柯萨奇病毒B组5型TaqMan一步法RT-qPCR检测方法的建立

目的建立柯萨奇病毒B组5型(coxsackievirusB5,CV-B5)特异的TaqMan一步法实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测方法。方法根据CV-B5的VP1序列,设计特异性引物和TaqMan探针。将目的基因插入pMD18^(TM)载体,在DH5α感受态细胞中扩增,大肠杆菌体外转录后获得RNA标准品并建立标准曲线,最后对检测方法的重复性、敏感度和特异性进行评价。结果该方法在10^(3)~10^(11)拷贝/微升的模板范围内具有良好的线性关系(r^(2)>0.99),扩增效率E=100.9%,敏感度达1×10^(3)拷贝/微升,只对CV-B5有特异性扩增曲线,且重复性较好。结论本实验建立的TaqMan一步法RT-qPCR检测方法有较高的敏感度、特异性和重复性,有良好的抗干扰性,可用于CV-B5的临床样本检测和绝对定量分析。

一株柯萨奇病毒B组5型(Cox.B5)病毒的分离及VP1基因分析

目的研究2009年昆明市无菌性脑膜炎的病原柯萨奇B5(coxsackie virus B5,CVB5)分离株(KMA193-09)的VP1基因特征。方法采用RD细胞、Hep-2细胞对患者粪便标本进行病毒分离,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒VP1基因并进行序列测定,用Mega 4.0等软件分析处理。结果从无菌性脑膜炎患者粪便标本中,分离到CVB5,其VP1区的核苷酸长度均为831bp,未发现核苷酸插入与丢失。与浙江COXB5/ZHEJIANG/12/02(CFS)株、山东02336/SD/CHN/2002/CB5株及浙江COXB5/ZHEJIANG/13/02株氨基酸同源性最高为98.19%,与国外毒株的同源性为95.67%～97.83%。在进化树上与YZ081/SD/CHN/2005/CB5株显示在同一个分支上。结论分离的肠道病毒为柯萨奇病毒B组5型(CVB5),分离株(KMA193-09)VP1区变异较小。

辽宁省首株柯萨奇病毒B组5型全基因组序列分析

研究引起辽宁地区手足口病的柯萨奇病毒B组5型(coxsackievirus B5,CV-B5)基因组特征。对2018年从辽宁省688份肠道病毒核酸阳性的标本中分离到的1株CV-B5进行高通量测序,并对其全基因组进行遗传进化分析。结果表明,CV-B5辽宁分离株与国内流行株的全基因组核苷酸序列同源性为78.5%~97%,氨基酸序列同源性为75.3%~96.7%。基于全基因组的进化分析将CV-B5流行株分为A~D四个基因型,辽宁分离株属于D基因型。通过重组分析发现其在P3区的3D区段发生重组。首次在辽宁地区手足口病患儿中分离出CV-B5,辽宁省分离株(LN2018-23-21/CHN/2018)可能为重组株。

江苏省2013—2014年3株柯萨奇病毒B组5型流行株全基因组序列分析

目的分析引起江苏省疱疹性咽峡炎的柯萨奇病毒B组5型(coxsackievirus B5, CV-B5)毒株基因组特征。方法对江苏省2013—2014年3例疱疹性咽峡炎患儿临床标本进行病原分离,获得3株CV-B5毒株,进行全基因组序列测定,与GenBank中世界各地不同年份CV-B5流行株序列进行比对分析,使用Mega 5.2软件构建系统进化树,并应用Simplot软件进行重组分析。结果获得3株CV-B5毒株,分别命名为417/JS/CHN/2013、492/JS/CHN/2013和759/JS/CHN/2014,均属于GI.D3亚型,且在位点5 224～5 696 bp(以Faulkner为参考株)与2008年北京市的CV-B3流行株(GQ141875)发生重组,在位点5 696 bp之后与2009年昆明市的CV-B3流行株(JX843810)发生重组。结论 CV-B5在婴幼儿人群中的感染可能存在严重危害,应加强对CV-B5的分子流行病学研究,监测可能发生的重组。

柯萨奇B_5型病毒引起类脊髓灰质炎麻痹2例

柯萨奇Ｂ_５型病毒引起类脊髓灰质炎麻痹２例汕头大学医学院第二附属医院传染科邱杰文，周小辉，谢若男，袁广卿［病例１］男性，１３岁。因不规则发热、在下肢无力７天于１９９３年１０月９日入院。患孩一贯身体健康，从未服用脊髓灰质炎糖丸。入院检查：Ｔ３８℃，Ｒ３?..

