一株柯萨奇病毒A组4型云南株的全基因组分析

目的了解中国云南2022年分离到的一株柯萨奇病毒A组4型(Coxsackievirus A4,CVA4)病毒株的全基因组序列特征,探讨CVA4系统发育特征。方法对CVA4分离株194R3/YN/CHN/2022进行全基因组序列扩增测序,并应用Mega 7.0、Geneious 9.1.4及Simplot 3.5.1等软件拼接比对,构建CVA4分离株系统进化树,分析其全基因组序列特征。结果194R3/YN/CHN/2022分离株为CVA4,属于C2基因亚型,与我国近年的优势基因亚型一致。重组分析显示,在P2、P3非结构编码区,CVA4病毒分离株可能与EVA114原型株V13-0285、CVA16原型株G-10、CVA14原型株G-14发生过重组。结论云南分离的194R3/YN/CHN/2022属于CVA4中国流行的C2基因亚型,但发生了一定变异。

深圳地区2014年柯萨奇病毒A组4型VP1区基因特征分析

目的对2014年深圳市罗湖区一起疱疹性咽峡炎疫情的病原体进行鉴定,并对鉴定的柯萨奇A4病毒（CVA4）的VP1基因进行序列测定和遗传进化特征分析。方法采集疫情中患儿的咽拭子样本8份,提取病毒核酸,利用荧光RTPCR法检测样本总肠道病毒（EV）、人肠道病毒71型（EV71）、柯萨奇病毒A组16型（CVAl6）、CVA4、CVA6和CVAl0等,对CVA4阳性样本采用RT-PCR方法扩增其VP1区全长序列,并进行核苷酸序列测定和遗传进化分析。结果引起此次疱疹性咽峡炎暴发的病原体为GIB亚型的CVA4病毒。同源性分析显示,深圳2014年CVA4病毒株与云南2004年分离株（AB268278）、以及台湾2008年分离株（AB571570）核苷酸同源性达94.1%~94.8%,而与CVA4原型株HIGHPOINT同源性最低,为84.3%。在氨基酸序列上与台湾2006年分离株（AB571563）、吉林2006年分离株（JQ715709）同源性最高,达99.3%;而与山东省2006年分离株（GQ253375）同源性最低,为97.1%。相比深圳2009年分离株（HQ728260）,共有6个氨基酸突变位点：N22S,T34A,N63S,A165D,T200A和V126A;而进化树分析显示,深圳2014年CVA4病毒株虽属于CVA4的GIB亚型,但在进化走势上,已经不同于GIB亚型中其他地区早期的分离株。结论 2014年深圳地区CVA4病毒属于GIB亚型,但在VP1区变异较大。

柯萨奇B_4病毒感染对小鼠胰岛的影响及黄芪对其保护作用

采用我国流行的CB4V亲胰腺株（P－CB4V）感染Swiss小鼠，建立Ⅰ型糖尿病的动物模型，并观察黄芪对CB4V感染引起-Ⅰ型糖尿病的保护作用。结果表明，80％的小鼠在感染后72h出现低血糖，血糖在（90．87±8．26）mg/L范围之内，6～8周全部发展为高血糖，糖刺激的胰岛素释放量在感染后72h增加，但至3～8周明显低于未感染组。在用VB4V感染小鼠的同时给予黄芪，目的在于观察黄芪对CB4V攻击胰岛β细胞的保护作用，结果经黄芪治疗后的感染小鼠，1周80％小鼠血糖在（112.66±5．0）mg／L，范围之内，60％小鼠低糖及高糖刺激的胰岛素释放量与正常对照组无差异，到3～6周全部小鼠血糖在（113．68±6．30）mg/L，范围之内，而低糖与高糖刺激的胰岛素释放量分别在（20．22±285）uIU/ml,（3640±3.05）uIU／ml范围之内，均与正常对照组无差异（P＜0.05）。

柯萨奇病毒B4’致低硒鼠心肌损伤的实验研究

目的 探讨柯萨奇病毒B4’致低硒鼠心肌损伤的特点。方法 用补硒和低硒饲料分别喂养昆明鼠4周后交配,给其子代雄性鼠（出生后 4周）腹腔接种柯萨奇病毒B4’0.1ml,对照组接种等量RPMI 1640培养液。观察各组鼠的心肌光镜结果,全血中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性和肝脏组织中脂质过氧化物酶（LPO）含量。结果 低硒和补硒饲料病毒组的心肌病变检出率分别为78.1％和16.7％。低硒和补硒饲料对照组的心肌未见病变。低硒组全血中GSH-Px活性明显降低,LPO含量明显增高。结论 低硒可以使柯萨奇病毒B4’致昆明鼠心肌损伤加重。

