MiR-155靶向talin-1基因调控柱状黄杆菌胞外多糖诱导的EPC细胞凋亡

为研究miR-155在柱状黄杆菌胞外多糖(FC-EPS)诱导的细胞凋亡中的作用机制,本实验采用RNA干扰(RNAi)技术,通过过表达miR-155和敲降踝蛋白基因(talin-1),皆能抑制FC-EPS诱导的细胞凋亡,并鉴定出talin-1为miR-155的靶蛋白。在FC-EPS诱导细胞凋亡的过程中,踝蛋白水平显著升高,在凋亡发生阶段检测到凋亡执行蛋白Caspase-3的活化,同时检测到2条踝蛋白剪切异构体,大小分别约为200 ku和250 ku;将构建的鲤Talin-1真核表达质粒转染鲤上皮瘤细胞(EPC),过表达的Talin-1延迟且延长了细胞凋亡的进程,并检测到上述2条踝蛋白异构体。然而,当以FC-EPS转染EPC细胞时,Talin-1先下降再恢复到正常水平,细胞不发生凋亡。因此,在FC-EPS诱导细胞凋亡的过程中,细胞通过上调miR-155来调控靶基因talin-1 mRNA和蛋白转录的变化,以及产生Talin-1蛋白异构体来抑制细胞发生凋亡。本研究为有效防治柱状黄杆菌疾病提供新思路。

笋壳鱼源柱状黄杆菌的分离鉴定及致病性和药物敏感性

【目的】明确2022年5月广东省珠海市某养殖场笋壳鱼烂鳃病的病原,为防控笋壳鱼相关病害提供参考依据。【方法】从患病笋壳鱼的腐烂鳃丝、肾脏和体表病灶等部位分离细菌,并纯化优势菌落,通过PCR方法扩增分离菌株的16S rRNA序列并进行测序分析,同时构建该基因的系统发育进化树,鉴定患病笋壳鱼的病原菌。选取代表菌株Om2202进行毒力基因检测和斑马鱼人工感染试验。测定中草药和消毒剂对分离菌株Om2202的抑菌和杀菌活性,分析菌株Om2202的致病性和药物敏感性。【结果】从患病鱼鳃部和肾脏分离到的优势菌落呈细长的弯曲或直杆状,菌体表面未见鞭毛和菌毛,有荚膜,有胞外分泌物;通过特异性PCR检测和16S rRNA序列的系统发育进化树分析,结合菌落形态分析结果,确定分离菌株Om2202为柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)。毒力基因检测结果显示,菌株Om2202携带gldD、hly、cslA、ompA和chiA等11种毒力相关基因。斑马鱼致病性试验结果显示,菌株Om2202对斑马鱼具有较强致病性,其LC50为7.50×106 CFU/mL。药物敏感性试验结果显示,Om2202菌株对芦荟大黄素、大黄素和苯扎溴铵等药物敏感,对连翘精油、二氧化氯、蛋氨酸碘和过氧化钙等药物不敏感。【结论】引起笋壳鱼烂鳃的主要致病菌为柱状黄杆菌,属于广泛流行的基因Ⅱ型菌株,且携带大量的毒力相关基因,对斑马鱼具有较强的致病性,可用芦荟大黄素、大黄素和苯扎溴铵等药物进行防控。

柱状黄杆菌弱毒株和车轮虫混合感染致金鱼烂鳃病的病原分析

【目的】确诊北京地区某养殖场金鱼发生烂鳃病的病原。【方法】采集具有临床症状的濒死金鱼,制作鳃组织的水浸片进行寄生虫和真菌观察,取肝脏、肾脏、脾脏、鳃组织开展金鱼造血器官坏死病病毒(GFHNV)检测。同时,从鳃上分离病原菌,分析病原菌的形态特征、理化特性、分类地位及药物敏感性等特性;采取鳃组织划痕浸泡和未划痕浸泡方式开展病原菌的人工感染试验。【结果】自然发病鱼鳃丝上有少量车轮虫寄生,未观察到真菌菌丝,GFHNV核酸检测呈阴性。从鳃组织分离到大量假根状菌落,该菌株为革兰染色阴性长杆菌,菌体大小(0.5~0.7)μm×(4~8)μm,氧化酶、过氧化氢酶阳性,降解明胶和硫酸软骨素,产生硫化氢,不发酵葡萄糖等糖醇类,基于16S rDNA序列构建的进化树与柱状黄杆菌聚为一枝,确认分离菌为柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare),基因型Ⅰ型。划痕浸泡的各组金鱼均出现死亡,症状与自然发病鱼相似,划痕对照组和未划痕浸泡组均未出现死亡,经计算该菌对金鱼的半数致死量(LD 50)为8.8×10^(6) CFU,为弱毒株。该菌对恩诺沙星、盐酸多西环素和磺胺类药物敏感,而对试验的其他抗菌药物不敏感。【结论】本研究分离的柱状黄杆菌弱毒株可造成鳃组织破损金鱼的死亡,结合实践生产中许多金鱼感染少量车轮虫造成鳃组织破损但未出现发病死亡的病例,确定这起慢性、低死亡率的金鱼烂鳃病是由车轮虫和柱状黄杆菌弱毒株混合感染所致,而继发感染的柱状黄杆菌弱毒株是造成金鱼死亡的主要原因。

