柯萨奇病毒B组5型TaqMan一步法RT-qPCR检测方法的建立

目的建立柯萨奇病毒B组5型(coxsackievirusB5,CV-B5)特异的TaqMan一步法实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测方法。方法根据CV-B5的VP1序列,设计特异性引物和TaqMan探针。将目的基因插入pMD18^(TM)载体,在DH5α感受态细胞中扩增,大肠杆菌体外转录后获得RNA标准品并建立标准曲线,最后对检测方法的重复性、敏感度和特异性进行评价。结果该方法在10^(3)~10^(11)拷贝/微升的模板范围内具有良好的线性关系(r^(2)>0.99),扩增效率E=100.9%,敏感度达1×10^(3)拷贝/微升,只对CV-B5有特异性扩增曲线,且重复性较好。结论本实验建立的TaqMan一步法RT-qPCR检测方法有较高的敏感度、特异性和重复性,有良好的抗干扰性,可用于CV-B5的临床样本检测和绝对定量分析。

辽宁省首株柯萨奇病毒B组5型全基因组序列分析

研究引起辽宁地区手足口病的柯萨奇病毒B组5型(coxsackievirus B5,CV-B5)基因组特征。对2018年从辽宁省688份肠道病毒核酸阳性的标本中分离到的1株CV-B5进行高通量测序,并对其全基因组进行遗传进化分析。结果表明,CV-B5辽宁分离株与国内流行株的全基因组核苷酸序列同源性为78.5%~97%,氨基酸序列同源性为75.3%~96.7%。基于全基因组的进化分析将CV-B5流行株分为A~D四个基因型,辽宁分离株属于D基因型。通过重组分析发现其在P3区的3D区段发生重组。首次在辽宁地区手足口病患儿中分离出CV-B5,辽宁省分离株(LN2018-23-21/CHN/2018)可能为重组株。

柯萨奇病毒B组5型非结构蛋白抑制NF-κB信号通路的作用机制研究

目的 柯萨奇病毒B组5型(CVB5)是手足口病的重要病原体之一,可导致发热、皮疹或疱疹等临床症状,重症者出现神经系统疾病,甚至死亡。天然免疫应答是机体抗病毒入侵的第一道防线,其中核因子κB (NF-κB)是宿主天然免疫反应中的重要蛋白质,然而关于CVB5感染后调控NF-κB介导信号通路的研究尚鲜有报道。方法 本研究通过检测启动子活性、促炎因子水平以及通路中关键蛋白表达等,阐明CVB5对NF-κB信号通路的调控作用机制。结果 CVB5感染可抑制促炎因子表达和p65的磷酸化。CVB5非结构蛋白(NSP)可抑制促炎因子表达以及重要蛋白p65和IκBα的磷酸化。经STRING11.1数据库预测表明,CVB5 3CD蛋白与宿主多聚胞嘧啶结合蛋白1 (PCBP1)具有相互作用,且PCBP1可促进IκBα和p65的磷酸化,抑制病毒复制。结论 CVB5 NSP可负调控NF-κB信号通路,且与3CD相互作用的PCBP1蛋白可通过调控NF-κB通路抑制CVB5复制。本研究探索病毒与宿主天然免疫应答的调控作用,从而为研制抗CVB5感染的药物提供作用靶点。

柯萨奇B_5型病毒引起类脊髓灰质炎麻痹2例

柯萨奇Ｂ_５型病毒引起类脊髓灰质炎麻痹２例汕头大学医学院第二附属医院传染科邱杰文，周小辉，谢若男，袁广卿［病例１］男性，１３岁。因不规则发热、在下肢无力７天于１９９３年１０月９日入院。患孩一贯身体健康，从未服用脊髓灰质炎糖丸。入院检查：Ｔ３８℃，Ｒ３?..