一起柯萨奇病毒B5型暴发的流行病学调查

目的查清柯萨奇病毒B5型暴发的原因和流行状况,并采取针对性的控制措施。方法采用现场流行病学调查方法开展调查,并依据血清学、病原学以及分子生物学进行实验结果确认。结果从2005年5月19日开始出现以发热、头痛、头昏、咽痛、恶心、呕吐等为主要症状的病例,病程一般10d左右,疫情历时34d,共发病49例,14岁以下儿童罹患率为13.57%;有15例病人住院治疗,其中10例临床诊断“病毒性脑炎”;病例全部为1岁～12岁儿童,无死亡和后遗症病例出现。应用逆转录PCR方法从病人的2份血清和2份脑脊液标本中扩增出肠道病毒特异性基因片段,并从8份粪便中培养出柯萨奇病毒,血清分型为B5型。结论本次暴发为柯萨奇B5病毒引起病毒性脑炎暴发。

柯萨奇病毒B组5型VP1蛋白的外源表达及多克隆抗体的制备

目的:原核表达柯萨奇病毒B组5型的VP1蛋白,并制备其多克隆抗体及检测。方法:提取在Vero细胞中柯萨奇病毒B组5型的RNA,通过逆转录PCR(RT-PCR)扩增获取VP1基因序列,构建原核表达载体,大量诱导表达重组VP1蛋白。用His Trap HP亲和层析柱纯化重组蛋白,以纯化的目的蛋白为抗原,免疫雄性SD大鼠获得VP1蛋白多克隆抗体血清,ELISA测定该抗体的效价,微量中和实验测定抗体的中和活性,Western blot检测抗体的特异性,免疫组化检测抗体对组织中抗原的识别。结果:成功构建了VP1-pET-28a重组载体,并且在BL21细胞中成功诱导表达,亲和层析柱纯化后蛋白纯度大于90%。ELISA测得抗体的效价为1∶128 000,微量中和实验显示抗体没有中和活性,Western blot分析显示抗体能与CVA16和EV71交叉反应,免疫组化实验表明抗体能够识别组织中的CVB5抗原。结论:本研究成功制备了CVB5 VP1蛋白的高效价的多克隆抗体,为CVB5病毒疫苗和病毒诊断的研发提供了有效的工具。

柯萨奇病毒B组5型分离株VP1区序列基因组成和密码子使用模式分析

目的探索柯萨奇病毒B组5型(Coxsackievirus group B5,CVB5)分离株VP1区序列基因组成和密码子使用模式。方法在GenBank核苷酸数据库检索CVB5毒株的VP1区全长序列,应用CodonW软件,计算CVB5分离株基因组成和密码子使用偏爱性参数,包括密码子和氨基酸含量、同义密码子各碱基含量、同义密码子第3位GC含量(GC_(3))、有效密码子数(ENC)和同义密码子相对使用度(Relative Synonymous Codon Usage,RSCU);通过ENC曲线、中性绘图、RSCU和奇偶规则(PR2)分析自然选择和突变对病毒的进化影响。结果共纳入413株CVB5分离株,其VP1区碱基含量由高到低依次为A(29.78%)、C(24.84%)、G(24.16%)、T(21.22%);密码子第3位密码子含量均值分别为A_(3)(25.90%)、T_(3)(23.31%)、C_(3)(26.31%)和G_(3)(24.49%);密码子含量前3位依次为GTG(4.67%)、ACA(3.73%)和CCA(3.70%),氨基酸含量前3位依次为Thr(11.25%)、Ser(8.11%)和Val(7.92%);共有59组密码子,其中29个同义密码子相对使用度(RSCU)均值>1,占49.15%。CVB5毒株VP1区有效密码子数(ENC)值为(55.96±2.40),中性绘图分析显示,GC_(3)和GC_(12)含量有统计学关联,但相关性较弱(b=0.046,r=0.316,P<0.001);PR2分析显示,自然选择对CVB5病毒密码子使用偏爱性作用为95.40%。结论 CVB5分离株总体密码子使用相似、偏爱性较弱,受到自然选择和突变双重影响,病毒进化相对保守。

