Reg Ⅲγ修饰HuMSCs对柯萨奇B3病毒诱导的心肌炎炎性细胞浸润及心脏功能的影响

目的:观察胰岛再生源蛋白Ⅲγ(RegⅢγ)修饰人脐带间充质干细胞(HuMSCs)对柯萨奇B3病毒(CVB3)诱导的小鼠心肌炎炎性细胞浸润及心脏功能的影响。方法:从新鲜脐带组织中提取HuMSCs,倒置显微镜观察形态,流式细胞仪检测细胞表面抗原表达;采用含过表达RegⅢγ的慢病毒感染HuMSCs,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达,实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测RegⅢγ mRNA表达水平。将40只小鼠按照随机数字表法分为对照组、模型组、HuMSCs组和RegⅢγ-HuMSCs组,每组10只。模型组、HuMSCs组和RegⅢγ-HuMSCs组采用腹腔注射CVB3建立心肌炎模型,HuMSCs组和RegⅢγ-HuMSCs组再分别尾静脉注射HuMSCs、RegⅢγ-HuMSCs。14 d后,采用高分辨率小动物超声成像系统记录小鼠心脏超声指标;酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组血清白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-6、IL-10和IL-23含量;苏木精-伊红(HE)染色观察心肌组织病理损伤情况,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(TUNEL)检测心肌组织细胞凋亡水平,免疫组织化学染色测定心肌组织T淋巴细胞表面抗原(CD4、CD8)和巨噬细胞特异性抗体(CD68)的表达。结果:分离的细胞呈典型纺锤形,细胞表面抗原CD44、CD73、CD90呈高表达,CD34、CD45、人类白细胞抗原-DR蛋白(HLA-DR)呈低表达,说明成功分离到HuMSCs。经过慢病毒感染的HuMSCs有明显绿色荧光蛋白表达,RegⅢγ mRNA表达水平高于未感染的细胞(P<0.05),说明成功得到RegⅢγ修饰的HuMSCs。与对照组比较,模型组小鼠射血分数(EF)、缩短分数(FS)降低,左室舒张末期容积(LVEDV)和左室收缩末期容积(LVESV)升高,血清IL-2、IL-6和IL-23含量增加,IL-4和IL-10含量减少,心肌组织内炎性细胞浸润明显,TUNEL阳性率增加,CD4、CD8及CD68蛋白表达均呈强阳性(P<0.05);与模型组比较,HuMSCs组和RegⅢγ-HuMSCs组小鼠EF和FS升高,LVEDV和LVESV降低,血清IL-2、IL-6和IL-23含量减少,IL-4和IL-10含量增加,心肌组织炎性细胞浸润减少,TUNEL阳性率减少,CD4、CD8及CD68蛋白表达均下降(P<0.05);相较于HuMSCs组,RegⅢγ-HuMSCs组小鼠EF和FS升高,LVEDV和LVESV降低,血清IL-2、IL-6和IL-23含量减少,IL-4和IL-10含量增加,心肌组织未见明显炎性细胞浸润,TUNEL阳性率减少,CD4、CD8及CD68蛋白表达下降(P<0.05)。结论:RegⅢγ修饰的HuMSCs可减轻CVB3诱导的小鼠心肌炎心肌损伤与炎性细胞浸润,改善心脏功能。

