小儿热速清口服液防治柯萨奇A16型手足口病体内外作用研究

目的:评价小儿热速清口服液对柯萨奇病毒A16株(Cox A16)体内外感染模型的抗病毒作用。方法:采用3日龄BALB/c乳鼠腹腔注射Cox A16,构建BALB/c乳鼠手足口病模型,设计了大、中、小3个剂量分别为62 mL/(kg·d)、31 mL/(kg·d)、15.5 mL/(kg·d),进行预防性给药和治疗性给药评价。预防性给药实验中,观察记录乳鼠感染程度,存活天数,计算死亡率、生命延长率。治疗性给药实验中,采用实时聚合酶链反应(Real-time PCR)检测后肢肌肉病毒载量,苏木精-伊红染色(HE)观察后肢肌肉组织、脑组织病理病变情况。体外实验采用细胞病变效应法(CPE),其对Cox A16、Cox B4、Cox B5病毒的抑制作用。Real-time PCR法检测Cox A16体外病毒载量。结果:小儿热速清口服液高、中、小剂量组均可显著性延长存活天数(P<0.01或P<0.05),高、中剂量组可以显著降低死亡率和临床感染评分(P<0.01)。中、小剂量组均可以显著降低后肢肌肉病毒载量(P<0.01或P<0.05)。大、中显著改善后肢肌肉病理学改变及病理学评分(P<0.01或P<0.05),中剂量组显著改善脑组织病理学变化及病理学评分(P<0.05)。体外实验表明,小儿热速清口服液对肠道病毒Cox B5株、Cox A16株、Cox B4株具有明显的抑制作用。结论:小儿热速清口服液对肠道病毒COX A16感染BALB/c乳鼠模型具有良好的预防和治疗作用,可能通过抑制病毒复制发挥作用。

MRC-5、Vero、Hep-2及RD细胞对柯萨奇A16病毒的敏感性比较

目的 比较MRC-5、Vero、Hep-2及RD细胞对柯萨奇A16（CoxA16）病毒的敏感性.方法 将3株CoxA16病毒毒株用病毒生长液分别作10倍稀释,共10-1～ 10-8 8个稀释度,每个稀释度取0.1 mL分别接种于长满单层MRC-5、Vero、Hep-2及RD细胞的96孔细胞培养板中,每个稀释度接种10孔,另设16孔只接种稀释液作为空白对照.培养120 h,每12h观察接种后各细胞病变（CPE）情况,直到对照细胞老化脱落为止;按Reed-Muench法计算各细胞培养96、108、120 h的50％组织培养感染剂量（TCID50）.结果 RD和Vero细胞CPE出现时间为36 h,Hep-2和MRC-5细胞为72 h.MRC-5细胞培养96、108、120 h后的TCID50分别为0、0、1.23,Vero细胞分别为5.45、6.87、7.20,Hep-2细胞分别为0、0、2.11,RD细胞分别为2.61、2.61、2.61.结论 4种细胞对CoxA16病毒的敏感性由高到低依次为Vero、RD、Hep-2、MRC-5.

疏清颗粒抗手足口病病原体柯萨奇A16型体外研究

目的观察疏清颗粒体外抗柯萨奇A16型(CoxA16)作用,为临床治疗由CoxA16感染引起的手足口病提供理论依据。方法观察由CoxA16感染人横纹肌肉瘤细胞后引起的细胞病变效应,并用MTT法检测疏清颗粒对CoxA16的抑制作用,同时以连花清瘟胶囊和板蓝根颗粒作为阳性对照药物。结果疏清颗粒能明显抑制CoxA16引起的细胞病变效应,疏清颗粒、连花清瘟胶囊和板蓝根颗粒抑制CoxA16增殖的半数有效浓度分别为0.080+0.008 mg/m1、0.072±0.044 mg/ml和0.141±0.035 mg/m1;选择指数分别为625.00+48.73、93.89+26.42、115.00+29.70。结论疏清颗粒与连花清瘟胶囊相比,细胞毒性较小,抑制CoxA16增殖作用差异无显著性;与板蓝根颗粒组相比,具有明显的抑制CoxA16增殖作用。

