苹果柱型基因Co的一个AFLP标记的SCAR转换

将苹果柱型基因的一个AFLP标记成功地转换成了简单实用的SCAR标记。首先对AFLP标记片段进行序列测定 ,然后根据序列特点设计了两对特异引物CoA1/CoA2 和CoA1/CoA3 ,每条引物长 2 0bp。PCR结果表明CoA1/CoA2 可以扩增出 2 16bp和 148bp两条带 ,其中 2 16bp的为柱型性状的特征带 ;CoA1/CoA3 可以扩增出 2 73bp和 2 0 5bp的两条带 ,其中 2 73bp的为柱型性状的特征带。两对引物在杂交后代中扩增出的特征带与柱型性状的分离重组率都很低 (CoA1/CoA2 为 6 .3%± 2 .5 % ;CoA1/CoA3 为 7.3%±2 .6 % ) ,所以它们都可以作为该SCAR标记的特异引物所用。

一个与苹果柱型基因Co连锁的RAPD标记

以短枝富士 spur-typeFuji ×舞姿 Telamon 的F1群体 共106株 为试材,利用RAPD技术,结合集群分类分析法,进行了苹果柱型基因 Co 连锁的分子标记研究.获得了与Co基因连锁的RAPD标记S1065-437.该标记与Co位点的连锁距离为8.66cM.

苹果柱型基因的ISSR分子标记研究

以普通型苹果品种‘富士’和柱型苹果‘舞姿’以及其杂交后代的柱型与非柱型实生苗为试材 ,建立了苹果的ISSR (Inter SimpleSquenceRepeatpolymorphicDNA)分子标记体系 ,并将ISSR标记用于苹果柱型基因Co的遗传分析。结果表明 ,在 2 0 μL反应体系中各组分的用量为TaqDNA聚合酶 1U、Mg2 + 的浓度为 2 5mmol·L-1 、模板DNA用量 2 0ng、引物浓度 0 2 μmol·L-1 及退火温度 52℃ ,80 %引物具有良好的扩增能力。调整模板DNA的用量、引物浓度及退火温度能够优化苹果ISSR -PCR扩增体系。从所筛选的 6 5个引物中获得了 35个ISSR标记 ,其中 33个标记呈现 1∶1分离 ,可用于苹果柱型基因的遗传分析。

与苹果柱型基因(Co)相关的AFLP标记片段的克隆

Co基因是与苹果树体生长习性有关的一个主基因，是培育树体紧凑型苹果品种的一个十分重要的基因资源，所以，Co基因分子标记的研究对苹果育种具有重要价值。用PCR的方法将以短枝富士×舞姿的F1分离群体为试材筛选到的一个与Co基因连锁较为紧密的AFLP标记成功地进行了再扩增，同时也实现了此标记片段的克隆和转化。这一研究结果对该AFLP标记向SCAR标记的转换具有重要意义。

苹果柱型基因(Co)一个SCAR标记的可靠性分析

以柱型苹果品种、常规栽培品种及二者的杂交分离群体为试材 ,对在苹果柱型基因 (Co)的AFLP标记基础上构建的一个SCAR标记进行分析。结果表明该SCAR标记对苹果柱型性状检测的准确率在90 %以上 。

苹果柱型基因RAPD标记的克隆及序列分析

以苹果"SpurFuji"×"Telamon"杂交组合的F1为试验材料,采用RAPD技术结合BSA法,对200条10bp随机引物进行筛选,获得了一个与苹果柱型基因连锁距离为8.57cM的标记S1065437,将其片段回收纯化,连接于pUCm-T载体上,并转化进大肠杆菌。酶切克隆质粒表明克隆片段大小正确。然后,通过测序获得此标记片段的全序列(其长度为437bp)。用WinGene、DNASTAR软件对该片段的酶切位点和序列特征进行了分析。结果表明此片段不含开放阅读框架,不具有基因结构。该标记的GenBank登录号为AY335183。

苹果柱型性状的SRAP分析

为了更深入研究苹果柱型基因,为苹果树型性状改良奠定基础,以舞姿与富士杂交的F1代群体为材料,利用SRAP分子标记技术与BSA法相结合的方法分析了苹果柱型性状。筛选出了1对SRAP引物组合M10E4,其在柱型池与普通型池间表现出分离,分离片段约为310bp。选用柱型与普通型的极端类型进行验证,柱型群体中多数单株都出现此片段,有2株出现交换,普通型群体中有3株出现交换,交换率为7.14%,用Mapmaker/Exp3.0软件对标记与目标性状进行连锁分析,测算遗传距离为7.7cM,并将此标记命名为M10E4-310。研究结果表明,利用SRAP技术初步找到了与柱型基因连锁较紧密的标记位点。

利用cDNA-AFLP技术研究苹果柱型与非柱型cDNA的差异表达

以苹果(Malus×domesticaBorkh.)柱型品种舞姿、非柱型品种富士及其杂交F1群体中柱型、非柱型单株为研究试材,应用cDNA-AFLP(cDNA-amplified fragment length polymorphism)技术,研究柱型与非柱型苹果cDNA的差异表达,探讨了苹果柱型基因Co表达的分子机制。通过64对引物组合的cDNA-AFLP分析获得了1630条在柱型与非柱型苹果中差异表达的片段。经过BSA(bulked segregant analysis)分析和反向Northern杂交鉴定,获得了11个差异表达的cDNA片段,并进行了克隆、测序和序列同源性检索分析。有5个片段在GenBank数据库中发现同源序列,其余的6个功能未知。核酸和氨基酸比对分析中同源性最高的是片段A7和A16。A7的核苷酸序列同源于红叶石楠Photinia fraseri26S核糖体RNA(97%)、蛋白同源于玉米的细胞色素P450单加氧酶(91%),A16的核苷酸(85%)及蛋白(93%)同源于直果草属Triphysaria versicolor的α-expansin2基因。对A7、A16两个候选基因片段再进行正向Northern杂交验证,在富士中表达最强,在非柱型后代、柱型后代及舞姿中表达依次减弱。由此推断,由细胞色素P450单加氧酶基因所调控的赤霉素GAS变化影响了苹果柱型性状的表达。

改良Chelex-100快速提取白色念珠菌DNA作为PCR扩增模板方法

目的:旨在找到一种快速简便提取白色念珠菌DNA的方法。方法:用改良Chelex-100法和离心柱型酵母基因组DNA提取试剂盒分别提取白色念珠菌DNA,对提取结果进行了紫外分光光度比较及聚合酶链式反应的比较鉴定,且对两种方法提取的DNA保存1月、2月、4月后,经聚合酶链式反应比较稳定性有无差异。结果:用改良Chelex-100法提取的白色念珠菌基因组DNA纯度低于离心柱型酵母基因组DNA提取试剂盒法,差异有统计学意义(=0.000),而两种方法提取DNA的浓度差异无统计学意义(=0.241)。经聚合酶链式反应鉴定,两种方法均可得到明亮、清晰的特异性扩增条带,且DNA经过1月、2月、4月保存后聚合酶链式反应无差异。结论:改良Chelex-100可满足白色念珠菌PCR特异性扩增的需要,具有灵敏、快速、简便、经济的优点,适合白色念珠菌的普查性检出。