黄芪总黄酮对柯萨奇B3病毒感染乳鼠心肌细胞内质网应激及Calumenin蛋白和缝隙连接蛋白CX43的作用

目的:研究黄芪总黄酮对柯萨奇B3病毒(CVB3)感染心肌细胞内质网应激、网腔钙结合蛋白(calumenin)及缝隙连接蛋白43(CX43)作用。方法:原代培养的乳鼠心肌细胞分3组:对照组(正常细胞)、柯萨奇病毒感染组(正常细胞)、黄芪总黄酮组(正常细胞+黄芪总黄酮)。柯萨奇病毒感染组感染,黄芪总黄酮组感染同时给予黄芪总黄酮20 mg/L。采用免疫组化方法检测培养乳鼠心肌细胞α-SMA蛋白,Western blot技术检测各组心肌细胞Calumenin蛋白及内质网应激伴侣蛋白GRP78,CX43表达。结果:1与对照组相比,柯萨奇病毒感染组心肌细胞GRP78表达增多(P<0.01),calumenin蛋白及CX43表达减少(P<0.01);与柯萨奇病毒感染组比较,黄芪总黄酮组心肌细胞GRP78表达减少(P<0.01),Calumenin蛋白及CX43表达增多(P<0.01)。结论:CVB3可引发心肌细胞内质网伴侣蛋白GRP78表达增加进而发生内质网应激,并使Calumenin蛋白及CX43表达减少;黄芪总黄酮抑制CVB3感染心肌细胞内质网应激伴侣蛋白GRP78表达从而减轻内质网应激,同时使Calumenin蛋白及CX43表达增多,该实验结果可能与其抗病毒性心肌炎并发心律失常作用密切相关。

鸡血藤提取物抗柯萨奇B3病毒活性组分研究

目的研究鸡血藤提取物不同组分的抗柯萨奇B3病毒活性和性质。方法通过不同溶剂提取鸡血藤活性成分,细胞病变效应法和四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)测定不同提取组分的体外抗柯萨奇B3病毒活性。结果通过初步分离纯化得到有效成分具有抗柯萨奇B3病毒活性。用MTT法研究了鸡血藤水提物和有效成分的细胞毒性和抗柯萨奇B3病毒活性,CC50分别为725.88,179.17μg/ml,IC50分别为87.17,9.14μg/ml,TI分别为8.32,19.60。阳性对照为利巴韦林(Ribavirin)的CC50为4 900μg/ml,IC50为156.2μg/ml,其TI为31.4。结论鸡血藤有效成分在体外能明显抑制柯萨奇B3病毒的致细胞病变作用。

柯萨奇B3病毒VP1基因在大肠杆菌中的表达

本文通过融合柯萨奇Ｂ３病毒（ＣＶＢ３））ＶＰ１基因与人凝血酌基因，仗ＣＶＢ３的ＶＰ１在大肠杆菌中得到稳定的表达。经蛋白扫描仪等测定，表达的融合蛋白占菌体可溶性蛋白的１１％左右。表达的ＶＰ１产物勺抗ＣＶＢ３ＶＰ１单克隆抗体和小鼠抗ＣＶＢ３血清产生较强的免疫反应，与天然的ＣＶＢ３蛋白抗原性相同。应用无关单抗和载体质粒对照均呈现阴性反应。应用表达的ＶＰ１作为抗原，我们对临床部分急性病毒性心肌炎患者血清进行了特异性ＩｇＭ免疫印迹法检测，其结果与组织培养的ＣＶＢ３制备的蛋白抗原对患者血清的特异性ＩｇＭ反应基本一致。采用基因上程方法制备ＣＶＢ３抗原产最高，易纯化，免疫原性没有改变。故可以试用表达的ＶＰ１抗原代替目的有实验室感染危险的病毒培养及抗原制备方法，快速、特异地诊断ＣＶＢ３感染。

栀子等中药抑制柯萨奇B3病毒的体外实验研究

目的探讨栀子、黄连、黄芩、大青叶及复方制剂在体外抗柯萨奇B3病毒(CVB3)的作用。方法用细胞培养技术比较栀子、黄连、黄芩、大青叶及复方制剂等药物对CVB3引起的细胞病变的抑制作用。结果黄芩抗病毒作用最强,治疗指数(TI)为35.09;黄连抑制病毒增殖的作用最强,TI为83;栀子抑制病毒吸附和增殖作用最强,TI为238.09。结论栀子、黄连、黄芩、大青叶及复方制剂等药物对CVB3增殖的不同环节均有抑制作用。