江苏省2013—2014年3株柯萨奇病毒B组5型流行株全基因组序列分析

目的分析引起江苏省疱疹性咽峡炎的柯萨奇病毒B组5型(coxsackievirus B5, CV-B5)毒株基因组特征。方法对江苏省2013—2014年3例疱疹性咽峡炎患儿临床标本进行病原分离,获得3株CV-B5毒株,进行全基因组序列测定,与GenBank中世界各地不同年份CV-B5流行株序列进行比对分析,使用Mega 5.2软件构建系统进化树,并应用Simplot软件进行重组分析。结果获得3株CV-B5毒株,分别命名为417/JS/CHN/2013、492/JS/CHN/2013和759/JS/CHN/2014,均属于GI.D3亚型,且在位点5 224～5 696 bp(以Faulkner为参考株)与2008年北京市的CV-B3流行株(GQ141875)发生重组,在位点5 696 bp之后与2009年昆明市的CV-B3流行株(JX843810)发生重组。结论 CV-B5在婴幼儿人群中的感染可能存在严重危害,应加强对CV-B5的分子流行病学研究,监测可能发生的重组。

一株柯萨奇病毒B组5型(Cox.B5)病毒的分离及VP1基因分析

目的研究2009年昆明市无菌性脑膜炎的病原柯萨奇B5(coxsackie virus B5,CVB5)分离株(KMA193-09)的VP1基因特征。方法采用RD细胞、Hep-2细胞对患者粪便标本进行病毒分离,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒VP1基因并进行序列测定,用Mega 4.0等软件分析处理。结果从无菌性脑膜炎患者粪便标本中,分离到CVB5,其VP1区的核苷酸长度均为831bp,未发现核苷酸插入与丢失。与浙江COXB5/ZHEJIANG/12/02(CFS)株、山东02336/SD/CHN/2002/CB5株及浙江COXB5/ZHEJIANG/13/02株氨基酸同源性最高为98.19%,与国外毒株的同源性为95.67%～97.83%。在进化树上与YZ081/SD/CHN/2005/CB5株显示在同一个分支上。结论分离的肠道病毒为柯萨奇病毒B组5型(CVB5),分离株(KMA193-09)VP1区变异较小。

一起柯萨奇病毒B5型暴发的流行病学调查

目的查清柯萨奇病毒B5型暴发的原因和流行状况,并采取针对性的控制措施。方法采用现场流行病学调查方法开展调查,并依据血清学、病原学以及分子生物学进行实验结果确认。结果从2005年5月19日开始出现以发热、头痛、头昏、咽痛、恶心、呕吐等为主要症状的病例,病程一般10d左右,疫情历时34d,共发病49例,14岁以下儿童罹患率为13.57%;有15例病人住院治疗,其中10例临床诊断“病毒性脑炎”;病例全部为1岁～12岁儿童,无死亡和后遗症病例出现。应用逆转录PCR方法从病人的2份血清和2份脑脊液标本中扩增出肠道病毒特异性基因片段,并从8份粪便中培养出柯萨奇病毒,血清分型为B5型。结论本次暴发为柯萨奇B5病毒引起病毒性脑炎暴发。

柯萨奇病毒B组5型VP1蛋白的外源表达及多克隆抗体的制备

目的:原核表达柯萨奇病毒B组5型的VP1蛋白,并制备其多克隆抗体及检测。方法:提取在Vero细胞中柯萨奇病毒B组5型的RNA,通过逆转录PCR(RT-PCR)扩增获取VP1基因序列,构建原核表达载体,大量诱导表达重组VP1蛋白。用His Trap HP亲和层析柱纯化重组蛋白,以纯化的目的蛋白为抗原,免疫雄性SD大鼠获得VP1蛋白多克隆抗体血清,ELISA测定该抗体的效价,微量中和实验测定抗体的中和活性,Western blot检测抗体的特异性,免疫组化检测抗体对组织中抗原的识别。结果:成功构建了VP1-pET-28a重组载体,并且在BL21细胞中成功诱导表达,亲和层析柱纯化后蛋白纯度大于90%。ELISA测得抗体的效价为1∶128 000,微量中和实验显示抗体没有中和活性,Western blot分析显示抗体能与CVA16和EV71交叉反应,免疫组化实验表明抗体能够识别组织中的CVB5抗原。结论:本研究成功制备了CVB5 VP1蛋白的高效价的多克隆抗体,为CVB5病毒疫苗和病毒诊断的研发提供了有效的工具。