柯萨奇病毒B5河南分离株全基因组序列测定及分析

目的:了解柯萨奇病毒B5(CoxB5)河南分离株全基因特征及与其他肠道病毒基因的关系。方法:采用RT-PCR扩增全基因,采用DNAStar中的SeqMan拼接所测序列,BioEdit进行同源性比较,Simplot进行相似度分析。结果:CoxB5/Henan/2010基因组全长7401bp。与原型株Faulkner相比,编码区氨基酸同源性为95.6%,核苷酸同源性为79.9%,其中VP4-VP2核苷酸差异为17.8%～20.4%,VP1核苷酸差异为19.5%,P2、P3核苷酸差异分别为19.5%、21.7%。不同型别肠道病毒间VP4-VP2核苷酸差异为14.4%～34.9%,VP1核苷酸差异为18.3%～42.3%,P2、P3核苷酸差异为17.1%～21.0%、15.5%～22.6%。结论:与原型株相比,CoxB5/Henan/2010株编码区发生沉默突变,其核苷酸变异并不影响氨基酸序列的变化;肠道病毒基因组各分区在进化中不同步。

双重荧光定量RT-PCR法检测柯萨奇病毒A2和A5型

目的建立同时检测柯萨奇病毒A2和A5型(CVA2、CVA5)的双重实时荧光定量RT-PCR法。方法用Primer Express3.0软件设计高度特异性引物和荧光标记探针。通过优化反应体系,建立标准曲线,并评价双重荧光定量RT-PCR法的特异性、灵敏度和重复性。用建立的方法检测367例疑似手足口病患儿的粪便标本,并对阳性结果测序验证。结果荧光定量RT-PCR结果表明本实验所选的引物和探针可特异性检测并区分出CVA2、CVA5亚型,与其他肠道病毒的阳性核酸未发生交叉反应。该方法最低检测限达到102copies/m L,批内变异系数(CV)均<1.49%。367份临床标本中CVA2型阳性23份,阳性率6.3%;CVA5阳性11份,阳性率3%,检测阳性结果与测序结果一致。结论成功建立了在单管中同时检测并鉴别CVA2、CVA5型的双重实时荧光定量RT-PCR检测方法。该方法具有较好的灵敏度、特异性、重复性,可用于CVA2、CVA5型引起的暴发疫情的快速筛查和手足口病的流行病学的研究。

柯萨奇病毒B组5型感染的人恶性胚胎横纹肌肉瘤细胞系lncRNA表达谱分析

目的探索柯萨奇病毒B组5型(CVB5)感染人恶性胚胎横纹肌肉瘤细胞系(RD)中差异长链非编码RNA(lncRNA)表达谱,为研究CVB5与宿主之间相互作用分子机制提供参考。方法CVB5按感染复数(MOI)为1接种RD细胞24 h后提取总RNA。采用转录组测序技术获取细胞中lncRNA差异表达谱;通过聚类分析、GO分析和KEGG通路富集对差异表达转录本进行了生物信息学分析。同时,利用RNAfold软件对lncRNA进行了二级结构预测。结果与对照组相比,CVB5感染RD细胞后,共有1754个mRNAs和508个lncRNA呈上调表达,3106个mRNAs和760个lncRNA呈下调表达。差异表达lncRNA的共表达基因主要富集在分子结构活性、蛋白质分子结合和体液免疫反应等生物过程;lncRNA靶基因主要参与嗅觉传导途径、细胞因子受体相互作用和神经活性配体受体相互作用等通路。此外,实时荧光定量PCR验证的7个差异表达lncRNA与测序结果一致。结论CVB5感染RD细胞后,差异显著性lncRNA主要参与了免疫相关过程,为充分理解lncRNA在CVB5感染中的调控作用奠定了基础。