雷帕霉素对柯萨奇病毒B3诱导的大鼠心肌细胞mTOR和eIF-4E表达的调控作用

目的:研究雷帕霉素对柯萨奇病毒B3(coxsackievirus B3,CVB3)诱导的心肌细胞哺乳类雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)和真核起始因子4E(eukaryotic initiation factor-4E,eIF-4E)表达的调控,探讨mTOR/eIF-4E信号传导在病毒性心肌炎(viral myocarditis,VM)的作用。方法:CVB3感染原代培养的SD大鼠心肌细胞建立病毒性心肌炎的细胞模型。根据细胞毒力实验筛选10 nmol/L的雷帕霉素干预CVB3感染的心肌细胞,采用RT-PCR和Western免疫印迹方法检测mTOR和eIF-4E mRNA表达及蛋白质水平。结果:CVB3诱导心肌细胞变性,雷帕霉素可减轻其变性;CVB3使大鼠心肌细胞的mTOR和eIF-4E mRNA和蛋白表达上调,与对照组比较,有统计学差异(P<0.05),雷帕霉素可使CVB3感染的心肌细胞mTOR和eIF-4E mRNA和蛋白表达明显下调,与CVB3组比较,有统计学差异(P<0.05)。结论:雷帕霉素能明显抑制CVB3感染的大鼠心肌细胞mTOR和eIF-4E表达,提示mTOR/eIF-4E信号传导在病毒性心肌炎中可能起重要作用。

连花清瘟胶囊抗柯萨奇B_4病毒作用的实验研究

采用中药连花清瘟胶囊进行了体外抗柯萨奇病毒B4(CVB4)的研究.通过观察病毒引起的细胞病变效应(CPE)、MTT法检测细胞活性,作为考核药物抗病毒作用.结果表明:中药连花清瘟胶囊对CVB4有直接灭活作用,并能阻止CVB4的吸附细胞和抑制CVB4在Hep-2细胞内的的生物合成,其半数抑制浓度(IC50)分别为410.00,343.13和410.32μg/mL,治疗指数(TI)分别为2.67,3.20和2.66.其中抗病毒吸附作用最强(P<0.01).在100～1600μg/mL范围内连花清瘟胶囊与CVB4抑制率呈明显的量效关系(P<0.05),在500μg/mL时能抑制CVB4在Hep-2细胞内的增殖大于50%.研究表明中药连花清瘟胶囊能有效地抑制CVB4在Hep-2细胞中的增殖,其抗病毒作用表现为直接灭活病毒,阻断病毒吸附细胞和抑制病毒进入细胞之后的复制增殖.

柯萨奇B_4病毒感染与克山病及其病区病毒性心肌炎

目的 探讨柯萨奇 B4病毒与克山病及其病区病毒性心肌炎的关系。方法 采用寡核苷酸探针的原位核酸杂交方法 ,结合病理学观察 ,对比研究克山病与病毒性心肌炎的异同。结果 克山病与病毒性心肌炎各自具有特征性的病理学改变 ;发病区 88.89%的病毒性心肌炎出现阳性杂交信号 ,而且几乎每例的所有心肌细胞均见阳性杂交信号 ;95 .2 4%的亚急型克山病出现阳性杂交信号 ,且半数以上的标本几乎所有的心肌细胞内出现阳性杂交信号 ;阳性信号在病毒性心肌炎和亚急型克山病的心肌细胞内的分布及阳性信号颗粒的形态并无明显区别。结论 柯萨奇 B4病毒与克山病及其病区病毒性心肌炎密切相关 。

大黄素体外抗柯萨奇病毒B_4的实验研究

为研究大黄素的体外抗柯萨奇病毒B4（CVB4）作用,以病毒唑为阳性对照药,用MTT法从药物抑制病毒增殖、直接杀灭和抗吸附3种方式评价了大黄素抗CVB4效果,并用实时定量PCR检测了大黄素对CVB4基因mRNA表达的影响,用空斑法测定了大黄素对病毒感染细胞不同时间空斑形成率的影响.结果表明：大黄素不能直接杀灭病毒或阻断病毒吸附细胞,但能显著抑制病毒在细胞内的生物合成,其IC50=（14.10±0.74）μM,TI=（4.35±0.60）,能显著降低细胞内CVB4基因mRNA表达（p〈0.05）,其抑制作用发生在病毒进入细胞0-4 h.故大黄素主要通过抑制CVB4穿入细胞后复制环节发挥抗病毒作用,并具有时间依赖性和剂量依赖性.