左卡尼汀治疗柯萨奇A16型病毒感染所致手足口病患儿血清NT-proBNP和BNP水平异常的效果

目的:观察左卡尼汀治疗柯萨奇A16型病毒(CA16型)感染所致手足口病(HFMD)血清氨基末端脑钠肽前体(NT-proBNP)和B型脑钠肽(BNP)水平异常的效果。方法:选取68例CA16型病毒感染后血氨基末端脑钠肽(NT-proBNP)和B型脑钠肽(BNP)异常的HFMD患儿,按照病案号奇偶数随机分为对照组(实施基础治疗)和观察组(基础治疗联合左卡尼汀治疗),比较两组血BNP、NTproBNP、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、门冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)等指标水平和心电图、心率变化以及重症转化率等指标水平。结果:(1)治疗前,两组患儿的性别、年龄、病程、心率、心肌酶谱、BNP、NT-proBNP等指标水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。(2)治疗3d和7d后,观察组患儿治疗总有效率分别为85.3%、100%,均高于对照组的61.8%、94.1%,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。(3)治疗3d后,观察组NT-proBNP和BNP、AST、CK-MB水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)治疗7d后,观察组CK-MB、NT-proBNP、BNP水平和心率恢复时间短于对照组,ECG恢复率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:基础治疗联合左卡尼汀治疗柯萨奇A16型病毒感染所致HFMD患儿血NT-proBNP和BNP水平异常的效果优于单纯基础治疗效果,可显著改善患儿BNP、NT-proBNP和心肌酶谱水平,缩短心率恢复时间,提高心电图恢复率。

盐酸石蒜碱硫酯体内抗柯萨奇病毒A16的药效研究

目的研究盐酸石蒜碱硫酯在体内抗柯萨奇病毒A16(CVA16)的药效。方法通过腹腔注射病毒液方式感染10~11 d的ICR小鼠建立CVA16感染的小鼠模型。实验分为盐酸石蒜碱硫酯1.0、0.5、0.25 mg·kg^(-1)组;50 mg·kg^(-1)RBV对照组;病毒对照组;正常对照组。检测盐酸石蒜碱硫酯对病毒感染后小鼠发病情况、小鼠存活率和平均存活日;蛋白免疫印迹法(Western-blot)检测肌肉组织中病毒蛋白的表达水平;采用细胞病变效应法(CPE)测定肌肉组织中的病毒滴度;采用苏木素伊红(HE)染色检测肌肉组织的病理变化。结果与病毒对照组相比,盐酸石蒜碱硫酯1.0和0.5 mg·kg^(-1)剂量组能够显著降低小鼠肌肉组织的病毒滴度和病毒蛋白表达,降低CVA16感染造成的小鼠肌肉组织的炎症损伤,延缓小鼠的发病过程,显著延长小鼠的平均存活时间,增加小鼠的存活率,具有明确的保护作用。结论盐酸石蒜碱硫酯1.0和0.5 mg·kg^(-1)剂量组对CVA16感染小鼠具有显著明确的保护作用,提示盐酸石蒜碱硫酯可能成为潜在的治疗手足口病的药物。

TLR9启动子区基因多态性与柯萨奇病毒 A16感染手足口病患儿的相关性研究

手足口病(hand,footand mouth disease,HFMD)是一类肠道病毒(enterovirus,EVs)感染引起的传染性疾病,儿童是该病的易感人群,引发手足口病的肠道病毒有多种(型),其中以肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(Cox A16)最为常见。随着近几年EV71型灭活疫苗的接种,EV71感染的儿童手足口病占比减少。虽然CoxA16病毒感染后大部分患儿临床症状较轻,但是发病率较高,引起越来越多的关注[1-2]。CoxA16感染的患儿临床表现轻重不一,轻症者仅为发热、皮疹、口腔黏膜散在疱疹等,重症者可出现中枢神经系统损害、心肺功能衰竭等[3-4],CoxA16病毒感染的发病机制至今没有完全阐明,可能与其感染导致的异常免疫反应有关[5-6]。