基于丙型肝炎病毒NS5B基因序列分析的基因分型

目的 :建立基于丙型肝炎病毒 (HCV)NS5B基因序列分析的基因分型方法 ,对上海地区慢性丙型肝炎进行基因分型。方法 :用HCVRNA实时荧光定量检测试剂盒对慢性丙型肝炎患者血清标本的HCVRNA水平进行定量分析。用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)和套式 PCR扩增HCVRNA阳性的 4 1份标本的部分HCVNS5B区基因 ,PCR产物经回收、纯化后直接进行测序分析。从GenBank中下载 2 5份不同基因型的HCV原型序列 ,用NS5B区 2 2 2bp的基因片段构建系统进化树 ,对临床标本相应的HCVNS5B区序列进行分析。结果 :基于HCVNS5B基因序列的系统进化树分析 ,可成功地对本组 4 1份标本进行基因分型。分型结果显示 ,1b型占 85 .4 % (35 / 4 1) ,2a型占 12 .2 0 % (5 / 4 1) ,3a型占 2 .4 4 % (1/ 4 1)。结论 :基于HCVNS5B区基因序列的系统进化树分析是一种可靠和方便的HCV基因分型方法。上海地区的HCV基因型以

柯萨奇病毒B5巢式RT-PCR检测方法的建立

目的:建立一种快速、灵敏、特异的柯萨奇病毒B5(CVB5)检测方法。方法:根据GenBank发表的CVB5河南分离株全基因组序列,在其VP1区设计并合成巢式RT-PCR引物,优化PCR反应条件,建立检测CVB5的巢式RT-PCR方法。将已测得TCID50的病毒标准株进行10倍梯度稀释后用上述方法检测,以评价该方法的灵敏性;将5株不同的CVB5毒株和EV71等4株其他肠道病毒毒株及阴性对照用该方法进行扩增,以检测其特异性。用建立的巢式RT-PCR方法对52份病毒性脑炎病例样本进行检测。结果:该方法对CVB5的两轮PCR扩增敏感性分别为10TCID50和10-4TCID50;所有CVB5毒株用该方法扩增结果均为阳性,所选其他肠道病毒扩增结果均为阴性。52份临床病例样本中检出10份CVB5阳性,阳性率为19.23%。结论:所建立的CVB5巢式RT-PCR检测方法具有良好的灵敏度和特异度。

丙型肝炎病毒5’-非编码区与NS 5b区酶切分型对比研究

探讨北京与河南地区丙型肝炎病毒(HCV)基因型分布情况以及HCV 5’-NCR和HCV NS5b两区域分型结果之间的差异。对56例慢性丙型肝炎和80例有偿供血员的HCV RNA阳性血清。同时进行HCV 5’-NCR和HCV NS5b酶切分型研究。HCV 5’-NCR和HCV NS5b两区域的Ⅱ/1b型感染率北京地区分别占85.7％和87.5％,河南地区分别占68.8％和70.0％。HCV Ⅱ/lb型为北京和河南地区HCV感染的优势株,同时HCV 5’-NCR和HCV NS5b区酶切分型结果间具有良好的相互对应关系。

四种中草药水煎剂抗柯萨奇B_5病毒的细胞学实验研究

四种中草药水煎剂抗柯萨奇Ｂ_５病毒的细胞学实验研究白求恩医科大学应用基础医学研究所（１３００２１）于起福，孙非【关键词】中药，柯萨奇Ｂ＿５病毒，实验研究由柯萨奇Ｂ组病毒引起的心肌炎已成为一种流行较广泛的疾病。目前，针对治疗病毒性心肌炎中草药制剂比较少?..

1起柯萨奇B5病毒所致病毒性脑膜炎暴发调查

[目的]了解疾病暴发的原因,为今后的防治工作提供经验。[方法]对2005年兖州市1起病毒性脑膜炎暴发进行调查。[结果]全市合计发病280例,发病率为0·46‰。7月中、下旬发病162例,占57·86%;病人年龄24d至13岁,6岁以下儿童179例(占63·93%);男性166例,女性114例;病人分布在全市所有乡镇和28·74%的村,新驿、新兖、大安3处乡镇合计发病181例(占64·64%)。临床症状以低、中度发热,喷射状呕吐和头痛为主。CoxB5病毒阳性率病人早期脑脊液为46·55%,粪便为33·33%。[结论]这是1起由CoxB5病毒感染所致的病毒性脑膜炎暴发。