柯萨奇病毒A16型VP1-VP4基因克隆及其表达产物的抗原相关性分析

目的克隆并表达柯萨奇病毒A16型VP1-VP4蛋白基因,初步分析其抗原相关性。方法抽提病毒RNA,经RT-PCR方法分别扩增出VP1-VP4蛋白基因片段,经克隆后,在QIA表达系统中表达,表达产物经8 mol/L尿素洗涤及镍柱亲和层析纯化后,用柯萨奇病毒A16型病毒免疫兔血清及肠道病毒71型病毒免疫兔血清对重组蛋白进行Western blotting及ELISA分析其抗原相关性及交叉反应性。结果成功构建的重组质粒pQE30a/VP1-VP4并经IPTG诱导,重组蛋白VP1-VP4高效表达并纯化成功,经Western blotting及ELISA证实重组蛋白VP1-VP4可以被CVA16免疫兔血清特异识别,部分与肠道病毒71型免疫血清存在交叉反应。结论在大肠杆菌M15中高效表达出柯萨奇病毒A16型VP1-VP4蛋白,经纯化产物具有较强的抗原反应性。

中药复方板蓝根颗粒抗柯萨奇B_4病毒作用的实验研究

采用中药复方板蓝根颗粒进行了体外抗柯萨奇病毒B4(CVB4)的研究,通过观察病毒引起的细胞病变效应(CPE)、MTT法检测细胞活性,作为考核药物抗病毒作用.结果表明:中药复方板蓝根颗粒对CVB4无直接灭活作用,但能抑制CVB4在Hep-2细胞内的的生物合成和阻止CVB4的吸附,其半数抑制浓度(IC50)分别为1129.00和1130.44μg/mL,治疗指数(TI)均为2.78.在100～1600μg/mL范围内复方板蓝根颗粒与CVB4抑制率呈明显的量效关系(P<0.01),在1600μg/mL时能抑制CVB4在Hep-2细胞内的增殖>50%.研究表明中药复方板蓝根颗粒能有效地抑制CVB4在Hep-2细胞中的增殖,其抗病毒作用发生在阻断病毒吸附细胞和抑制病毒进入细胞之后的复制增殖.

柯萨奇B_4和B_(3M)病毒重叠感染对低硒昆明鼠T细胞亚群的影响

目的：观察低硒，补硒鼠先后感染ＣＶＢ４，ＣＶＢ３Ｍ两种病毒七天后，小鼠脾脏Ｔ细胞亚群的变化。方法：小鼠先后感染ＣＶＢ４，ＣＶＢ３Ｍ两种病毒七天后，检测脾脏Ｔ细胞亚群细胞数，血清中和抗体及心肌组织病毒滴度。结果：在低硒感染组ＣＤ４，ＣＤ８，ＣＤ３均显著下降，而补硒感染组ＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ８Ｔ淋巴细胞亚群都明显升高，心肌组织病毒，病变程序及检出率低硒病毒组显著重于补硒组。血清中和抗体效价低硒组显著低于补硒组。结论：硒缺乏可以导致机体免疫功能的低下，而ＣＶＢ４，ＣＶＢ３Ｍ病毒的二重感染导致低硒鼠的免疫功能进一步低下。

雷帕霉素对柯萨奇病毒B3诱导的心肌成纤维细胞eIF-4E表达的影响

目的探讨雷帕霉素对柯萨奇病毒B3诱导的心肌成纤维细胞eIF-4E表达的影响,寻找病毒性心肌炎的药物治疗靶点。方法选用MOI为0.5 PFU/cell的柯萨奇病毒B3感染心肌成纤维细胞,利用细胞形态及RT-PCR法检测细胞内柯萨奇病毒B3 mRNA表达,确定柯萨奇病毒B3成功感染心肌成纤维细胞。以10nM雷帕霉素干预,采用RT-PCR及Western blot检测对照组、病毒组(MOI为0.5 PFU/cell)、雷帕霉素组及病毒+雷帕霉素组eIF-4E表达。结果MOI为0.5 PFU/cell的柯萨奇病毒B3感染心肌成纤维细胞,透射电镜下可见细胞形态改变,胞浆内可见病毒颗粒。RT-PCR结果显示:感染后第1天、第2天、第3天及传代后第2天细胞有病毒mRNA表达。RT-PCR检测上述4组的eIF-4E/β-actin光密度比值分别为:0.73±0.07,0.87±0.03,0.32±0.03,0.56±0.04;Western blot灰度值分别为:0.79±0.09,1.35±0.12,0.55±0.04,0.62±0.07;RT-PCR及Western blot结果显示:病毒组eIF-4E表达高于对照组,雷帕霉素组和病毒+雷帕霉素组低于对照组及病毒组(均P<0.05)。结论柯萨奇病毒B3可感染心肌成纤维细胞,并使eIF-4E表达增加,雷帕霉素可抑制其表达,提示心肌成纤维细胞可能通过mTOR/eIF-4E信号通路参与病毒性心肌炎的发病机制,雷帕霉素对病毒性心肌炎有潜在的治疗作用。