鱼胆草多糖的提取及其对柱状黄杆菌抑制活性研究

通过正交试验优化鱼胆草多糖提取工艺,考察鱼胆草多糖对柱状黄杆菌抑制活性。鱼胆草多糖最佳提取工艺为提取温度为80℃,提取时间60 min,料液比为1∶50,醇沉体积分数为75%时提取效果最佳。鱼胆草多糖对柱状黄杆菌表现出较好的抑制清除效果,MIC为12.5 mg/mL。该工艺简单稳定,鱼胆草多糖抑制柱状黄杆菌明显,为该资源的进一步开发提供了研究基础。

我国淡水鱼类柱形病病原菌柱状黄杆菌的遗传多样性

为认识我国淡水鱼类烂鳃病的病原以及柱形病在我国的发生情况,实验从发生烂鳃病的病鱼中分离细菌性病原,经过生理生化特性分析以及是否在含托普霉素的Shieh培养基中生长并形成黄色假根状菌落,是否产生降解明胶和硫酸软骨素的酶类等特性的鉴定,并结合16SrDNA序列分析,证实柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)是所分离的烂鳃病的病原。同时,研究也证实20世纪曾经命名为烂鳃(Gill-rot)病病原的鱼害黏球菌(Myxococcus piscicola Lu,Nie & Ko,1975)是柱状黄杆菌的同物异名。利用分离到的16株柱状黄杆菌的16SrDNA序列,以及已经发表的柱状黄杆菌的相关序列,构建了系统发育树,发现柱状黄杆菌的菌株聚成3枝,与柱状黄杆菌的三种基因组型(Genomovar)相对应。其中当时命名为鱼害黏球菌的强毒株G4与分别分离自日本和美国的两株聚为一枝。另外两枝包括的菌株较多,它们中的一些菌株来源于相同的鱼类宿主,如鲤形目的种类;但是,这两枝也包括一些特有的株,如从欧洲和美国的鲑形目鱼类上分离的柱状黄杆菌聚为一枝,这一枝还包括我国曾经命名为鱼害黏球菌的G18弱毒株。从我国隶属于鲈形目的鳜鱼和鲟形目的中华鲟上分离到的柱状黄杆菌则聚为另外一枝。作者认为对不同基因组型菌株的致病性和致病机理的研究将可能从根本上认识鱼类柱形病的流行规律。

福尔马林灭活柱状黄杆菌对草鱼免疫相关基因表达的影响

在本研究中,将福尔马林灭活的柱状黄杆菌菌苗(FKG4)经腹腔注射免疫草鱼,以注射灭菌PBS作对照,分别在免疫后1、7、15和28d,提取受免鱼和对照鱼肝脏、脾脏和头肾3种组织中的总RNA并反转录成cDNA,利用Real-time PCR方法对不同组织中C-反应蛋白(CRP)、主要组织相容性复合体I(MHCⅠ)、肿瘤坏死因子(TNFα)、白介素1(IL-1β)、白介素8(IL-8)、Ⅰ型干扰素(IFNⅠ)等6种免疫相关基因的表达进行定量分析。结果发现CRP在受免鱼肝脏中的表达于免疫后1、7d显著高于对照鱼,而在脾脏与头肾中的表达未出现显著差异;MHCⅠ在受免鱼3种组织中的表达于免疫后1、7、15d都显著高于对照鱼;TNFα在3种组织中的表达水平都较低,但都于免疫后1、7d显著高于对照鱼;IL-1β在3种组织中的表达于免疫后1d都显著高于对照鱼,但只有在头肾中的表达在免疫后7d时仍保持显著差异;IL-8在3种组织中的表达都只是于免疫后1d显著高于对照鱼;TNFα、IL-1β及IL-8等3种炎症因子的基因表达在免疫后15d都恢复到对照鱼的水平;而IFNⅠ在3种组织中的表达与对照组之间未出现显著差异。结果表明,FKG4注射免疫可以显著提高草鱼3种组织中与抗菌免疫相关的基因表达,从而增强鱼体抵抗细菌性病原的免疫力。

