柯萨奇病毒B4型VP1蛋白的生物信息学分析

目的:分析柯萨奇病毒B4型(coxsackievirus B4,CVB4)的结构蛋白VP1的分子结构,预测其生物学信息。方法:应用Bioedit、DNAstar、ABCpred软件,以及免疫表位数据库网站IEDB和生物信息学门户ExPASy提供的多种在线工具,对CVB4 VP1蛋白的氨基酸序列进行分析。结果:CVB4 VP1蛋白的等电点8.31,相对分子量32.1 kD,为亲水性、不稳定蛋白质;有36个可能的磷酸化位点,无信号肽和跨膜螺旋结构,二级结构以无规则卷曲为主;预测有5条优势线性B细胞表位。结论:通过对CVB4 VP1蛋白的生物信息学分析,得到了VP1蛋白的理化性质,相关结构的功能特征及线性B细胞表位等生物信息资料。

柯萨奇病毒B4型江苏地方株的病毒分离与基因进化分析

目的建立柯萨奇病毒B4型病毒的分离方法,并对已分离到的江苏地方株进行基因进化分析。方法使用荧光定量PCR方法检测江苏省哨点医院收治的呼吸道感染患者咽拭子样本中肠道病毒感染情况,使用HeLa细胞对阳性样本进行病毒分离,然后进行VP4基因测序与进化树分析。结果荧光定量PCR检测肠道病毒阳性12例,1份样本经病毒分离后呈现细胞病变效应,RT-PCR扩增出特异性的VP4基因,测序显示该病毒株与其他20株CVB4病毒株的VP4核苷酸同源性都在86.56%~93.59%之间,确诊为CVB4江苏地方株。进化树分析显示,该病毒株只与CVB4病毒KY369904株形成一个聚簇。结论本研究采用HeLa细胞分离与鉴定到了1株肠道病毒,VP4基因进化分析判断为CVB4江苏地方株,对预防与控制当地的肠道病毒感染具有重要价值。

柯萨奇病毒B组4型河南分离株全基因组序列分析

目的了解河南省手足口病病原柯萨奇病毒B组4型(coxsackievirus B4,CV-B4)全基因组特征,分析不同疾病来源CV-B4病毒分离株VP1区基因异同。方法对采集的手足口病患者临床标本134份进行RT-PCR扩增和病毒分离鉴定;对其中1株分离株通过4对引物分段扩增,拼接CV-B4分离株基因组序列,用生物信息学软件分析,构建序列遗传树。结果测序获得河南省CV-B4分离株HN23/CB4/CHN/2013基因组全长序列7 394 bp,5'非编码区(5'-UTR)、P1、P2、P3、3'非编码区(3'-UTR)区域核苷酸序列与Gen Bank公布的其他分离株相似性分别为80.3%~95.7%、80.8%~93.9%、78.6%~87.7%、78.1%~81.2%和66.7%~87.5%;VP1区核苷酸相似性为81.2%~93.2%,氨基酸相似性为96.1%~99.3%,与糖尿病患者分离株E2核苷酸差异最大,达28.8%,与手足口病分离株差异最小,为6.8%。结论 CV-B4病毒同种疾病分离株VP1区域核苷酸同源性较高,不同疾病分离株差异性较大。

2013～2014年山东省4株柯萨奇B4型分离株遗传分析

尽管柯萨奇病毒B4（Coxsackievirus B4,CVB4）分离率不高,但是在我国引起儿童脑炎的病例屡屡报道。目前人们对CVB4基因组的遗传变异了解并不多,GenBank公共数据库仅仅存储有20几个CVB4全基因组序列,分离自我国的CVB4基因组序列不足10条。本研究对2013~2014年山东省分离的4株CVB4阳性样本进行高通量测序,测得其全基因组序列,利用Mega 5.1对CVB4型毒株全基因组及VP1片段进行系统发生及同源性分析,用RDP3和SimPlot 3.5.1软件进行基因重组分析。结果显示这4株病毒为柯萨奇病毒B4（Coxsackievirus B4,CVB4）型,全基因组序列长度分别为7 372bp、7 389bp、7 389bp和7 391bp,核苷酸同源性为97.1%~99.9%,氨基酸同源性为98.5%~99.9%。与2013年温州CVB4分离株CVB4/P11/2013/China（GenBank登录号：KP289433）分离株同源性最高,核苷酸及氨基酸同源性分别为97.1%~98.3%和98.6%~99.4%。对VP1基因进行系统发育树分析表明,VP1基因可划分成5个基因型,基因型内部序列距离小于15%,而基因型间距离均大于15%。另外,4株CVB4分离株VP1的进化关系较近,同近年来国内其他分离株单成一簇,属于基因型V分支。经RDP3和SimPlot 3.5.1软件分析发现,这四个CVB4分离株均发生了基因重组,分离株SDJN/CHN/2013可能发生了两次基因重组。综上,这4个CVB4分离株基因组高度相似,均位于基因型V分支,且基因组发生了基因重组。

柯萨奇病毒B组4型VP1蛋白原核表达及间接ELISA检测方法的建立

目的 以柯萨奇病毒B组4型(Coxsackievirus B4,CV-B4)VP1基因的原核表达蛋白作为包被抗原,建立并优化间接ELISA方法,用于CV-B4的抗体检测.方法 采用RT-PCR技术扩增CV-B4病毒VP1基因,构建重组表达载体pET-32VP1,并转化至表达菌株大肠埃希菌Rosetta(DE3),进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和蛋白质谱鉴定目的蛋白成功表达.以纯化的重组蛋白为包被抗原,进行间接ELISA方法反应体系的建立和条件优化.结果 CV-B4的VP1基因可在大肠埃希菌中以包涵体形式稳定表达,确定抗体间接ELISA检测方法的抗原最佳包被浓度为7.5μg/孔,血清最佳稀释浓度为1:100,临界值为OD450值≥0.376,重组蛋白可与CV-B4阳性血清特异识别,与CV-B3阳性血清存在一定交叉反应,但与柯萨奇A组病毒以及CV-B1和CV-B5均无反应,表明蛋白具有良好的免疫原性.结论 大肠埃希菌表达的VP1重组蛋白为抗原建立的间接ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性,可用于CV-B4血清抗体的检测.