柯萨奇病毒B组1型感染动物模型研究进展

柯萨奇病毒B组1型(coxsakievirus B1,CVB1)能引起人类心肌炎、无菌性脑膜炎、新生儿全身感染等多种疾病,幼儿感染后病情较重甚至引发死亡,而目前尚无针对该病毒的疫苗及特效治疗药物。因此,建立并开展相关动物模型研究对CVB1感染后的机体免疫反应、病毒毒力机制、药物疫苗研发等问题的解决具有重要意义,同时也能为临床治疗提供部分依据。本文通过对CVB1病毒感染构建的不同动物模型进行总结,以期望为建立合适的动物模型以及开展相关研究提供参考。

柯萨奇病毒B组1型感染叙利亚金黄地鼠动物模型建立

目的建立叙利亚金黄地鼠CVB1(Coxsackievirus B1,CVB1)感染动物模型。方法取叙利亚金黄地鼠经鼻腔滴注方式呼吸道感染CVB1,感染剂量每只为10^(7.25)CCID_(50)。观察14 d体重、体温、精神状态、皮肤黏膜变化、行为、粪便状态、是否有神经症状等临床情况;每天采集咽拭子、鼻灌洗液以及粪便进行病毒载量检测,感染第7天取3只实施安乐死,采血进行病毒载量及生化检测;同时采集脑、心脏、肝等多个组织样品进行病毒载量、组织病理学和IHC检测。结果感染CVB1病毒的动物在14 d内均出现不同程度精神萎靡、体温下降,以及口唇部出现典型的红疹及疱疹等类似人类手足口病临床表现。咽拭子、鼻灌洗液、粪便以及血液中能检测到病毒;组织中检测到病毒载量并观察到病毒抗原,同时伴有炎症、增生、出血等病理改变;血清酶中肝功、心肌酶升高。结论CVB1病毒经滴鼻方式感染叙利亚金黄地鼠建立的感染模型,表现出心肌和肝等组织器官的病理损伤特征,可用于人类手足口病的研究。

山东省柯萨奇病毒B1型VP1区全基因序列分析

为了解柯萨奇病毒B1型（Coxsackievirus B1,CV-B1）山东地方株的分子流行病学特征,本研究对1994年至2015年山东省急性弛缓性麻痹（Acute flaccid paralysis,AFP）监测系统、环境污水监测和无菌性脑膜炎病例标本中分离到的CV-B1病毒进行了VP1序列测定、系统发生学分析和同源性分析。共分离到CV-B1病毒53株,其中AFP监测、污水和及脑炎标本各分离到41株、4株和8株。基于VP1完整编码区序列的系统发生学分析显示CVB1山东株与国内其他分离株属于一个大的分支,该分支内无国外分离株,国外分离株构成了其他两个分支。山东株之间的VP1核苷酸同源性为84.4%-100.0%,与其他国家分离株的同源性为77.9%-85.0%。研究结果表明,中国CV-B1分离株与国外株相比有较大的遗传差异,需要加强相关手足口病病毒学监测,关注不同传播链的新的基因亚型的肠道病毒的输入。

应用KMB17细胞培养柯萨奇病毒B族1、2、3型的研究

目的 采用人胚肺二倍体细胞(human embryonic lung diploid cell)KMB17株对柯萨奇病毒B族(Coxsackievirus B,CVB)1、2、3型进行适应性培养,探索应用KMB17细胞培养CVB1-3型病毒的相关参数,为基于KMB17细胞研发CVB多价疫苗提供参考。方法 将CVB 1-3型分别设置8个不同的感染复数(mulitiplicity of infection, MOI)梯度(0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4),在KMB17细胞上进行培养观察,对病毒培养结果进行统计分析。结果 CVB 1-3型病毒均能KMB17细胞中复制,并使细胞产生明显的细胞病变(cytopathic effect, CPE)。其中CVB 1型在KMB17细胞上适宜的种毒MOI值为0.25~0.3,病毒收获液的平均滴度为7.25 lgCCID50/mL,适宜MOI范围内病毒培养时间的95%置信区间为96.1~97.6 h;CVB 2型在KMB17细胞上适宜的种毒MOI值为0.20~0.25,病毒收获液平均滴度为7.375 lgCCID50/mL,适宜MOI范围内病毒培养时间的95%置信区间为74.8~76.8 h。CVB 3型在KMB17细胞上适宜的种毒MOI值为0.30~0.35,病毒收获液的平均滴度为7.25 lgCCID50/mL,适宜MOI范围内病毒培养时间的95%置信区间为82.7~84.7 h。结论 KMB17为一株理想的用于CVB1、2、3型培养的基质细胞,可为基于KMB17细胞研发CVB多价疫苗提供参考。

柯萨奇B1型病毒的鉴定及VP1区基因特征分析

目的分离引起手足口病的肠道病毒,分析其基因序列特征,为手足口病的防控提供科学依据。方法从手足口病病例标本中分离病毒,提取病毒核酸并特异性扩增VPl区基因片段,进行序列测定、系统发生树构建和核苷酸同源性分析。结果从2009年河南省报告的1例手足口病病例标本中分离出1株柯萨奇B1型肠道病毒,基因序列显示其与浙江省2009年分离株同源性最高,核酸同源性达到98.4%,氨基酸同源性达100%。结论河南省手足口病病原谱中存在柯萨奇B1型病毒,并与浙江分离株属同一分支。