内标多重荧光RT-PCR同时检测肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型

[目的]为对当前爆发的手足口病进行快速准确的检测。[方法]本研究建立了含内标的同时检测EV71和CA16的多重荧光RT-PCR方法，对该方法的特异性、灵敏度等进行评估，并对400多份临床样品进行了检测。[结果]实验结果表明，该检测方法特异性强，对10株EV71病毒、8株CA16病毒和25株其他人类病毒进行了检测，特异性为100%；该检测方法对EV71和CA16的检测灵敏度分别达到0.1 TCID50和1 TCID50；将0.1-104TCID50/mL EV71和CA16样本进行重复性实验，其变异系数分别为0.9%-2.0%和0.9%-2.3%。对400多份临床样品分别进行荧光RT-PCR检测和传统方法检测，结果显示，荧光RT-PCR对EV71和CA16的阳性检出率平均为46.1%和14.2%，比传统方法（34.5%和12.8%）的阳性检测率高。另外，实验数据显示，在粪便、直肠拭子、咽喉拭子样本中，PCR抑制物存在的比例为1.8%-3.4%，表明内标对监控PCR抑制物的存在具有重要作用。[结论]本方法能同时对EV71和CA16进行快速检测，并且灵敏度高，特异性好，由于加入了内标，能有效地监控假阴性的出现，适合于手足口病的临床检测。

肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型分离株的VP1基因特征分析

目的:探讨苏皖地区手足口病(HFMD)患者肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CA16)分离株的VP1基因特征。方法:采集南京市、马鞍山市2009至2010年HFMD患者临床标本进行病毒分离和RT-PCR鉴定;扩增并测定VP1基因序列;从GenBank中选取EV71和CA16不同基因型参考毒株,利用生物信息学软件进行同源性比对和系统进化树分析。结果:共分离到9株EV71和4株CA16,EV71分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为96.5%～99.8%和99%～100%;CA16分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性为96.2%～98.5%和99.3%～100%;系统进化树分析显示,9株EV71全部属于C4a基因亚型,而4株CA16则全部属于B1b基因亚型。结论:2009至2010年苏皖地区分离到的EV71和CA16毒株分别属于C4a和B1b基因亚型,与国内其他地区HFMD病原学及分子进化研究结果一致,有望成为疫苗候选株作进一步研究。

苏州地区柯萨奇病毒A16手足口病流行病学、临床特征及OAS1基因多态性研究

目的了解2010—2014年苏州地区柯萨奇病毒A16(CA16)感染手足口病(HFMD)的流行特点、临床特征,以及寡腺苷酸合成酶1(OAS1)基因多态性与CA16感染HFMD的关系。方法收集2010—2014年确诊CA16感染HFMD患儿临床资料,分析其流行病学特点;选取其中167例患儿与同期166例EV71感染HFMD患儿进行临床特征比较;应用Taq Man探针技术检测167例CA16感染、166例EV71感染HFMD患儿及163例健康儿童的OAS1 rs10774671位点,分析该基因位点多态性与CA16感染HFMD的相关性。结果共收治HFMD患儿9 016例,CA16核酸检测阳性762例,检出率8.45%;CA16感染HFMD夏季最多,<5岁儿童占94.62%。CA16感染与EV71感染患儿比较,发热时间短,口腔疱疹、溃疡及手足臀皮疹明显,神经系统受累较少;血乳酸脱氢酶、C反应蛋白增高,IgM、IgG升高病例较少,淋巴细胞亚群中CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+的细胞比例改变明显,差异有统计学意义(P<0.05)。CA16感染HFMD患儿OAS1rs10774671基因位点上GG基因型频率明显高于健康对照组(P=0.038);CA16感染HFMD患儿OAS1 rs10774671位点基因型分布与EV71感染患儿比较差异无统计学意义(P>0.05);普通组与重型组CA16感染HFMD患儿OAS1 rs10774671位点基因型分布差异无统计学意义(P=0.475)。结论苏州地区CA16感染HFMD疫情的发生与年龄、季节有关;CA16感染HFMD患儿有不同的临床和实验室特征;OAS1 rs10774671位点GG基因型儿童更易感染CA16。