柯萨奇病毒B组5型分离株VP1区序列基因组成和密码子使用模式分析

目的探索柯萨奇病毒B组5型(Coxsackievirus group B5,CVB5)分离株VP1区序列基因组成和密码子使用模式。方法在GenBank核苷酸数据库检索CVB5毒株的VP1区全长序列,应用CodonW软件,计算CVB5分离株基因组成和密码子使用偏爱性参数,包括密码子和氨基酸含量、同义密码子各碱基含量、同义密码子第3位GC含量(GC_(3))、有效密码子数(ENC)和同义密码子相对使用度(Relative Synonymous Codon Usage,RSCU);通过ENC曲线、中性绘图、RSCU和奇偶规则(PR2)分析自然选择和突变对病毒的进化影响。结果共纳入413株CVB5分离株,其VP1区碱基含量由高到低依次为A(29.78%)、C(24.84%)、G(24.16%)、T(21.22%);密码子第3位密码子含量均值分别为A_(3)(25.90%)、T_(3)(23.31%)、C_(3)(26.31%)和G_(3)(24.49%);密码子含量前3位依次为GTG(4.67%)、ACA(3.73%)和CCA(3.70%),氨基酸含量前3位依次为Thr(11.25%)、Ser(8.11%)和Val(7.92%);共有59组密码子,其中29个同义密码子相对使用度(RSCU)均值>1,占49.15%。CVB5毒株VP1区有效密码子数(ENC)值为(55.96±2.40),中性绘图分析显示,GC_(3)和GC_(12)含量有统计学关联,但相关性较弱(b=0.046,r=0.316,P<0.001);PR2分析显示,自然选择对CVB5病毒密码子使用偏爱性作用为95.40%。结论 CVB5分离株总体密码子使用相似、偏爱性较弱,受到自然选择和突变双重影响,病毒进化相对保守。

柯萨奇病毒B组5型感染的人恶性胚胎横纹肌肉瘤细胞系lncRNA表达谱分析

目的探索柯萨奇病毒B组5型(CVB5)感染人恶性胚胎横纹肌肉瘤细胞系(RD)中差异长链非编码RNA(lncRNA)表达谱,为研究CVB5与宿主之间相互作用分子机制提供参考。方法CVB5按感染复数(MOI)为1接种RD细胞24 h后提取总RNA。采用转录组测序技术获取细胞中lncRNA差异表达谱;通过聚类分析、GO分析和KEGG通路富集对差异表达转录本进行了生物信息学分析。同时,利用RNAfold软件对lncRNA进行了二级结构预测。结果与对照组相比,CVB5感染RD细胞后,共有1754个mRNAs和508个lncRNA呈上调表达,3106个mRNAs和760个lncRNA呈下调表达。差异表达lncRNA的共表达基因主要富集在分子结构活性、蛋白质分子结合和体液免疫反应等生物过程;lncRNA靶基因主要参与嗅觉传导途径、细胞因子受体相互作用和神经活性配体受体相互作用等通路。此外,实时荧光定量PCR验证的7个差异表达lncRNA与测序结果一致。结论CVB5感染RD细胞后,差异显著性lncRNA主要参与了免疫相关过程,为充分理解lncRNA在CVB5感染中的调控作用奠定了基础。