斑点叉尾鮰烂鳃病病原柱状黄杆菌的分离及鉴定

[目的]对从斑点叉尾鮰烂鳃病中分离的病原菌进行分类学地位鉴定。[方法]采用人工感染确定其病原性,常规生理生化鉴定和16SrRNA基因序列分析方法进行分析。[结果]该菌株为革兰氏阴性杆菌,滑行运动,无鞭毛,菌体大小为(0.3～0.5)μm×(5～10)μm,过氧化氢酶反应阳性,不能发酵和利用葡萄糖等多糖,不水解酪氨酸,不产生吲哚。所测16SrRNA基因序列经BLAST分析表明,与GeneBank上登录的柱状黄杆菌的16SrRNA序列同源性最高,其相似性达98.2%。基于16SrRNA基因序列构建的系统进化树表明,菌株GHS061212与柱状黄杆菌(AY841899)聚为1个分支,且置信度较高,为71.0%。[结论]菌株GHS061212被鉴定为柱状黄杆菌,这是国内首次报道斑点叉尾鮰烂鳃病病原为柱状黄杆菌。

柱状黄杆菌部分生物学特性的研究

采用革兰氏染色法、比色法和平板扩散法对柱状黄杆菌Flavobacterium columnare的部分生物学特性进行了研究。结果表明:用肉汤培养柱状黄杆菌24 h时,其形态多样,如半圆形、U型、V型或S型等;培养48 h时,柱状黄杆菌中开始出现颗粒状老龄培养物;培养72 h时,有部分菌体发生的"分节"现象,而老龄培养物也增多。用肉汤培养时,该菌的最佳生长条件分别是NaCl浓度为2.0 g/L,pH为7.4,温度为25～28℃。在最佳培养条件下,该菌的胞外产物具有蛋白酶、脂酶和卵磷脂酶活性,然而却检测不到淀粉酶、明胶酶和脲酶活性。

柱状黄杆菌双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为快速检测柱状黄杆菌,本研究以纯化的柱状黄杆菌单克隆抗体为捕获抗体,以多克隆抗体为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测法。最佳的方案为用0.08μg/孔纯化的单克隆抗体4℃包被过夜,30g/L牛血清白蛋白37℃封闭90min,多克隆抗体的工作浓度为0.11μg/孔,检测抗原、多克隆抗体、酶标抗体均为37℃作用1h,显色15min后终止反应,当D492nm值≥0.776且P/N≥2.1时判定为阳性。该方法特异性强,与迟钝爱德华氏菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌等水产病原菌均无交叉反应。最低检测剂量为1×103 CFU。本研究首次建立了检测柱状黄杆菌的双抗体夹心ELISA方法,经验证该方法特异性强、灵敏度高。

柱状黄杆菌间接ELISA快速检测方法的研究

应用间接酶联免疫吸附试验(Indirect-ELISA)技术,建立了快速检测柱状黄杆菌的方法。结果显示:根据棋盘试验,确定最佳抗原包被浓度和免疫血清最佳工作浓度分别为1×106cfu/mL和1∶5000,酶标抗体最佳工作浓度为1∶10000。在该条件下,所建立的间接ELISA能检测出5×104cfu/mL的柱状黄杆菌,且与爱德华氏菌、哈维氏菌弧菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌等常见鱼类致病菌无交叉反应。结果表明,所建立的间接ELISA可不经细菌培养而直接检测人工感染后草鱼鳃组织中的柱状黄杆菌,该方法对柱状黄杆菌的检测具有快速、敏感、特异、实用的优点。