miRNA378~*表达对柯萨奇B3病毒感染乳鼠心肌细胞凋亡、网腔钙结合蛋白、内质网应激伴侣蛋白表达的影响

目的:研究沉默miRNA378~*表达对柯萨奇B3病毒(CVB3)感染心肌细胞凋亡、内质网应激、网腔钙结合蛋白(calumenin)影响。方法:原代培养乳鼠心肌细胞分为:对照组(正常细胞)、柯萨奇病毒感染组(正常细胞+柯萨奇B3病毒)、miRNA378~*沉默对照组(正常细胞+柯萨奇B3病毒+转染miRNA378~*空质粒)、miRNA378~*沉默组(正常细胞+柯萨奇B3病毒+转染miRNA378~*沉默质粒),各组细胞分别转染和感染处理后置37℃、CO_2培养箱中培养3 d。检测细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、细胞凋亡率、网腔钙结合蛋白、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)及内质网应激信号通路因子激活转录因子6(ATF6)、转录因子C/EBP同源蛋白(CHOP)的表达。结果:通过检测ɑ-SMA蛋白,证实分离乳鼠细胞为心室肌细胞。TUNEL法检测不同组心室细胞凋亡情况发现,柯萨奇病毒感染组心室肌细胞凋亡明显,与柯萨奇病毒感染组心肌细胞相比较,miRNA378~*沉默组心肌细胞凋亡细胞量明显减少。与柯萨奇病毒感染组比较,Calumenin表达减少(P<0.01),而GRP78、ATF6、CHOP表达增加(P<0.01)。结论:CVB3病毒感染心肌细胞作用与miRNA378~*,引发内质网应激并激活信号通路因子,心肌细胞凋亡增加。

黄芪甲甙对小鼠柯萨奇B3病毒性心肌炎的抗氧化作用

目的观察黄芪甲甙对小鼠柯萨奇B3病毒性心肌炎的抗氧化作用。方法Balb/c小鼠50只随机分5组(每组10只),空白对照组腹腔无菌注射不含病毒的Eagle’s培养基0.1 mL,在腹腔注射病毒培养基30 min后,以生理盐水0.1 mL灌胃,共7d;病毒性心肌炎对照组小鼠每只腹腔注射0.1 mL内含1×102TCID50柯萨奇B3病毒的Eagle’s培养基,在腹腔注射含病毒的Eagle’s培养基30 min后,以生理盐水0.1 mL灌胃,共7 d;黄芪甲甙低、中、高剂量干预组在腹腔注射病毒30 min后,用黄芪甲甙剂量分别为0.07、0.2、0.6 g/(kg.d)0.1 mL灌胃,共7 d。观察小鼠生存数;心肌病变积分;心肌谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活力及逆转录聚合酶链反应检测铜锌超氧化物歧化酶-mRNA水平表达。结果(1)与空白对照组比较,病毒性心肌炎对照组小鼠的生存数明显下降,心肌病变积分明显升高(3.23±0.83,P<0.01);与病毒性心肌炎对照组比较,黄芪甲甙高剂量干预组可明显提高小鼠的生存数(P<0.01),心肌病变积分明显下降(1.86±0.59比3.23±0.83,P<0.01);(2)与病毒性心肌炎对照组比较,黄芪甲甙高剂量干预组心肌组织谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活力呈增高趋势,心肌组织谷胱甘肽过氧化物酶(39.73±8.02比9.99±2.71,P<0.05)、过氧化氢酶(6.35±2.33比1.36±0.87,P<0.05)、超氧化物歧化酶(65.71±4.93比40.15±6.03,P<0.01)活力明显增强,铜—锌超氧化物歧化酶-mRNA水平表达明显增高(0.43±0.11比0.32±0.01,P<0.01)。但黄芪甲甙低、中剂量干预组,虽然也在一定程度使心肌组织谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活力及逆转录聚合酶链反应检测铜—锌超氧化物歧化酶-mRNA表达水平增加,有一定的量效关系,但与病毒性心肌炎对照组比较无统计学意义(P>0.05)。结论黄芪甲甙通过增加心肌抗氧化酶活力,对小鼠柯萨奇B3病毒性心肌炎具有明显的保护作用。