2011～2012年武汉地区柯萨奇病毒A16型VP1基因的遗传进化分析

目的了解武汉地区手足口病(HFMD)患儿柯萨奇病毒A16型(CA16)的基因型及重组特点。方法收集2011年4月至2012年3月武汉地区1 844例HFMD患儿的咽拭子标本,用实时荧光定量PCR检测CA16核酸,阳性标本进行病毒分离,对分离株进行VP1基因序列测序,选择2株来自重症和1株来自轻症患儿的CA16病毒株构建VP1序列系统进化树并分析其全基因组序列的重组特点。结果 1 844例HFMD患儿的咽拭子标本中分离出42株CA16,VP1序列系统进化分析显示,所有分离株均属于B1亚型,其中13株属于B1a亚群,29株属于B1b亚群。重组分析表明,3株CA16分离株均为亲本株CA16 A型毒株FY18/AH/CHN/2008和EV71 A型毒株Hubei-09/HB/CHN/2009型间重组所产生,重组交叉位点为基因组P2区2A和2B基因交界处。结论武汉地区的CA16分离株均为B1亚型,其中B1b亚群占明显优势,且CA16分离株存在亲本株CA16A型和EV71 A型毒株的型间重组。

柯萨奇病毒A16型VP1-VP4基因克隆及其表达产物的抗原相关性分析

目的克隆并表达柯萨奇病毒A16型VP1-VP4蛋白基因,初步分析其抗原相关性。方法抽提病毒RNA,经RT-PCR方法分别扩增出VP1-VP4蛋白基因片段,经克隆后,在QIA表达系统中表达,表达产物经8 mol/L尿素洗涤及镍柱亲和层析纯化后,用柯萨奇病毒A16型病毒免疫兔血清及肠道病毒71型病毒免疫兔血清对重组蛋白进行Western blotting及ELISA分析其抗原相关性及交叉反应性。结果成功构建的重组质粒pQE30a/VP1-VP4并经IPTG诱导,重组蛋白VP1-VP4高效表达并纯化成功,经Western blotting及ELISA证实重组蛋白VP1-VP4可以被CVA16免疫兔血清特异识别,部分与肠道病毒71型免疫血清存在交叉反应。结论在大肠杆菌M15中高效表达出柯萨奇病毒A16型VP1-VP4蛋白,经纯化产物具有较强的抗原反应性。

利用减毒沙门菌递送的柯萨奇病毒A16型VP1基因重组质粒的构建和鉴定

目的:构建能够稳定携带柯萨奇病毒A16型(CoxA16)VP1基因的重组减毒伤寒沙门菌并鉴定目的抗原的表达,研发利用减毒沙门菌递送的口服疫苗。方法:利用DNA重组技术,构建表达CoxA16 VP1蛋白的真核表达质粒,体外转染Vero细胞后检测VP1蛋白表达情况及抗原活性,并将该质粒通过电转化构建重组减毒伤寒沙门菌。结果:构建了表达CoxA16 VP1蛋白的重组质粒,转染vero细胞后检测到CoxA16 VP1蛋白的表达并具有抗原活性;获得能稳定携带该质粒的重组减毒伤寒沙门菌。结论:成功构建稳定携带柯萨奇病毒A16型(CoxA16)VP1基因的重组减毒伤寒沙门菌,为口服CoxA16疫苗的研究打下了基础。