安吉白茶对柱状黄杆菌抑菌机理的研究

为探讨安吉白茶对柱状黄杆菌的抑菌机理,本试验通过测定安吉白茶提取液与细菌作用前后培养液电导率和紫外吸收物的变化,以及菌体磷代谢和可溶糖的变化,初步阐明了安吉白茶对柱状黄杆菌的抑菌机理。研究结果显示,经安吉白茶提取液处理后,细菌培养液的电导率和可溶糖浓度均增大,菌悬液中的紫外吸收物也随作用时间的延长而增加,表明安吉白茶提取液可破坏细胞膜的结构、导致细胞通透性增加,进而使细胞内容物外泄。此外,经安吉白茶处理后的柱状黄杆菌对磷的消耗量降低,以致严重影响了核酸、磷脂等细胞重要成分的合成及能量代谢,导致细菌正常生理功能的丧失。结果表明,安吉白茶可通过破坏菌体细胞膜及干扰磷代谢等途径抑制柱状黄杆菌的生长。

大鲵柱状黄杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR诊断试剂盒的研制

根据Gen Bank中柱状黄杆菌16S r RNA序列,设计1对特异性引物,PCR扩增获得16S r RNA基因片段,并克隆到p MD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR Green I荧光定量PCR反应条件的优化,建立了黄杆菌的SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法 ,以此为基础研制试剂盒。试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,对嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、迟缓爱德华、弗氏柠檬酸杆菌均无阳性信号扩增,重复性好,灵敏度可达12拷贝/μL。结果表明,研制的柱状黄杆菌SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒具有特异、灵敏、快速、重复性好等特征,适合于大鲵临床样品的检测。

黄颡鱼源柱状黄杆菌的分离鉴定及其对翘嘴鳜的致病性

从患病黄颡鱼上分离出1株柱状黄杆菌(Pf1),对其进行分类鉴定和药物敏感试验。用Pf1感染黄颡鱼和翘嘴鳜,发现Pf1对2种鱼均有致病性。Pf1可导致翘嘴鳜多个组织细胞坏死和炎症反应,严重损伤肝、体肾和鳃。被感染翘嘴鳜肝细胞肿胀、空泡化坏死;肾小管广泛坏死和大量炎症细胞浸润;鳃小片毛细血管充血,呼吸上皮细胞肿胀变性,鳃的呼吸功能衰退。鳃部病变导致感染鳜呼吸频率加快、游动缓慢,最后大量死亡。

柱状黄杆菌胞外多糖对草鱼的免疫促进作用

将柱状黄杆菌胞外多糖(EPS)溶液经腹腔注射免疫草鱼,以注射灭菌生理盐水作对照。免疫一周后,分别提取受免鱼与对照鱼肝脏、脾脏、体肾和头肾4种组织中的总RNA,并通过RT-PCR半定量的方法检测不同组织中C-反应蛋白(CRP)、白介素1(IL-1)、主要组织相容性复合体I(MHC I)、免疫球蛋白M(IgM)、干扰素(IFN)等5种免疫基因的表达情况。结果显示,CRP在受免鱼肝脏中的表达显著上升;MHC I在受免鱼脾脏、体肾中的表达显著下降;IgM在受免鱼4种组织中的表达皆显著上升;IL-1在受免鱼4种组织中的表达与对照组没有显著差异;无论受免组还是对照组都只能检测到微弱的IFN表达,且两组之间没有显著差异。结果表明,柱状黄杆菌EPS对草鱼的先天免疫能力以及特异性体液免疫能力具有促进作用。

柱状黄杆菌对草鱼TLRs基因表达水平的影响

用柱状黄杆菌Flavobacterium columnare G4株感染草鱼Ctenopharyngodon idella,分别在感染1、4、7 d后提取感染组和对照组草鱼鳃、脾脏、肝脏、肠道和头肾5种组织的总RNA,并采用半定量RT-PCR方法检测不同组织中Toll样受体3(TLR3)、Toll样受体7(TLR7)和Toll样受体22(TLR22)3个抗病毒免疫基因的表达变化。结果表明:注射柱状黄杆菌7 d后,TLR3在草鱼鳃、肝脏、肠道和头肾4种组织中的表达显著上调(P<0.05);注射柱状黄杆菌4 d和7 d后,TLR7和TLR22在5种组织中的表达均显著上调(P<0.05);而注射柱状黄杆菌1 d后,TLR22在鳃、脾脏和肝脏组织中的相对表达量就显著上调(P<0.05)。研究表明,TLR3、TLR7和TLR22基因在机体应对细菌感染的免疫反应过程中发挥着重要的作用。

