柯赫法则在橘子罐头商业无菌检验中的应用

参照国家标准对一批出现胖听和泄漏的橘子罐头进行商业无菌检验,接种酸性肉汤和麦芽浸膏汤均未见微生物生长,无法判断是否为非商业无菌。根据柯赫法则的原理,将胖听罐的汤汁接种到正常的糖水橘子汤汁中,汤汁产气变浑浊,经分离鉴定为酿酒酵母。研究表明,柯赫法则可以成功应用于罐头商业无菌检验,解决现行标准不能检测的难题。

浙江省香椿溃疡病病原菌的分离和鉴定

[目的]分离和鉴定引起浙江省香椿溃疡病的病原菌,揭示香椿溃疡病的病因,为该病害的科学防控提供理论依据。[方法]观察香椿溃疡病的田间症状,使用常规组织分离法分离病原菌,利用形态学结合分子生物学方法对病原菌进行物种鉴定,采用柯赫氏法则验证分离菌株的致病性。[结果]1)从感病香椿样品中分离到2株病原菌;病原菌的培养性状、有性世代和无性世代的形态特征与假毛丛赤壳菌一致。2) LSU rDNA、ITS rDNA和tef1-α基因序列分析以及多基因系统发育分析表明,XCKY2菌株的LSU rDNA、ITS rDNA和tef1-α基因片段与假毛丛赤壳菌的同源性均为100.00%;XCKY1和XCKY2菌株与11株假毛丛赤壳菌聚为一支,贝叶斯后验概率为0.94。3)致病性测定结果表明,假毛丛赤壳菌的菌饼和分生孢子悬浮液均能引起健康香椿苗发病,从发病香椿苗组织中也能再分离到假毛丛赤壳菌,由此确定假毛丛赤壳菌为香椿溃疡病的病原菌。[结论]从浙江省感病香椿样品上分离到2株假毛丛赤壳菌,经鉴定为引起香椿溃疡病的病原菌。本研究首次报道假毛丛赤壳菌是香椿溃疡病病原菌。

湖南省道县水稻叶条斑病病原菌分离与鉴定

【目的】2023年6月在湖南省永州市道县仙子脚镇多个村的水稻上发现一种叶条斑病,发生面积超过30 hm^(2),为探究发病原因,开展相关研究。【方法】利用组织分离法对道县采集的水稻病叶进行病原菌分离,对分离到的病菌进行形态学观察,结合ITS、TEF1-α和TUB2基因序列联合建树,确定病原物,利用柯赫氏法则进行病原物验证。【结果】湖南省永州市道县仙子脚镇发生的水稻叶条斑病病原菌为稻黑孢(Nigrospora oryzae)。【结论】明确了湖南省道县水稻叶条斑病的病原菌,为今后防控工作的开展提供参考。

铁皇冠炭疽病病原鉴定及室内药剂筛选

为明确引起广东省肇庆市高要区铁皇冠炭疽病的病原种类并筛选出具有较好防治效果的药剂,采用组织分离法对铁皇冠炭疽病病原菌进行了分离纯化;结合形态学观察、多基因系统发育分析及柯赫氏法则对该病原菌进行了分类鉴定。同时采用菌丝生长速率法,选用42.4%唑醚氟酰胺WG、75%肟菌·戊唑醇WG、35%400g/L氟菌·戊唑醇SC、325 g/L苯甲·嘧菌酯SC、60%唑醚·代森联WG、10%苯醚甲环唑WG对该炭疽菌的室内毒力进行测定。结果显示,引起铁皇冠炭疽病的病原菌为果生炭疽菌(Colletotrichum fructicola),供试的6种杀菌剂对C.fructicola的菌丝生长均有一定的抑制作用,其中10%苯醚甲环唑水分散粒剂的抑制活性最强,其次为325 g/L苯甲·嘧菌酯悬浮剂、75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂,以上3种杀菌剂均可推荐为田间防控药剂。