柯萨奇病毒B组5型非结构蛋白抑制NF-κB信号通路的作用机制研究

目的 柯萨奇病毒B组5型(CVB5)是手足口病的重要病原体之一,可导致发热、皮疹或疱疹等临床症状,重症者出现神经系统疾病,甚至死亡。天然免疫应答是机体抗病毒入侵的第一道防线,其中核因子κB (NF-κB)是宿主天然免疫反应中的重要蛋白质,然而关于CVB5感染后调控NF-κB介导信号通路的研究尚鲜有报道。方法 本研究通过检测启动子活性、促炎因子水平以及通路中关键蛋白表达等,阐明CVB5对NF-κB信号通路的调控作用机制。结果 CVB5感染可抑制促炎因子表达和p65的磷酸化。CVB5非结构蛋白(NSP)可抑制促炎因子表达以及重要蛋白p65和IκBα的磷酸化。经STRING11.1数据库预测表明,CVB5 3CD蛋白与宿主多聚胞嘧啶结合蛋白1 (PCBP1)具有相互作用,且PCBP1可促进IκBα和p65的磷酸化,抑制病毒复制。结论 CVB5 NSP可负调控NF-κB信号通路,且与3CD相互作用的PCBP1蛋白可通过调控NF-κB通路抑制CVB5复制。本研究探索病毒与宿主天然免疫应答的调控作用,从而为研制抗CVB5感染的药物提供作用靶点。

lncRNA MAGI2-AS3靶向调控miR-130a-5p对柯萨奇病毒B3诱导的大鼠心肌细胞H9C2损伤的影响

目的:探讨lncRNA MAGI2-AS3靶向miR-130a-5p调控柯萨奇病毒B3(CVB3)诱导的大鼠心肌细胞H9C2损伤的分子机制。方法:对照组,用不含药物、病毒的DMEM处理H9C2细胞48 h。CVB3组,用含有100倍半数组织培养感染剂量CVB3的DMEM处理H9C2细胞48 h(感染)。CVB3+sh-NC组,H9C2细胞转染sh-NC慢病毒后感染CVB3。CVB3+sh-MAGI2-AS3组,H9C2细胞转染sh-MAGI2-AS3慢病毒后感染CVB3。CVB3+miR-NC组,H9C2细胞转染miR-NC后感染CVB3。CVB3+miR-130a-5p组,H9C2细胞转染miR-130a-5p mimic后感染CVB3。sh-MAGI2-AS3+抗miR-NC组,sh-MAGI2-AS3、抗miR-NC共转染H9C2细胞后感染CVB3。sh-MAGI2-AS3+抗miR-130a-5p组,sh-MAGI2-AS3、抗miR-130a-5p共转染H9C2细胞后感染CVB3。qRT-PCR检测MAGI2-AS3、miR-130a-5p相对表达量;Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率;ELISA法检测TNF-α、IL-6分泌水平;双荧光素酶报告实验验证MAGI2-AS3与miR-130a-5p靶向关系;Western blot检测Bcl-2、Cleaved-Caspase-3蛋白相对表达量。结果:与对照组比较,CVB3组MAGI2-AS3相对表达量、细胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3蛋白表达水平及TNF-α、IL-6分泌水平升高,而miR-130a-5p相对表达量、Bcl-2蛋白表达水平降低(P<0.05)。分别与CVB3+sh-NC组、CVB3+miR-NC组相比,CVB3+sh-MAGI2-AS3组、CVB3+miR-130a-5p组细胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3蛋白表达水平及TNF-α、IL-6分泌水平降低,Bcl-2蛋白表达水平升高(P<0.05)。MAGI2-AS3可靶向调控miR-130a-5p表达。与sh-MAGI2-AS3+抗miR-NC组比较,sh-MAGI2-AS3+抗miR-130a-5p组细胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3蛋白表达水平及TNF-α、IL-6分泌水平升高,Bcl-2蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论:沉默MAGI2-AS3可通过上调miR-130a-5p而抑制细胞凋亡、炎症反应,进而减轻CVB3诱导的H9C2细胞损伤。

一起柯萨奇B5病毒感染引起疾病暴发的流行病学调查

目的了解当地肠道病毒感染的现状,为做好该地区肠道病毒感染的防治工作提供科学依据。方法运用现场流行病学调查方法,对所有发热病例进行流行病学调查,同时结合实验室检测结果进行进一步诊断。结果2005年5月19日—6月21日,信阳市狮河区狮河港乡西湾村发现一批以发热、头痛和头晕为主要临床表现的儿童。患者分布在该行政村的14个自然村,主要集中在1～12岁年龄段。经河南省疾病预防控制中心实验室用肠道病毒通用引物套式PCR检测及大便病毒培养鉴定,证实为柯萨奇B5病毒感染。结论本次为河南省首起柯萨奇B5病毒感染引起的病毒性脑炎。