柱状黄杆菌强毒株和弱毒株胞外蛋白中差异蛋白的初步鉴定

柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)是一种世界范围的水产动物致病菌,是中国重要养殖鱼类草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鳜(Siniperca chuatsi)等烂鳃病的病原。本研究以1972年从患"烂鳃病"草鱼上分离的两株冻干柱状黄杆菌G4和G18菌株为研究对象,并将G4株再次分离纯化得纯化菌株,命名为G4R3。对草鱼鱼苗浸泡攻毒结果显示,G4R3的LD50至少比G18的高3个数量级,因此G4R3为"强毒株",G18为"弱毒株"。利用蛋白质组学方法分析柱状黄杆菌强毒株G4R3和弱毒株G18的胞外蛋白,经过双向电泳并结合图像分析,共发现了34个点是差异表达的蛋白。胶内酶解、肽质量指纹图谱和串联质谱分析后,鉴定出其中的7个蛋白点,代表滑动蛋白K、腺酐甲硫氨酸合成酶和一种可能的膜蛋白等3种蛋白,它们可能是柱状黄杆菌的毒力因子。

抗柱状黄杆菌多克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定

为制备抗柱状黄杆菌多克隆抗体,本研究利用颗粒性抗原免疫新西兰白兔,收集的抗血清通过辛酸-硫酸铵法纯化,采用间接ELISA法检测纯化后多克隆抗体的效价和交叉反应性。结果显示,制备的多克隆抗体蛋白质浓度为29.28mg/mL,效价在1∶6.4×104以上,与迟钝爱德华氏菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌及哈维氏弧菌等水生动物致病菌均无交叉反应。本研究成功建立了抗柱状黄杆菌多克隆抗体的制备方法,可用于柱状黄杆菌的快速检测。

柱状黄杆菌外膜蛋白的比较蛋白质组学研究

为了鉴定柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)的毒力相关因子,利用蛋白质组学方法分析了强毒株G4R3和弱毒株G18的外膜蛋白。双向电泳结合图像分析,共发现了8个差异表达的蛋白点。经过胶内酶解和质谱分析,其中的1个蛋白点被鉴定为LemA蛋白,它可能是柱状黄杆菌的一种毒力因子。

柱状黄杆菌乙酰辅酶A合成酶基因及其上游调控序列分析

柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)是世界范围内危害淡水鱼类的柱形病的病原。目前对该病原菌遗传操作系统的研究进展较慢,而寻找高效稳定的启动子来调控外源基因在细菌体内的表达,有可能促进该细菌遗传操作系统的构建。本研究获得了柱状黄杆菌乙酰辅酶A合成酶基因(acetyl-coenzyme A synthetase gene,acs)的编码序列及其上游调控序列,该基因全长2 323 bp,编码635个氨基酸。通过序列分析,发现在该基因起始密码子ATG的上游存在核糖体结合位点(ribosome biding site,RBS)序列TAAAA,和启动子–7和–33的保守基序TATTTTCG和TTG。将acs的上游调控序列(promoter sequence,Pacs)置于氯霉素抗性基因(chloramphenicol acetyltransferase,cat)的上游并导入柱状黄杆菌G4株后,cat基因得以表达,并使宿主细胞产生稳定的氯霉素抗性。通过5′RACE技术,确定了外源的cat基因和内源的acs基因的转录起始位点都是位于起始密码子上游46 bp处的T。通过删减分析调控序列Pacs,发现起始密码子上游164 bp的序列是保持启动子活性所必需的。通过分析和比对32个基因的核糖体结合位点区域,在起始密码子上游10 bp处发现了RBS保守基序TAAAA。

柱状黄杆菌胶体金免疫层析快速检测方法的建立

为建立一种通过胶体金免疫层析技术快速检测柱状黄杆菌的方法,试验采用柠檬酸三钠还原法制备粒径为20nm的胶体金颗粒,将其标记纯化的抗柱状黄杆菌单克隆抗体(McAb)制备出金标抗体结合垫。纯化的兔抗柱状黄杆菌多克隆抗体(PcAb)和羊抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜的检测线(T)与质控线(C)上,制备出胶体金免疫层析试纸条,并对试纸条的灵敏度、特异性及稳定性进行测定。结果显示,该试纸条检测灵敏度为1×103 CFU,检测时间为3.5min,制备的试纸条与迟钝爱德华氏菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌均无交叉反应,且稳定性好。本研究首次成功建立了柱状黄杆菌胶体金快速检测方法,所制备的试纸条具有灵敏、特异、稳定、快速等优点,可用于柱状黄杆菌的检测。