澳洲坚果叶部病害病原菌鉴定及其生防菌筛选

【目的】澳洲坚果是云南省德宏傣族景颇族自治州(简称为“德宏州”)的百姓为脱贫致富而种植的重要木本油料树种,集约化种植使其植株叶枯病严重发生。为了明确澳洲坚果叶部病害病原菌的种类并筛选有效生防菌,为澳洲坚果叶枯病的绿色防控和澳洲坚果的产业化发展提供理论支持。【方法】对云南省德宏州潞西市遮放镇拱岭村、三台山乡允欠村和风平镇帕底村澳洲坚果主要种植基地(即3个样地)内的叶枯病进行专题调查,将采集于此3个样地的病害样本进行分离培养,采用柯赫氏法则验证其致病性,结合生物学特征和多基因片段构建系统发育树,明确病原菌的分类与地位,并采用两点对峙法进行生防菌的筛选。【结果】遮放镇拱岭村、三台山乡允欠村和风平镇帕底村3个样地的发病率分别为60%、64%与69%,平均发病率为64.3%,说明3个样地的发病情况均较严重;其平均病情指数为32,说明3个样地的病情指数均较高。在实验室中共分离鉴定出病原真菌8属10种、生防菌1属1种。其中,DH06和DH10的分离频率分别为30.83%与24.17%,这2种菌株均被确定为优势病原菌;对其致病性的分析结果表明,这2种菌株均能使澳洲坚果叶片产生叶斑病症状,且其发病症状与野外的发病症状相同。所构建的系统进化树显示,DH06菌株被鉴定为污斑新拟盘多毛孢Neopestalotiopsis foedans,DH10菌株被鉴定为小孢拟盘多毛孢菌Pestalotiopsis microspora。平板对峙实验结果表明,由健康叶片上分离出的DH14对几种病原菌都有较好的拮抗作用,其平均抑菌率为60.56%,对其形态及分子的鉴定结果均表明,DH14菌株被鉴定为哈茨木霉Trichoderma harzianum。【结论】云南省德宏州澳洲坚果叶枯病与叶斑病的病原菌分别为污斑新拟盘多毛孢菌和小孢拟盘多毛孢菌,筛选出的生防菌为哈茨木霉,其对病原菌有显著的抑菌效果。

湖南省多花黄精炭疽病病原鉴定及其药剂筛选

【目的】自2017年以来,湖南省多花黄精上发生了一种叶部病害,为明确引起该病害的病原,拟筛选出适宜的防治药剂。【方法】利用组织分离法对病叶进行分离纯化,经形态学观察,基于rDNA内转录间隔区(ITS)、肌蛋白(ACT)、几丁质合成酶(CHS-1)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPDH)多基因的系统发育分析以及柯赫氏法则验证对病原菌进行鉴定。在此基础上通过菌丝生长速率法测定5种杀菌剂对该病原菌的室内毒力。【结果】通过组织分离法在湖南省4个多花黄精种植苗圃的带病黄精叶片上分离到16株形态一致的菌株,通过对菌株菌落形态和培养特征观察确认其为炭疽菌。对其中的菌株CLHJY4-3进行分子鉴定确定该病原菌为白蜡树炭疽菌(Colletotrichum spaethianum)。通过致病性测定,完成柯赫氏法则验证。该病原菌菌丝平均生长速率为1.1 cm/d。分生孢子长18.4~25.0μm,宽3.9~5.3μm;刚毛深褐色,具2~3隔,长79~107μm。室内毒力测定结果表明,在5种药剂中,咪鲜胺对该菌菌丝生长的抑制作用最强,EC 50为0.031μg/mL,其次为吡唑醚菌酯和戊唑醇,EC 50分别为0.049和0.252μg/mL。甲基硫菌灵和多菌灵的抑制作用相对较差,EC 50分别为2.911和1.763μg/mL。【结论】本研究确定了湖南多花黄精叶斑病为炭疽病,病原为白蜡树炭疽菌,并筛选到咪鲜胺和吡唑醚菌酯为对该病原菌抑菌效果较好的杀菌剂。

