不同制备方式的柴胡—黄芩药对对流感病毒的体外抑制作用及其机制研究

目的比较不同制备方式的柴胡—黄芩药对对甲型H1N1流感病毒的体外抑制作用,进而筛选出最适制备方式并基于自噬途径探讨其潜在作用机制。方法以中药复方体外实验的三种常用方式制备柴胡—黄芩水提醇沉提取液、颗粒剂及含药血清,运用AlamarBlu■细胞毒性检测和神经氨酸酶活性检测法观察不同制备方式的抗病毒药效,并用非线性回归法计算不同制备方式的柴胡—黄芩药对对狗肾细胞株(Madin-Darby canine kidney,MDCK)的半数细胞毒性浓度(concentration of cytotoxicity 50%,CC50)、半数有效浓度(concentration for 50%of maximal effect,EC50)及选择性指数(selectirity index,SI)筛选出最适制备方式,并进一步采用免疫蛋白印记法检测自噬相关蛋白并探讨其对流感所致自噬的影响。结果柴胡—黄芩颗粒剂在0~1.56 mg/mL的浓度范围内对MDCK细胞的正常生长没有影响,存活率大于97%,且在此无毒范围内对甲型流感病毒神经氨酸酶活性具有一定的抑制作用,EC50为2.597 mg/mL,抗病毒选择指数为2。小鼠血清使细胞活力更强,细胞存活率高于100%,并与病毒感染组相比,对神经氨酸酶活性具有显著抑制作用(P<0.01)。免疫蛋白印记结果显示,与正常组相比,病毒感染组自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、beclin-1表达水平显著升高(P<0.01、P<0.05),p-mTOR蛋白表达水平显著下降(P<0.01)。与病毒感染组相比,柴胡—黄芩颗粒剂可以下调LC3-Ⅱ、beclin-1并上调p-mTOR蛋白表达水平(P<0.05、P>0.05、P<0.01)。结论柴胡—黄芩药对在一定浓度下具有抗病毒作用,其体外抑制作用最适制备方式为柴胡—黄芩颗粒剂,其机制可能为通过调节宿主细胞自噬而发挥抗病毒的作用。

HPLC法同时测定柴胡—黄芩药对水煎液中皂苷和黄酮类的含量

目的建立高效液相色谱测定柴胡—黄芩药对水煎液中皂苷和黄酮类含量的方法。方法采用MERCK PUROSPHERC18柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相:甲醇—0.05%磷酸,梯度洗脱;流速:1.0 mL.min-1;柱温:35℃;检测波长为210 nm。结果皂苷成分(柴胡皂苷a)、3个黄酮类成分(黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素)达到了完全分离,4个成分的峰面积与进样量线性关系良好。柴胡皂苷a、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素线性范围分别为0.219 6～17.568μg、0.214 75～17.18μg、0.093 1～7.448μg、0.107 6～8.608μg,(r≥0.999 8);平均回收率分别为97.71%、102.43%、101.16%、97.50%;RSD分别为0.52%、1.96%、1.55%、0.75%。结论该方法可同时测定柴胡—黄芩药对水煎液中皂苷和黄酮类成分的含量,并能有效表征水煎液中其他成分差别,也为建立柴胡—黄芩药对水煎液特征指纹图谱奠定了基础。

基于TLR4-NFκB信号通路的柴胡-黄芩药对抗肝纤维研究

目的:研究柴胡-黄芩药对抗肝纤维化大鼠肝脏TLR4-NFκB通路的影响。方法:采用饲喂高脂饲料,饮用10%乙醇及皮下注射四氯化碳(CCl4)的复合因素法建立大鼠肝纤维化模型,应用柴胡-黄芩药对进行干预,检测大鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、层黏蛋白(LN)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)的变化,通过HE染色、Mallory染色探讨肝组织病理变化,应用免疫组织化学方法检测肝脏Toll样受体4(TLR4)、核转录因子(Nuclear factor k B,NFκB)蛋白表达情况,揭示柴胡-黄芩药对抗肝纤维化的作用及可能机制。结果:肝纤维化模型大鼠血清中ALT、AST、HA、PCⅢ和Ⅳ-C的含量明显增高,肝组织纤维蛋白增生明显,并形成假小叶,模型组大鼠肝组织TLR4表达增高。柴胡-黄芩(9、18g生药/kg)干预后,血清中ALT、AST、HA、PCⅢ和Ⅳ-C的含量均有明显降低,肝组织纤维化病理改变有良好改善,肝组织TLR4、NFκB表达也明显下降。结论:柴胡-黄芩药对具有明确抗肝纤维化作用,其机制可能通过TLR4-NFκB信号通路调节,减轻炎症有关。