼接CV-B4分离株基因组序列,用生物信息学软件分析,构建序列遗传树。结果测序获得河南省CV-B4分离株HN23/CB4/CHN/2013基因组全长序列7 394 bp,5'非编码区(5'-UTR)、P1、P2、P3、3'非编码区(3'-UTR)区域核苷酸序列与Gen Bank公布的其他分离株相似性分别为80.3%~95.7%、80.8%~93.9%、78.6%~87.7%、78.1%~81.2%和66.7%~87.5%;VP1区核苷酸相似性为81.2%~93.2%,氨基酸相似性为96.1%~99.3%,与糖尿病患者分离株E2核苷酸差异最大,达28.8%,与手足口病分离株差异最小,为6.8%。结论 CV-B4病毒同种疾病分离株VP1区域核苷酸同源性较高,不同疾病分离株差异性较大。

柯萨奇病毒B组4型VP1蛋白原核表达及间接ELISA检测方法的建立

目的 以柯萨奇病毒B组4型(Coxsackievirus B4,CV-B4)VP1基因的原核表达蛋白作为包被抗原,建立并优化间接ELISA方法,用于CV-B4的抗体检测.方法 采用RT-PCR技术扩增CV-B4病毒VP1基因,构建重组表达载体pET-32VP1,并转化至表达菌株大肠埃希菌Rosetta(DE3),进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和蛋白质谱鉴定目的蛋白成功表达.以纯化的重组蛋白为包被抗原,进行间接ELISA方法反应体系的建立和条件优化.结果 CV-B4的VP1基因可在大肠埃希菌中以包涵体形式稳定表达,确定抗体间接ELISA检测方法的抗原最佳包被浓度为7.5μg/孔,血清最佳稀释浓度为1:100,临界值为OD450值≥0.376,重组蛋白可与CV-B4阳性血清特异识别,与CV-B3阳性血清存在一定交叉反应,但与柯萨奇A组病毒以及CV-B1和CV-B5均无反应,表明蛋白具有良好的免疫原性.结论 大肠埃希菌表达的VP1重组蛋白为抗原建立的间接ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性,可用于CV-B4血清抗体的检测.

柯萨奇病毒B4型VP1蛋白的生物信息学分析

目的:分析柯萨奇病毒B4型(coxsackievirus B4,CVB4)的结构蛋白VP1的分子结构,预测其生物学信息。方法:应用Bioedit、DNAstar、ABCpred软件,以及免疫表位数据库网站IEDB和生物信息学门户ExPASy提供的多种在线工具,对CVB4 VP1蛋白的氨基酸序列进行分析。结果:CVB4 VP1蛋白的等电点8.31,相对分子量32.1 kD,为亲水性、不稳定蛋白质;有36个可能的磷酸化位点,无信号肽和跨膜螺旋结构,二级结构以无规则卷曲为主;预测有5条优势线性B细胞表位。结论:通过对CVB4 VP1蛋白的生物信息学分析,得到了VP1蛋白的理化性质,相关结构的功能特征及线性B细胞表位等生物信息资料。