利用直接原位PCR法探讨柯萨奇B3病毒与心肌炎的病原学关系

目的 探讨柯萨奇 B3病毒 (CVB3 )感染与急性心肌炎的病原学关系。方法 应用生物素标记的核苷酸直接掺入法 ,建立了直接法原位逆转录 -聚合酶链式反应 (RT-PCR)技术 ,分别对感染的 He L a细胞、病毒性心肌炎鼠心肌样本及临床心肌炎的心肌活检标本中的 CVB3进行检测。结果 病毒感染的 He L a细胞可见阳性信号 ,细胞呈蓝紫色 ,而未感染的 He L a细胞无阳性信号 ,细胞不着色。在 CVB3感染的病毒性心肌炎小鼠心肌组织中可检测到病毒 RNA的存在。 16例病理学及临床诊断为心肌炎的患者心肌组织中 ,7例检测到 CVB3 RNA,而 16例正常心肌标本中均为阴性。结论

牛磺酸对柯萨奇B3病毒感染新生大鼠心肌细胞外向钾电流的影响

观察牛磺酸对柯萨奇Ｂ３病毒（ＣｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓＢ３，ＣＶＢ３）感染新生大鼠心肌细胞外向钾电流（ｏｕｔｗａｒｄｃｕｒｒｅｎｔ，Ｉｏｕｔ）的影响。方法运用全细胞膜片钳技术记录了分离的大鼠心肌细胞外向钾电流，并观察牛磺酸的作用。结果ＣＶＢ３感染可使正常大鼠心肌细胞Ｉｏｕｔ明显增加，牛磺酸对正常大鼠心肌细胞Ｉｏｕｔ无明显影响，但可使ＣＶＢ３感染的Ｉｏｕｔ趋于正常。结论牛磺酸对ＣＶＢ３感染心肌细胞Ｋ＋通道电流的作用可能是其发挥抗心肌损伤作用的机制之一。

小鼠柯萨奇B3病毒性心肌炎心脏炎症细胞因子基因和蛋白表达及黄芪甲甙干预研究

目的探讨黄芪甲甙对小鼠柯萨奇B3病毒性心肌炎心脏炎症细胞因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6和白细胞介素10mRNA表达和蛋白质产生的影响。方法Balb/c小鼠50只随机分为5组,空白对照组,腹腔无菌注射不含病毒的Eagle’s培养基0.1mL,在腹腔注射病毒培养基30min后,以生理盐水0.1mL灌胃,共7d;病毒性心肌炎对照组,小鼠每只腹腔注射0.1mL内含1×105TCID50柯萨奇B3病毒的Eagle’s培养基,在腹腔注射含病毒的Eagle’s培养基30min后,以生理盐水0.1mL灌胃,共7d;黄芪甲甙低、中、高剂量干预组,在腹腔注射病毒30min后,用黄芪甲甙剂量分别为0.07、0.2和0.6mg/(kg·d)0.1mL灌胃,共7d。14d后处死全部小鼠并取其心脏。心脏组织一半用于逆转录聚合酶链反应法测定心脏细胞因子mRNA表达,另一半用Westernblot测定细胞因子蛋白质生成量。结果空白对照组上述细胞因子均无明显表达,心肌炎对照组肿瘤坏死因子α,白细胞介素1β,白细胞介素6和白细胞介素10mRNA和蛋白产生均显著高于空白对照组;同心肌炎对照组比较,高剂量黄芪甲甙组的肿瘤坏死因子α,白细胞介素1β,白细胞介素6mRNA和蛋白生成均显著下降,而白细胞介素10mRNA和蛋白明显升高。结论黄芪甲甙明显降低小鼠柯萨奇B3病毒性心肌炎心脏的致炎症细胞因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和白细胞介素6,而升高炎症保护因子白细胞介素10。