柯萨奇病毒B组5型山东分离株基因特征分析

目的探明山东11株柯萨奇病毒B组5型(CVB5)的全基因组特征,探讨CVB5病毒遗传进化规律。方法采集2020年山东省手足口病患者的粪便样本,通过临床样本荧光定量检测、病毒分离、高通量和一代测序验证,共获得11株CVB5分离株,同时结合GenBank公共数据库中收录的CVB5病毒株全长基因组和结构蛋白VP1基因序列,构建最大似然系统进化树,研究CVB5基因特征和遗传进化规律。结果11株CVB5分离株全长基因组呈高度核苷酸和氨基酸相似性(>99.9%),与多数2008-2020年我国流行毒株均位于全基因组进化树的Group 4分支,且与2013年江苏省分离株417核苷酸相似性最高,为96.8%;11株CVB5分离株与Group 4参考株相比,P3区3A、3B、3C和3D基因核苷酸同源性均低于P1和P2区其他基因,且多为同义突变;11株CVB5分离株VP1基因位于我国主要流行亚型即C4基因亚型中,与2018年山东省分离株SWG14、SWG44、JN18120亲缘关系较近,核苷酸同源性为96.1%~98.2%。结论CVB5毒株在我国多地持续流行,11株山东分离株同国内多数CVB5株的全基因组及VP1基因均位于同一进化分支,说明11株分离株均为近期国内流行株,它们所在Group 4为国内优势流行分支,C4基因亚型为国内VP1基因流行亚型。

云南省一株柯萨奇病毒B组5型分离株的全基因组解析

目的对云南省2022年一例流感样病例的咽拭子分离得到的柯萨奇病毒B组5型(coxsackievirus B5,CVB5)病毒株进行全基因组测序,并分析其遗传进化、基因突变和重组特征。方法通过人宫颈癌细胞培养获得病毒分离株,应用全基因组测序技术对分离株进行病毒基因序列测定,采用MEGA、RDP4及SimPlot软件,解析病毒基因组学特征。结果分离株YN-01/CHN/2022与2株广东CVB5流行株核苷酸同源性为96.6%,属GⅠ.C1分支,与国内大多其他CVB5流行株相似度低(≤90.3%),揭示国内CVB5流行株间基因组差异较大。该分离株VP1序列存在2个特有的氨基酸突变(T246A和T275A),但其95位氨基酸未发生改变。基因重组分析显示YN-01/CHN/2022可能为重组株,重组位点发生在P1区VP4(940)和P2区2A(3540)。结论本研究分离株YN-01/CHN/2022属于CVB5 GⅠ.C1基因型,存在特异的核苷酸分歧,也证实了CVB5基因组有重组现象发生。该数据提示增强CVB5分子流行病学研究工作,持续追踪病毒进化规律,不断提高相关疾病防控工作的精准性。

一起柯萨奇病毒B5型感染暴发的调查

河南省信阳市西湾村三面环水，地理环境比较封闭。2005年春末夏初，该村儿童陆续发生了以发热、头痛、头昏为主要症状的不明原因发热病例。经现场流行病学调查和实验室检测，证实是由柯萨奇B5型病毒引起病毒性脑炎暴发。

浙江省2008年病毒性脑膜脑炎病原柯萨奇B组5型病毒VP_1区基因变异分析

目的研究浙江省2008年病毒性脑膜脑炎中分离到的柯萨奇B组5型病毒(Coxsackie Virus B5,CVB5)VP1区的基因特征,并与其他国家的分离株和CVB5原型株进行比较,探讨病毒VP1区的变异与病毒性脑膜脑炎流行的关系。方法用人喉癌上皮细胞和人横纹肌肉瘤细胞对脑脊液(Cerebrospinal Fluid,CSF)和粪便标本进行病毒分离,对分离到的病毒株提取核糖核酸,再用逆转录-聚合酶链反应扩增CVB5VP1区基因片段并进行序列测定,用DNA MAN和Bioedit等软件进行分析处理。结果从浙江省2008年病毒性脑膜脑炎患者CSF和粪便标本中,分离到的5株CVB5,其VP1区的核苷酸长度均为735bp,未发现核苷酸插入与丢失。与浙江(Zhejiang,ZJ)/12/02株氨基酸同源性最高为99.6%～100%,与法国等国外毒株的同源性为97.3%～99.6%,而与CVB5原型株的同源性只有96.3%。不同年份、不同地点分离的CVB5在进化树上显示在同一个分支上。结论2008年引起浙江省病毒性脑膜脑炎的CVB5的VP1区变异较小,引起的病毒性脑膜脑炎在局部地区散发,未发生明显的流行。