2019年云南省文山州柯萨奇病毒A16型的基因特征

目的对云南省文山州2019年手足口病(hand,foot and mouth disease,hfmd)病原分离情况和14株柯萨奇病毒a16型(coxsackievirus a16,cv-a16)的基因特征进行分析。方法对文山州2019年hfmd实验室送到云南省疾病预防控制中心hfmd实验室的595份手足口病患者粪便标本进行病毒分离,并对分离到的74株肠道病毒(enterovirus,ev)vp1区基因进行扩增和测序定型,对cv-a16病毒进行基因特征和分子流行病学分析。结果共从595份标本中分离到74株ev,ev分离率为12.44%(74/595),其中a组病毒(enterovirus species a,ev-a)72株,占97.30%(72/74),ev-b组病毒2株,占2.70%(2/74),未分离到ev-c和ev-d组病毒。ev-a组病毒中,cv-a6病毒最多,共44株,占ev-a组分离数的61.11%(44/72),cv-a16次之,共14株,占ev-a组病毒的19.44%(14/72),ev-a109株,占12.50%(9/72)。基因进化分析表明,14株cv-a16均为b1基因亚型(subgenotype b1)。它们分为2个不同的进化分支(b1a和b1b),其中8株为b1a,6株为b1b。结论2019年文山州hfmd病原以cv-a6组为主,cv-a16次之。cv-a16病毒b1a和b1b两个分支同时在文山州流行。

2011～2013年杭州市手足口病病原谱流行特征及柯萨奇病毒A16型VP1区基因变异研究

目的了解杭州市手足口病病原谱流行特征及柯萨奇病毒A16型（CA16）分离株的VP1基因变迁规律。方法采集杭州市2011-2013年手足口病患者的2 197份临床标本,用通用引物进行肠道病毒实时荧光定量RT-PCR检测,对阳性标本进行分型,对部分CA16感染阳性重症患者标本测定VP1基因序列并进行同源性比对和系统进化树分析。结果杭州地区肠道病毒通用型核酸检出率为56.0%（1 317/2 197）,肠道病毒71（EV71）、CA16和其他肠道病毒的检出率分别为24.1%（530/2 197）、13.9%（306/2 197）和22.8%（501/2 197）。在咽拭子和粪便标本中EV71检出率均最高,分别为23.9%（301/1 258）和23.6%（148/627）,而在疱疹液标本中其他型肠道病毒检出率最高,为32.6%（76/233）,脑脊液标本中无CA16检出。咽拭子标本和粪便标本在发病初期的检出率较高,发病后第5天和第6天后检出率低于发病初期检出率,而脑脊液和疱疹液不同病程阶段的检出率无统计学意义。9株CA16分离株VP1基因的核苷酸同源性为90.8%-99.7%,分属于B1b亚型和B1a亚型。结论 2011-2013年杭州地区手足口病患者主要病原体以EV71和CA16为主,样本类型和采样时间是影响肠道病毒检出率的重要原因。杭州地区CA16毒株VP1区基因的变异程度较低,需进一步加强开展手足口病的监测。

柯萨奇病毒A16型感染性模型的建立及其相关免疫学指标和应用的评价

目的建立简便和可靠的对柯萨奇病毒A16型(coxsackievirus A16,CVA16)敏感的小型啮齿类实验动物模型。方法选取不同日龄长爪沙鼠,腹腔接种CVA16后连续观察14 d,筛选出对病毒敏感的最适接种日龄段;然后比较接种剂量与效应关系,测定其50%致死剂量(LD50);并测定感染3 d后其血液和主要组织器官中CVA16病毒滴度;最后用CVA16灭活疫苗在1日龄和11日龄免疫2针沙鼠后,在14日龄时用LD50剂量病毒攻毒,观察并记录沙鼠体重、症状及死亡率,2周后眼球采血,应用微量中和试验和ELISA分别检测中和抗体效价和总抗体水平。结果长爪沙鼠感染CVA16后出现活动减少、后肢无力、麻痹瘫痪、死亡等临床症状,不同日龄沙鼠对CVA16感染的易感能力和感染后发病程度不同,7日龄和14日龄沙鼠易感,28日龄沙鼠不易感染,最敏感和最合适接种日龄为14日龄,其LD50为1×104.5 CCID50,感染3 d后其血液和主要组织器官中均可检测到高滴度的CVA16病毒,免疫两针灭活疫苗的14日龄沙鼠用LD50剂量攻毒,存活率87.5%,疫苗免疫诱导沙鼠产生的CVA16中和抗体几何平均值(GMT)为28.14,抗体阳性率为87.5%。结论长爪沙鼠对CVA16敏感并且病毒能在其体内进行有效的复制和繁殖,可作为CVA16致病机制研究、疫苗研发及药物评价的可靠小动物模型。

肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型多重反转录-聚合酶链反应的建立及初步应用

本文旨在建立一种快速、高效的检测肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CA16)的方法,用于儿童手足口病的病原学监测。通过设计肠道病毒通用引物和CA16、EV71的型特异性引物,建立以不同引物浓度配比及两阶段退火温度提高检测敏感度和特异度的多重反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,并对首都儿科研究所附属儿童医院2010年3～10月收集的371例手足口病患儿381份临床标本同时进行病毒分离和核酸检测。结果显示,本研究建立的多重RT-PCR方法对CA16和EV71的最低模板检测浓度分别为5.32pg/ml和0.64pg/ml,反应特异度为100%。应用该方法检测381份手足口病临床标本的总阳性率为77.4%,其中CA16与EV71的检测阳性率分别为31.8%和35.4%,两者检测阳性比为1∶1.1。以病毒分离为标准,多重RT-PCR对CA16及EV71检测的准确率分别为95.2%和98.6%。因此,本研究新建立的多重RT-PCR方法准确、简便,适用于较大量样本的手足口病病原学监测。2010年引起北京地区儿童手足口病的主要病原为CA16和EV71。

手足口病患儿检测柯萨奇病毒A16和肠道病毒71型的结果分析

目的:探讨手足口病的实验室检测方法。方法:用捕获法酶联免疫吸附试验测样品中的抗体含量。结果:366例患儿中柯萨奇病毒A16阳性患儿为310例,占84.6%。肠道病毒71型阳性患儿为56例,占15.3%(其中包括同时阳性患儿36例)。结论:柯萨奇病毒A16是引起手足口病的主要病原菌之一。

柯萨奇病毒A16在恒河猴外周血单个核细胞中的增殖研究

柯萨奇病毒A16（CA16）感染灵长类动物模型显示该病毒在猴体内可形成明显的病毒血症期，在此基础上，本研究进一步分析病毒血症形成与CA16在外周血单个核细胞（PBMC ）不同组分中增殖的关系。首先用CA16感染恒河猴，检测病毒在PBMC组分CD4＋、CD8＋、CD20＋、CD11c＋、CD16＋和CD14＋细胞中的增殖情况和感染动力学，发现病毒仅在部分CD14＋细胞中有增殖表现。然后通过刺激CD14＋细胞产生一定量的树突细胞（DC），用CA16感染DC ，发现 CA16能在DC中形成具有动力学意义的增殖过程，增殖峰值出现在感染后12～36 h。这些结果可能为CA16感染发病机制提供重要信息。

胶体金法在检测肠道病毒71型IgM和柯萨奇病毒A16型IgM中的应用

目的探讨胶体金法在检测肠道病毒71型IgM(EV71-IgM)和柯萨奇病毒A16型IgM(CA16-IgM)中的应用价值。方法选择医院2017-2018年收治的400例手足口病患儿作为研究对象,均进行胶体金法和酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测;以最终确诊结果为参照,比较胶体金法与ELISA法对于CA16-IgM抗体、EV71-IgM抗体的检测结果和符合率。结果胶体金法检出CA16-IgM抗体的符合率低于ELISA法,但差异无统计学意义(P>0.05);胶体金法检出EV71-IgM抗体的符合率低于ELISA法,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论胶体金法检测CA16-IgM抗体、EV71-IgM抗体的符合率与ELISA法相近,可为临床患儿提供早期诊断的依据。