柯萨奇B3病毒VP1基因在原核中的表达及其临床意义

目的:研究柯萨奇B3病毒(CVB3)VP1基因在大肠杆菌中的表达及其临床意义。方法:将柯萨奇B3病毒中国分离株VP1基因克隆入PQE-30载体,转导入大肠杆菌(Ml5)中,使CVB3的VP1基因在大肠杆菌中得到稳定的表达,采用NAT亲和方法纯化,间接ELISA方法做免疫学活性鉴定。结果:表达的VP1产物与抗柯萨奇B3病毒的兔抗CVB3(多克隆抗体)血清产生较强的免疫反应,与天然的CVB3蛋白抗原(病毒组织培养抗原)的抗原性近似。应用无关兔抗体对照呈阴性反应。应用表达的VP1产物作为抗原,对临床急性病毒性心肌炎患者血清进行了特异性IgM酶联免疫吸附试验检测,其结果与组织培养的CVB3制备的细胞蛋白抗原对上述患者血清的特异性IgM检测结果基本一致。结论:采用基因工程方法制备出的CVB3-VP1蛋白抗原产量高,纯化后免疫反应原性基本没有变化。试用表达CVB3的VP1基因工程抗原代替目前实验用有感染危险的病毒培养抗原的方法,快速、特异地检出CVB3的感染,为急性心肌炎的早期诊断和及时的临床治疗提供可靠的实验室诊断指标。

针对2B区域的短双链RNA抑制柯萨奇B3病毒感染HeLa细胞的特性研究

为了研究短双链RNA(Small interfering RNA,siRNA)对柯萨奇B组3型病毒(CVB3)复制的影响及其作用特性,合成针对CVB3基因组2B区的siRNA-2B,脂质体法转染HeLa细胞后感染CVB3病毒,观测转染效率及存留时间、毒性作用、病毒致细胞病变效应、病毒滴度、病毒RNA含量、siRNA-2B对重组基因的特异性降解及培养上清有限稀释后再感染情况。结果发现siRNA-2B能高效转染入HeLa细胞并存留长达48h,高剂量的siRNA-2B对培养细胞无明显毒性,siRNA-2B能特异性针对2B区有效地降解病毒RNA,能明显抑制病毒RNA的复制。随着转染浓度的增加,siRNA-2B的抗病毒作用逐渐增强。siRNA-2B还能明显降低CVB3的再感染能力。这些结果提示,针对基因组2B区的siRNA-2B可以明显抑制CVB3基因复制,有效控制病毒再感染,并具有高效性、特异性和量效关系等特点。为siRNA可能成为预防和治疗CVB3感染的新途径奠定基础。

黄芪总黄酮对柯萨奇B3病毒感染心肌细胞钠电流的作用

目的探讨黄芪总黄酮（TFA）对嗜心性柯萨奇B3病毒（CVB3m）感染心肌细胞钠电流的作用。方法采用体外培养小鼠新生心肌细胞方法，建立柯萨奇B3病毒感染心肌细胞模型，采用全细胞膜片钳记录技术记录心室肌细胞钠电流（INa）。结果应用黄芪总黄酮（TFA）组与柯萨奇B3病毒感染模型组相比较，INa峰值从（-7．79±1．53）nA下降到（-5．64±1．67）nA，差异有统计学意义（P〈0．01，n=6）。结论黄芪总黄酮可显著降低柯萨奇B3病毒感染心肌细胞钠电流的幅值。

CAR在柯萨奇B3病毒感染心肌细胞中作用

目的探讨柯萨奇病毒和腺病毒受体(coxsackievirusandadenovirusreceptor,CAR)在嗜心性柯萨奇B3病毒(myocarditiccoxsaekievirusB3,CVB3m)感染心肌细胞中的作用。方法采用体外培养新生小鼠心肌细胞方法,建立CVB3m感染心肌细胞模型,将培养48h的心肌细胞分为对照组、CVB3m组和CAR抗体+CVB3m组,并作相应处理,继续培养48h后,分别观察各组心肌细胞病变效应(cytopathiceffect,CPE),并用四唑盐(MTT)比色法测定各组心肌细胞存活力。结果CAR抗体+CVB3m组心肌细胞CPE明显减轻,存活力显著增强,与CVB3m组比较差异显著(P<0.01),与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。结论CAR抗体对CVB3m感染心肌细胞具有保护作用,提示CAR在CVB3m感染心肌细胞中可能发挥重要的介导作用。