柯萨奇B组1型病毒株MSH-KM9-09的分离鉴定及其VP1基因序列特征分析

目的对2009年昆明市无菌性脑膜炎的病原柯萨奇B组1型病毒(Coxsackievirus B1,CVB1)分离株MSH-KM9-09进行鉴定,并分析其VP1基因的序列特征。方法采用RD细胞和Hep-2细胞对22份疑似无菌性脑膜炎患者脑脊液标本进行病毒分离,采用微量中和试验,经WHO肠道病毒组合血清及单价血清对分离株进行鉴定,RT-PCR法扩增病毒全长VP1基因,进行序列测定,并采用Mega 4.1等软件进行分析。结果所分离的毒株经微量中和试验定型为CVB1亚型,编号为MSH-KM9-09。经RT-PCR扩增获得834 bp的VP1基因,与国内CVB1分离株核苷酸和氨基酸序列的同源性分别在86.1%和97.8%以上,与国外CVB1分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为80.2%～83.2%和94.3%～96.0%;在系统进化树上,MSH-KM9-09株与国内分离株属于同一个分支,而国外分离株分属其他两个不同的分支。结论 MSH-KM9-09分离株为肠道病毒CVB1。

浙江省2009年无菌性脑膜炎病原柯萨奇病毒B组1型的VP_1区基因特征分析

目的分析浙江省2009年无菌性脑膜炎病原柯萨奇B组1型病毒(Coxsackie Virus Group B Type1,CVB1)VP1区基因特征。方法对疑似患者的脑脊液(Cerebrospinal Fluid,CSF)和粪便标本,采用人横纹肌肉瘤细胞和人喉癌上皮细胞进行病毒分离与中和试验(Neutralization Test,NT),对VP1区基因作逆转录-聚合酶链反应扩增及序列分析,并与国内外相关毒株进行同源性与系统进化比较。结果从疑似患者CSF和粪便标本中分离到阳性分离物,经血清NT鉴定为CVB1。3株CVB1分离株的VP1区均为834个核苷酸,编码278个氨基酸,与浙江省2008年及山东省2006年的CVB1分离株高度同源,而与标准株(M16560-CONN5)、澳大利亚株、法国株及我国2005年之前的山东省分离株存在明显差异。基因进化树显示,浙江省2009年CVB1分离株[ZJ(Zhejiang,浙江)-19-09、ZJ-36-09和ZJ-27-09]位于独立的进化分枝。结论引起浙江省2009年无菌性脑膜炎小范围流行的病原为CVB1,其VP1区与近年中国大陆的CVB1高度同源,存在着在中国大陆内CVB1循环的可能性。

柯萨奇病毒B组1型TaqMan一步法荧光定量 RT-PCR检测方法的建立

目的 建立柯萨奇病毒B组1型(coxsackievirus B1,CV-B1)特异的TaqMan一步法荧光定量RT-PCR检测方法。方法 根据CV-B1的VP1序列,设计特异性引物和TaqMan探针。将目的基因插入pMD19;载体,在DH5α感受态细胞中扩增,体外转录后获得RNA标准品,建立标准曲线。并对检测方法的灵敏度、特异性、重复性进行评价。结果 该方法在10^(2)-10^(11)拷贝/μl的模板范围内具有良好的线性关系(R^(2)=1.000),扩增效率E=107.5%。灵敏度达1×10^(2)拷贝/μl,只对CV-B1有特异性扩增曲线,且重复性较好。结论 建立的实时荧光定量RT-PCR方法具有较高的灵敏度、特异性和重复性,可作为CV-B1的快速检测和绝对定量分析。

柯萨奇B组1型云南分离株MSH／KM9／2009全基因组序列分析

对2009年分离自云南省昆明市脑膜脑炎儿童的1株柯萨奇B组1型病毒MSH-KM9-09,进行了全基因组的序列测定,并对其分子变异和进化特点进行了分析。采用逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerasechain reaction,RT-PCR),分段扩增覆盖病毒全长序列的8个重叠片段(未包括多聚腺苷酸尾),并进行序列测定和分析。CVB1MSH-KM9-09病毒株基因组全长7 384个核苷酸(nt),5'端和为3'端分别为741nt和94nt的非编码区,5'和3'非编码区间为一个6 549nt长的开放阅读框,编码一个含2 183个氨基酸的多聚蛋白,编码区内未见核苷酸的插入或缺失。与GenBank库中现有CVB1全基因组序列M16560、pmMC、Tucson B1和CVB1/Nm相比对,整个基因组的核苷酸同源性分别为80.9%、81.6%、80.5%和80%,氨基酸同源性分别为95.6%、95.8%、96.2%和95.6%。首次完成中国CVB1病毒全基因组核苷酸序列的测定,经核苷酸序列同源性比对和进化树分析,证实MSH/KM9/2009株属于CVB1基因型。