一株引起病毒性脑炎的柯萨奇B组5型病毒全基因组分析

目的对一株病毒性脑炎病原柯萨奇病毒B5(coxsackievirus B5,CV-B5)分离株KMA2/YN/CHN/2010的全基因组及其遗传特性进行分析。方法对297份病毒性脑炎患者脑脊液在RD细胞进行病毒分离;提取病毒RNA,采用RT-PCR移步法分段扩增CV-B5全长基因,经测序和拼接后,利用MEGA 7.0和SimPlot 3.5.1等软件进行分析。结果通过分离获得一株阳性分离株,经鉴定为CV-B5 KMA2/YN/CHN/2010株,其基因组全长为7 395 bp,编码含2 185个氨基酸残基的多聚蛋白。与其他CV-B5病毒分离株的全基因组的核苷酸和氨基酸同源性分别为79.6%~98.8%和93.1%~98.1%;KMA2/YN/CHN/2010与其他CV-B5株在各区段核苷酸和氨基酸同源性分别为75.0%~100.0%和88.8%~100.0%。其中与A210/KM/09株同源性最高。进化分析发现CV-B5分4个基因型,KMA2/YN/CHN/2010属于C基因型。通过重组分析发现KMA2/YN/CHN/2010可能为重组株。结论 KMA2/YN/CHN/2010与其他中国株一样同属于C基因型。

2011年河南省脑炎患者柯萨奇病毒B5型分离株基因组序列分析

目的分析河南省柯萨奇病毒B5（CVB5）分离株全基因序列，了解其遗传特性。方法采集2例脑炎患者临床标本，分离病毒，提取病毒阳性分离物RNA，进行RT-PCR扩增，产物直接测序。利用DNAStar5．01和Mega5．05软件进行全基因序列拼接及亲缘进化分析。结果获得2株CVB5分离株（03001N和17Y）全基因组序列，核苷酸长度分别为7408bp和7404bp，两者核苷酸同源性为97％，同2010年河南CVB5分离株同源性最高，分别为98％和99％。5’-UTR分别为747bp和743bp；3’-UTR区均为103bp；病毒基因组编码区全长同为6558bp，编码含2185个氨基酸残基的多聚蛋白，氨基酸同源性为99％。VPl区系统发生树分析显示，2株CVB5分离株进化关系较近，同近年来国内其他分离株成一簇，而2009年的河南省CVB5分离株同山东省CVB5分离株成一簇。结论河南省内存在不同CVB5株传播链的流行，此次分离株为近几年内的主要流行株。

2014年山东省柯萨奇病毒B5型的分子流行病学研究

为了解山东省柯萨奇病毒B5型(Coxsackievirus B5,CV-B5)的分子进化特征,本研究对山东省2014年1~12月无菌性脑膜炎(Aseptic meningitis,AM)病例标本和环境污水监测标本进行肠道病毒(Enterovirus,EV)分离,阳性分离物采用分子生物学方法鉴定型别,并对CV-B5的VP1区序列进行系统进化树分析。结果显示,2014年AM病例中分离到69株CV-B5,占EV分离株43.95%;环境污水中分离到159株CV-B5,占非脊髓灰质炎EV分离株34.49%。上述CV-B5分离株具有季节性特征,夏秋季高峰明显。系统进化树分析表明,本研究分离株属于A、B两个基因簇,各簇之内AM和环境污水分离株之间有密切的亲缘关系,且环境污水分离株具有一定的地域聚集性。A、B基因簇的组内遗传距离分别为0.026、0.030,A基因簇与B基因簇组间遗传距离为0.085,提示CV-B5在山东地区存在2个传播链共循环,同时可能存在CV-B5跨地区传播和流行。本研究结果证明环境监测具有对EV相关疾病的预警能力。