浙江省2006年柯萨奇B3病毒VP1基因分析

目的：研究2006年浙江省无菌性脑膜炎的病原柯萨奇B3（CoxB3）分离株（Zhejiang／52／06）的VP1基因特征。方法：采用RD、Hep-2细胞对患者脑脊液和粪便标本进行病毒分离，逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）扩增病毒VP1基因并进行序列测定，用BioEdit等软件分析处理。结果：浙江省柯萨奇B3分离株的VP1基因852个核苷酸，编码281个氨基酸，与北京、哈尔滨的CoxB3分离株核苷酸同源性在79．1％～79．2％，与欧美国家分离株的核苷酸同源性在78．5％～81，7％，与乌兹别克斯坦分离株核苷酸同源性为82．7％。进化树分析显示，浙江省柯萨奇B3分离株（Zhejiang／52／06）与B3／Uzbekistart／99、B3／Germany／PD00分离株亲缘关系最近。结论：柯萨奇B3分离株的变异特征及亲缘进化，分析对无菌性脑膜炎的流行病学研究具有重要意义。

口服IL-12重组双歧杆菌对柯萨奇B3病毒诱导BLAB/c小鼠心肌炎的影响

目的构建白细胞介素(IL)-12基因重组双歧杆菌(pBBADs-IL-12转化双歧杆菌),观察pBBADs-IL-12转化双歧杆菌是否对柯萨奇B3病毒(CVB3)诱导的小鼠心肌炎具有治疗作用。方法构建小鼠IL-12(mIL-12)基因的pBBADs-IL-12表达载体,转化双歧杆菌,体外通过酶联免疫吸附试验及Western免疫印迹验证重组双歧杆菌工程菌在L-阿拉伯糖诱导下mIL-12的表达。选取BLAB/c小鼠30只,腹腔内注射CVB3感染剂量,14 d后形成病毒性心肌炎,将感染的小鼠随机分成IL-12组、绿荧光蛋白(GFP)组及生理盐水组。IL-12组给予口服pBBADs-IL-12转化双歧杆菌;GFP组给予口服pBBADs-GFP转化双歧杆菌;生理盐水组给予腹腔注射无菌PBS(1次/d)。所有小鼠均在治疗14 d后取心脏标本观察心肌病理变化,检测心肌病毒滴度,荧光定量PCR分析Th1细胞因子水平。结果治疗14 d后,HE染色显示IL-12组小鼠心肌炎症程度较GFP组和生理盐水组明显减轻;IL-12组小鼠心脏炎症病变百分比为(18±5)%,心肌的病毒滴度为(2.89±0.18)pfu/g,显著低于GFP组[分别为(31±6)%和(4.83±0.14)pfu/g]及生理盐水组[分别为(32±9)%和(4.80±0.15)pfu/g],差异有统计学意义(均P<0.01);IL-12组小鼠心脏γ-干扰素[(2.27±0.15)pg/mL]和肿瘤坏死因子-α[(3.05±0.17)pg/mL]水平显著高于GFP组[分别为(1.32±0.11)pg/mL和(2.37±0.16)pg/mL]及生理盐水组[分别为(1.38±0.11)pg/mL和(2.37±0.12)pg/mL],差异有统计学意义(均P<0.01)。结论此次研究成功构建了一种新型表达mIL-12的双歧杆菌载体,口服IL-12转化双歧杆菌对CVB3病毒诱导的小鼠心肌炎具有较好疗效。

RT-PCR方法检测柯萨奇B3病毒的应用体会

柯萨奇病毒（Coxsachievirus）属于肠道病毒,是一种小RNA病毒,常见于呼吸道和消化道感染。其中,CVB3是一类嗜心肌细胞病毒,对新生儿危害很大,可导致病毒性心肌炎。至2010年全世界范围内210种CVB3毒株中有29株在亚洲人群中有感染。对于病毒早期感染,目前临床经常使用的抗体检测方法滞后不便于早期诊断。