柯萨奇B4病毒非结构蛋白P_2C重组质粒的构建

目的:构建柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C重组质粒。方法:用RT-PCR技术,从柯萨奇B4病毒中钓取非结构蛋白P2CcDNA片段,克隆入PUCm-T载体,转化大肠杆菌DH5α,构建重组质粒。结果:以柯萨奇B4病毒的总RNA为模板,扩增出987bp大小的片段,克隆入PUCm-T载体,用BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定,与非结构蛋白P2C的PCR扩增产物片段大小一致。结论:成功地构建了柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C重组质粒。

登革2型病毒非结构蛋白NS4B的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

目的:原核表达、纯化登革2型病毒非结构蛋白NS4B,并制备其多克隆抗体,以研究其结构与功能。方法:扩增编码登革2型病毒NS4B的24～238位氨基酸残基的基因序列,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;采用蛋白浸提方法从SDS-PAGE胶中回收融合蛋白;用纯化后的融合蛋白免疫BALB/c鼠制备多克隆抗体,采用间接免疫荧光法检测抗体效价。结果:原核表达了NS4B-GST融合蛋白,并获得了其多克隆抗体,抗体效价为1∶800。结论:登革2型病毒NS4B的24～238位氨基酸残基可诱导小鼠产生具有较高效价和特异性的多克隆抗体,这为研究NS4B的结构与功能奠定了基础。

柯萨奇病毒B_4’致低硒鼠心肌损伤及细胞凋亡机制的研究

目的为了探讨柯萨奇病毒B4’致低硒鼠心肌损伤及细胞凋亡的机理。方法用低硒和补硒饲料分别喂养昆明鼠,4周后交配,给其子代4周雄性鼠腹腔接种10-7TCID50柯萨奇病毒B4’0.1ml,对照组接种等量RPMI1640培养液。7天后处死,取心脏制片,光镜观察病变,并采用TUNEL法和免疫组化法技术检测凋亡细胞及其相关基因。结果低硒和补硒饲料病毒组的心肌病变检出率分别为78.1%和16.7%。低硒和补硒饲料对照组的心肌未见病变。低硒和补硒病毒组及低硒对照组的心肌均发生不同程度的细胞凋亡。补硒对照组未见心肌细胞凋亡。结论柯萨奇病毒B4’感染低硒昆明鼠引起的心肌损伤有细胞凋亡机制参与。

柯萨奇病毒B4双siRNA表达载体的构建及表达

目的:构建以柯萨奇病毒B4的1A和2A基因为靶基因并带有绿色荧光蛋白标志的可表达发夹结构的双链siRNA的表达载体pU6/double-siRNA/Neo/GFP/1A/2A。方法:选择柯萨奇病毒B4的1A和2A区基因21 bp为靶序列分别合成65 bp的互补片段并克隆到pSilencer2.1U6 Neo和pGCsi-U6/Neo/GFP质粒中,经限制性内切酶消化、琼脂糖凝胶电泳分离、回收DNA片段,及连接酶连接构建双siRNA表达质粒pU6/double-siRNA/Neo/GFP/1A/2A;将构建的载体转染Hela细胞后,荧光显微镜观察荧光的表达。结果:限制性内切酶消化、琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒pU6/double-siRNA/Neo/GFP/1A/2A,有正确的特异性片段,DNA测序也证明其具有正确序列;将该重组质粒转染入Hela细胞后,重组质粒构建成功并在真核细胞内表达GFP,表达时间可达15 d以上。结论:针对柯萨奇病毒B4的1A和2A基因的双siRNA表达载体pU6/double-siRNA/Neo/GFP/1A/2A构建成功,并可在真核细胞内持续表达15 d以上。