松萎蔫病病原的研究

为了探讨松萎蔫病与松材线虫的关系,笔者研制了一种简单试验装置"冷闸",使接种的线虫被隔离在松树接种枝内而不能迁移。用该装置进行接种试验的结果表明:在松材线虫被局限于接种枝内而不能移动到寄主其他部位的情况下,接种无菌松材线虫与致病荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens(GcM5-1A),以及该致病细菌体外培养的无细胞滤液,同样能诱发该病。该致病细菌又从接种无菌线虫和致病细菌后病死寄主中分离到并被鉴定,证明符合柯赫法则。致病荧光假单胞菌GcM5-1A体外培养的无细胞滤液接种试验结果说明,该致病菌株培养物中的内吸性毒素导致了寄主的萎蔫和死亡。由此,松萎蔫病经实验证实为首例由细菌和线虫互惠共生复合体引起的植物病害。

水飞蓟新病害——菌核病的鉴定及防治药剂筛选

【目的】对内蒙古呼伦贝尔市水飞蓟种植区的菌核病进行病原菌的分离与鉴定,明确不同化学药剂对水飞蓟菌核病的防治效果。【方法】采集水飞蓟菌核病病样进行病原菌分离纯化、柯赫氏法则验证、形态学和分子生物学鉴定;以40%菌核净可湿性粉剂、“普绿通”植物免疫增产蛋白、450 g/L咪鲜胺水乳剂、50%多菌灵可湿性粉剂为供试药剂,以清水为对照(CK),分析4种药剂对水飞蓟菌核病防治效果及产量的影响。【结果】共分离纯化得到15株菌株,NCBI Blast比对结果显示,分离菌株与核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary]相似度>99%。4种供试药剂均有效提高了水飞蓟的产量,防治效果为32.77%~53.78%,增产率为16.31%~37.05%。喷施2999 g/hm^(2)的“普绿通”植物免疫增产蛋白对水飞蓟菌核病的防治效果最好(防效为53.78%),增产效果较好(增产率为16.88%);喷施450 g/L咪鲜胺水乳剂防治效果较差(防效为32.77%),增产效果最好(增产率为37.05%)。【结论】4种供试药剂对水飞蓟均安全;喷施2999 g/hm^(2)的“普绿通”植物免疫增产蛋白防治效果最好、增产率较高,可以作为内蒙古呼伦贝尔市水飞蓟种植区防控水飞蓟菌核病的首选药剂。

广西金柑黑点病病原菌形态学及分子生物学鉴定

近年广西金柑黑点病发生呈逐年上升趋势,为鉴定广西金柑黑点病的病原,从广西阳朔县和融安县10年生金柑上采集黑点病组织样品,按柯赫法则获取病原,采用形态学方法对病原进行初步鉴定,然后采用rDNA-ITS系列分析技术及系统发育分析方法对其进一步鉴定。结果表明,金柑黑点病分离病原真菌为柑桔间座壳菌Diaporthe citri(无性态为Phomopsis citri)。

麻黄根腐病病原物的分离及鉴定

20 0 1年从宁夏麻黄基地采集麻黄根腐病病株样品 10份 ,按照柯赫氏法则对其进行了病原物的分离、纯化、致病性测定及菌株鉴定。结果表明 ,发病部位分离物中主要优势菌群为镰孢属 (Fusariumspp .)。分离物经致病性测定和复合接种试验发现 ,微胶镰孢Fusariumsubglutinans致病性最强 ,接种后发病株率达 6 0 %以上 ,尖孢镰孢F .oxysporum、半裸镰孢F .semitectum、茄镰孢蓝色变种F .solanivar.coeruleum和茄镰孢F .solani致病性弱 ,接种发病率为 10 %～ 2 0 % ,它们和微胶镰孢混合接种后的发病率均高于单独接种的发病率 ,其中微胶镰孢与含尖孢镰孢或半裸镰孢的组合接种发病率高于不含这 2种镰孢的组合。病株上获得的其它分离物均无致病性。证实麻黄根腐病是以微胶镰孢为主要病原 ,并由尖孢镰孢。

核桃溃疡病症状及其病原菌鉴定

【目的】明确中国陕南地区核桃树溃疡病成因。【方法】对陕西南部主要核桃产区的病害流行情况进行跟踪调查,从典型的枝干病灶组织中分离到了该病的致病菌,应用柯赫氏法则验证了该致病菌的致病性,同时根据形态学特征和ITS序列分析对病原菌进行鉴定,并利用BLAST软件将测序所得真菌ITS序列与NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库中已登录的序列进行同源序列比对,获得其分类地位,利用MEGA 5.0软件构建系统发育树。【结果】陕西南部核桃溃疡病的病原菌形态特征与葡萄座腔菌相符合,其ITS序列与已公布的葡萄座腔菌的ITS序列相似度为99.8%,系统发育树分析结果与之一致。【结论】陕西南部核桃溃疡病的病原菌为葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)。