一例重症手足口病死亡患儿柯萨奇病毒B5型VP4区基因特征分析

目的:对一例重症手足口病死亡患儿肠道病毒型别进行鉴定,分析VP4区基因特征,了解其变异情况。方法:提取病毒RNA,用肠道病毒VP4区分型引物进行半巢式RT-PCR(RT-nPCR),通过测序和Blast比对确定肠道病毒型别;并对其VP4区进行序列和进化分析。结果:RT-nPCR扩增目的片段测序结果经Blast比对确定为柯萨奇病毒B5型(CoxB5),命名为BJ09-237(Genbank登录号为JF430480)。其VP4区全长207bp,与CoxB5参考序列在VP4区的核苷酸同源性为79%～98%,氨基酸同源性为95%～100%,与广东株HQ005438及俄罗斯株GQ281602在同一进化树分支上。BJ09-237在VP4区无氨基酸的缺失和插入,未发现其所特有的氨基酸置换。结论:该重症手足口病死亡患儿CoxB5的VP4区基因序列未发生明显变异。

龙岩市柯萨奇病毒B5型基因特征分析

目的分析龙岩市2012年病毒性脑炎病例柯萨奇B组病毒5型(CVB5)的基因特征。方法采集患者脑脊液进行病毒分离,用中和试验确定毒株血清型,用008-013(GCRTGCAATGAYTTCTCWGT/GGIGCRTTICCYTCIGTCCA)和012-011(ATGTAYGTICCICCIGGIGG/GCICCIGAYTGITGICCRAA)两对引物分段扩增VP1区,进行序列分析。结果从152份患者脑脊液标本中,分离出2株CVB5,其部分VP1编码区序列长度为469/434个核苷酸,编码156/144个氨基酸。2株核苷酸同源性为92%,氨基酸同源性86%;与原型株Faulkner的核苷酸同源性73%~77%,氨基酸同源性82%~91%。与2011年3株龙岩分离株的核苷酸同源性83%~92%,氨基酸同源性78%~93%。系统进化树分析显示,2株龙岩分离株同属D组基因型。结论龙岩市2012年流行的CVB5病毒株出现了较大变异,患者可能出现神经系统并发症。应加强对CVB5株所致疾病的监测及其遗传进化的研究,为相关疾病防控提供依据。

天津市致病毒性脑炎柯萨奇病毒B组5型全基因组序列分析

肠道病毒是我国病毒性脑炎(Viral encephalitis,VE)的主要病原体。本文研究对4株引起VE的天津柯萨奇病毒B组5型(Coxsackievirus B5,CV-B5)分离株进行Illumina MiniSeq高通量测序,并对其全基因组特征、进化及重组特点进行分析。结果提示,4株CV-B5天津分离株的全基因组核苷酸和氨基酸序列同源性分别为84.5%~100.0%和98.1%~100.0%,与国内流行株的全基因组核苷酸序列同源性为83.2%~96.5%,氨基酸序列同源性为96.4%~99.4%。基于全基因组的系统进化分析将CV-B5流行株分为A-D四个基因型,其中天津与国内流行株均属于C基因型。C基因型进一步分为3个进化分支,而天津分离株处在两个不同的分支上。基于基因组各区段序列的系统进化与SimPlot重组分析结果显示,天津分离株15-39N、15-41N与埃可病毒30型(Echovirus 30,E-30)原型株在P3区3B、3C、3D区域均检测到重组信号。本研究有助于了解CV-B5的全基因组特点和重组规律,为相关疾病的防控提供依据。