人源抗菌肽LL-37对柯萨奇B3病毒诱导的病毒性心肌炎小鼠病毒复制及炎症反应的影响

目的探讨人源抗菌肽LL-37对病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)小鼠病毒复制和炎症反应的影响及其可能的分子机制。方法将48只BALB/c小鼠随机分成4组:正常对照组(Blank)、模型组(VMC)、LL-37低剂量组(LL-37-L)和LL-37高剂量组(LL-37-H),每组12只。除Blank组外,其他组均采用腹腔注射柯萨奇B3病毒(Coxsackie virus B3,CVB3)病毒液构建VMC模型小鼠。于抗菌肽LL-37干预第7天后将小鼠处死并取材。采用苏木素伊红染色观察心肌组织病理学变化;全自动生化仪检测血清心肌损伤标志物心肌肌钙蛋白I(cTnI)、肌红蛋白(Mb)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)浓度;50%终点法测定心肌组织CVB3病毒滴度;实时定量聚合酶链反应法检测心肌组织中CVB3 RNA表达水平;酶联免疫吸附试验法检测心肌组织炎症因子白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)浓度;Western blot法检测心肌组织TLR-4、MyD88和p-NF-κB p65蛋白表达水平。结果与Blank组比较,VMC组小鼠心肌组织出现明显炎性损伤,且心肌病理积分显著增加[(3.18±0.33)分vs(0.00±0.00)分,P<0.05];血清中心肌肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶和肌红蛋白浓度显著上升;心肌组织中CVB3病毒滴度,CVB3 RNA及IL-1β、IL-6和TNF-α浓度,以及心肌组织中TLR-4、MyD88和p-NF-κB p65等蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)。与VMC组比较,LL-37-H组小鼠心肌病理积分显著降低[(1.56±0.27)分vs(3.18±0.33)分,P<0.05],并且以上各检测指标均明显降低(P<0.05),而LL-37-L组小鼠以上各指标均无显著性变化(P>0.05)。结论人源抗菌肽LL-37可抑制VMC小鼠心肌组织中CVB3病毒复制和炎症反应,改善心肌损伤,其机制可能与TLR-4/NF-κB通路的抑制有关。

柯萨奇B3病毒感染小鼠心肌及骨骼肌细胞线粒体损伤的对比研究

目的:以CVB3感染小鼠为模型,研究病毒性心肌炎病程不同时期心肌及骨骼肌细胞线粒体损伤程度及其与心功能变化的关系。方法:50只雄性BALB/C小鼠随机分为正常组(n=10,0.1mL Ea-gle腹腔注射);病毒感染组(n=40,0.1mL TCID50为108 CVB3腹腔注射)。病毒感染组小鼠分别于第3,11,24天随机取10只以及正常组的10只于24d颈总动脉插管测量心率、左室压(LVP)及左室内压最大变速率(±dp/dt)。透射电镜观察心肌、骨骼肌细胞超微结构改变及线粒体膜磷脂脱失程度,PCR测定线粒体DNA3867片段(mtDNA3867)缺失情况。结果:病毒感染11d、24dLVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax明显低于正常组(P<0.05)。病毒感染后心肌、骨骼肌细胞均存在不同程度的超微结构改变。感染组心肌、骨骼肌细胞线粒体膜磷脂定位与对照组比较,11d较正常组出现明显改变(P<0.01),24d稍有好转。正常组心肌、骨骼肌细胞均未检出mtDNA3867缺失,而感染组心肌及骨骼肌细胞均存在mtDNA3867缺失,并随病程发展,有所增加。结论:线粒体损伤在病毒性心肌炎病程早期即出现,且随病程发展不断加重。心肌及骨骼肌线粒体膜磷脂缺失及mtDNA缺失变化趋势相同。骨骼肌有望成为研究心肌细胞线粒体损伤的良好模型。