烟草根黑腐病菌生物学特性的研究

烟草根黑腐病菌[Thielaviopsis basicola(Brek and Br)Ferraris]适于在多种自然培养基和合成培养基上生长和产孢,以藕-葡萄糖和 V_8培养基最佳,培养基中增加 Ca离子有利于菌丝生长和产孢。生长温度范围8—35℃,最佳生长温度24—28℃。此菌在PDA培养基上生长的pH范围3.5—9.5,最适pH5.0—6.5。内生分生孢子在20—30℃最适于萌发。碳、氮营养可促进孢子萌发,其中0.2%葡萄糖溶液最佳。黑暗条件下菌丝的生长和产孢好于光照条件。可有效利用多种碳、氮源,碳源以可溶性淀粉、麦芽糖、果糖、蔗糖、葡萄糖;氮源以谷氨酸、丙氨酸、天门酰胺利用最佳。其中可溶性淀粉、酒石酸铵、硝酸铵、氨基乙酸、谷氨酸有利于产孢。

烟草茎点病在贵州省的发生及病原鉴定

2016年7月笔者于贵州大学烟草实习基地及贵州省遵义市播州区乐山镇发现烟草茎点病。为明确其病原,从病区采集发病的烟株茎秆,镜检和分离培养发现病组织中均存在茎点霉(Phoma);根据柯赫氏法则测定其致病性,结果表明该病菌可引起伸根期和旺长期叶片及茎秆发病;研究该菌株的形态学、培养性状及rDNA-ITS、LSU这2个基因的部分序列,并构建系统发育树,初步断定引起烟草茎点病的病原菌为广生茎点霉(P.omnivirens)。

向日葵列当枯斑病病原菌的分离鉴定及致病力分化

为了获得向日葵列当生防菌株,以田间采集的具有褐色枯斑的列当植株为样本,利用柯赫氏法则对采自内蒙古、河北和新疆共11个不同地点的29份列当枯斑病的样本进行了分离和鉴定。结果表明,新疆北屯农十师183团和188团地块及呼和浩特市武川县西海子村地块中采集的病样上分离得到尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌;巴彦淖尔市乌拉特前旗西小召镇、五原县葵博园和临河区永利村的病样中分离得到尖孢镰刀菌和木贼镰刀菌;而乌兰察布市四子王旗公合成村和西圪旦村及化德县105省道边地块中样本中鉴定出尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、木贼镰刀菌和层出镰刀菌;鄂尔多斯市东胜区采集的样本中只分离得到尖孢镰刀菌;河北张家口市康保县的样本中只分离得到轮枝镰刀菌。上述分离得到的菌株在向日葵列当上回接后都能够致病的结果预示,镰刀属的真菌是引起向日葵列当枯斑病的病原菌,但尖孢镰刀菌是引起列当枯斑病的优势致病菌。致病力分化的研究结果表明,上述分离获得的镰刀菌均能够侵染向日葵和列当,但其致病力存在一定的差异,主要表现在分离寄主上的致病力强于其他寄主的特点。基于致病力分化的结果,筛选出3株具有生防潜力的尖孢镰刀菌菌株GHC 1-2、XXZ-9和HD 1-1用于防控列当对向日葵的寄生。

一株引起番茄果腐病病原菌的分离鉴定

番茄果实上的病害能引发叶片及果实腐败等多种症状,对番茄生产构成极大的威胁。实验从番茄病果上分离纯化得到病原菌株,命名为BC1402,其形态学特征与灰葡萄孢霉菌极其相似。根据柯赫式法则,用BC1402菌株对健康番茄进行侵染,测试致病力。结果表明,被侵染的番茄叶片和茎部发黄褐色、干软枯萎,证明菌株有致病力,与预期结果一致。CTAB法提取BC1402菌株的总DNA,并对rDNA-ITS序列进行PCR克隆,DNA电泳表明克隆结果为阳性。对BC1402进行系统发育树分析,结果表明该菌为灰葡萄孢霉菌(Botrytis cinerea)。