柯萨奇B_4病毒体内外感染所致小鼠胰岛B细胞的损伤

目的 :研究我国流行的柯萨奇B4 病毒亲胰腺株 (pancreatotropicstrainofCoxsackievirusB4 ,P -CB4 V)感染与胰岛素依赖型糖尿病 (insulin -dependentdiabetesmellitus,IDDM )之间的关系。 方法 :P -CB4 V经体内外感染Swiss小鼠后 ,测定血糖及糖刺激的胰岛素释放量。结果 :80 %的小鼠在感染后 72h出现低血糖 ,血糖在(90 87± 8 2 6 )mg/L范围之内 ,6～ 8wk全部发展为高血糖。糖刺激的胰岛素释放量在感染后 72h增加 ,但至 3～ 8wk明显低于未感染组。同时 ,用P -CB4 V对体外培养的小鼠胰岛及胰岛细胞进行攻击 ,经低糖及高糖刺激的胰岛素释放量均明显低于对照组。结论 :P -CB4 V经体内或体外感染 ,均可损伤小鼠B细胞。

柯萨奇病毒B4型VP1蛋白的生物信息学分析

目的:分析柯萨奇病毒B4型(coxsackievirus B4,CVB4)的结构蛋白VP1的分子结构,预测其生物学信息。方法:应用Bioedit、DNAstar、ABCpred软件,以及免疫表位数据库网站IEDB和生物信息学门户ExPASy提供的多种在线工具,对CVB4 VP1蛋白的氨基酸序列进行分析。结果:CVB4 VP1蛋白的等电点8.31,相对分子量32.1 kD,为亲水性、不稳定蛋白质;有36个可能的磷酸化位点,无信号肽和跨膜螺旋结构,二级结构以无规则卷曲为主;预测有5条优势线性B细胞表位。结论:通过对CVB4 VP1蛋白的生物信息学分析,得到了VP1蛋白的理化性质,相关结构的功能特征及线性B细胞表位等生物信息资料。

柯萨奇B_4病毒对小鼠胰岛的影响及干扰素的保护作用

采用我国流行的柯萨奇B4病毒 (CB4V)感染swiss小鼠 ,建立I型糖尿病的动物模型 ,并观察干扰素对CB4V引起的I型糖尿病的保护作用。结果表明 ,80 %的小鼠在感染后 72h出现低血糖 ,血糖在 (90 .87±8.2 6 )mg/L范围之内 ,6～ 8周全部发展为高血糖。糖刺激的胰岛素释放量在感染后 72h增加 ,但至 3～ 8周明显低于正常对照组。在用CB4V感染小鼠的同时给予干扰素 ,目的在于观察干扰素对CB4V攻击胰岛 β细胞的保护作用 ,结果经干扰素治疗后的感染小鼠 ,当给干扰素到 6周 ,80 %小鼠血糖在 (118.6 6± 5 .73)mg/L范围之内 ,而低糖与高糖刺激下的胰岛素释放量分别在 (18.34± 3.5 0 )uIU/mL ,(31.5 1± 4 .71)uIU/mL范围之内 ,均与正常对照组无差异 (p >0 .0 5 )。

柯萨奇病毒B组5型非结构蛋白抑制NF-κB信号通路的作用机制研究

目的 柯萨奇病毒B组5型(CVB5)是手足口病的重要病原体之一,可导致发热、皮疹或疱疹等临床症状,重症者出现神经系统疾病,甚至死亡。天然免疫应答是机体抗病毒入侵的第一道防线,其中核因子κB (NF-κB)是宿主天然免疫反应中的重要蛋白质,然而关于CVB5感染后调控NF-κB介导信号通路的研究尚鲜有报道。方法 本研究通过检测启动子活性、促炎因子水平以及通路中关键蛋白表达等,阐明CVB5对NF-κB信号通路的调控作用机制。结果 CVB5感染可抑制促炎因子表达和p65的磷酸化。CVB5非结构蛋白(NSP)可抑制促炎因子表达以及重要蛋白p65和IκBα的磷酸化。经STRING11.1数据库预测表明,CVB5 3CD蛋白与宿主多聚胞嘧啶结合蛋白1 (PCBP1)具有相互作用,且PCBP1可促进IκBα和p65的磷酸化,抑制病毒复制。结论 CVB5 NSP可负调控NF-κB信号通路,且与3CD相互作用的PCBP1蛋白可通过调控NF-κB通路抑制CVB5复制。本研究探索病毒与宿主天然免疫应答的调控作用,从而为研制抗CVB5感染的药物提供作用靶点。