辣椒菌核病鉴定及药剂防治

从四川省双流县发病辣椒上分离得到菌核病菌株,通过病害田间症状病原菌形态特征、培养性状等研究,结合柯赫氏法则验证和分子生物学鉴定,证明分离得到的病原菌为核盘菌[Sclerotinia scleroriorum(Lib.)de Bary],属于核盘菌属。并筛选出可用于生产上防治辣椒菌核病的3种杀菌剂,防治效果在70%～86%之间。

水稻新病害——水稻褐变穗

依据柯赫氏法则,对水稻新病害——水稻褐变穗进行分离培养及病原菌鉴定,按照Ainsworth分类系统进行鉴定,确定分离得到的菌种是链格孢(Alternartaalternata(Fr.)Keissl),通过回接证明了水稻褐变穗确实是由链格孢引起的。水稻褐变穗的症状在水稻出穗后不久遇强风易发生,粒上出现褐色斑点,严重时变浓褐或黑褐色,病斑不规则形,但水稻叶鞘几乎没有褐变。

哈密瓜生长期果实腐烂病危害与防治

近年来 ,哈密瓜生长果实腐烂病猖獗 ,各瓜产区发生严重 ,据我们 1997、1998年在昌吉、五家渠 (一○三 ,一○二 ,一○五团 )等主要瓜产区田间调查发病率在 30 .3%～ 42 .89% ,严重时造成整株死亡 ,全田绝收。加之哈密瓜市场需求量增大 ,早播种、拱棚瓜面积的扩大 ,使该病的危害期延长 ,1998年该病在北疆各产区大流行。仅农六师一○三团由于该病危害造成商品率下降 2 0 % ,损失在 5 0 0× 10 4元以上。我们采用柯赫氏法则 ,确定了哈密瓜果实腐烂病致病细菌菌株。哈密瓜果实腐烂病在哈密瓜苗期和成株期均可发生危害 ,特别是在果实上危害造成损失更重。茎部发病呈水浸状病斑 ,后逐渐变为褐色 ,病部易开裂 ,田间湿度大时 ,茎节病斑有菌溢产生 ;叶片受害 ,可呈现出两种症状 ,一种是由叶缘开始侵染呈黄色水浸状 V字形病斑 ,逐渐向内延伸 ,另一种是在叶面上出现圆形或近圆形病斑 ,病部易开裂。严重时均可造成叶片上卷 ,甚至叶片枯死 ;瓜实上受害初为针尖大小圆形褐色病斑 ,后出现圆形褐色病 ,有时向下凹陷 ,病斑直径可达 0 .5～ 1.3cm,有时多个病斑连片 ,病斑可向果肉延伸直到瓜瓤 ,受浸染的瓜无商品价值 ,造成极大的产量损失。针对该病田间危害症状及室内致病菌研究 ,通过田间药剂筛选 ,确定了农用链霉素。

忍冬褐斑病病原菌鉴定及生物学特征分析

为了明确引起忍冬褐斑病的病原菌,为揭示该病害发病规律及生物有效防治提供理论依据,对引起忍冬褐斑病的致病菌进行分离,通过柯赫氏法则验证,结合形态学确定引起该病害的病原菌;然后在不同碳源、氮源、p H和光照条件下对病原菌菌丝生长速率、产孢及孢子萌发相关生物学特征进行系统研究。结果表明,确定引起该病害的病原菌为多喙茎点霉(Phoma multirostrata),该病原菌的菌丝生长、产孢及孢子萌发等生物学特征在不同营养条件具有一定差异;以甘露醇为碳源时菌丝生长最快,以葡萄糖为碳源时产孢量最大,孢子萌发的最适碳源为果糖,菌丝生长的最适氮源是硝酸钠,以硫酸铵为氮源时产孢量和孢子萌发率均最高;菌丝生长最适p H值为5,产孢量和孢子萌发最适p H值为6~8;最适病原菌生长、产孢和萌发的光照条件是全光照。